Fondo Integrativo Speciale per la Ricerca

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1 Ministeri dell Economia e delle Finanze, dell Istruzione, Università e Ricerca, dell Ambiente della Tutela del Territorio, delle Politiche Agricole e Forestali Fondo Integrativo Speciale per la Ricerca PROGRAMMA STRATEGICO: B) SVILUPPO SOSTENIBILE E CAMBIAMENTI CLIMATICI Progetto-Obiettivo: 1) Simulazioni, Diagnosi e Previsioni del Cambiamento Climatico Titolo del Progetto: Cambiamenti Climatici e Sistemi Produttivi Agricoli e Forestali: Impatto sulle Riserve di Carbonio e sulla Diversità Microbica del Suolo. Acronimo: SOILSINK Linea 3: Diversità genetica e funzionale dei microrganismi (Capofila Prof. Renato Fani) UO 04: Università di Firenze, Dipartimento di Scienza del Suolo e Nutrizione della Pianta, responsabile scientifico Prof. Giacomo Pietramellara. Partecipanti alla ricerca: Judith Ascher (assegno di ricerca), Giulia Guerri (dottorato di ricerca), Serena Caucci (borsista). Relazione sulle attività svolte nel 2 anno di attività (01/07/ /06/2008) Analisi della frazione non coltivabile delle popolazioni eubatteriche dei siti di Ancona e Sardegna mediante DGGE fingerprinting La seconda fase del progetto ha previsto l applicazione dell approccio molecolare (messo a punto nel primo anno sui campioni di ANCONA , Fig. 1,2,3,4), sui campioni di suolo di ANCONA , e SARDEGNA , per lo screening della microflora eubatterica al fine di valutare l effetto dell uso del suolo e del tipo di copertura vegetale sulla microflora del suolo a livello di comunità batteriche. In particolare l approccio molecolare elaborato a tale scopo ha previsto: - estrazione diretta dal suolo del DNA totale, tramite Fast DNA Kit for soil (BIO101, Inc.). - Analisi qualitativa e quantitativa mediante gel-elettroforesi e fluorimetro, rispettivamente. - 16S rdna-pcr-dgge (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) fingerprinting con l utilizzo di primers universali, specifici per gli eubatteri (GC 968f/1401r; Felske et al., 1997). - Analisi statistica dei DGGE fingerprints mediante Software Quantity One SW (Biorad). Utilizzato l UPGMA (Unweighted Pair Group Method Analysis), per CLUSTER ANALYSIS, basato sull indice di similarità DICE. Il protocollo più approfondito è descritto nella relazione del primo anno 2006/2007 1

2 Fig. 1. DNA totale estratto dai campioni di suolo (3 repliche, in doppio) per ogni tipo di trattamento (sodo 0, 90, arato 0, 90) di Ancona ( ). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl con 1 µl di BBF (6X). L elettroforesi è stata condotta a 120 V per 50 minuti. M: MassRuler TM DNA Ladder, Mix (10kb-80 bp). Fig. 2. Amplificazione 16S rdna-pcr del DNA totale estratto dai campioni in esame di Ancona ( ) mediante i primers universali GC 968f/1401r (amplicone di 473 bp, 3 repliche per ogni tipo di trattamento). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl di BBF (6X). L elettroforesi è stata condotta a 120 V per 50 minuti. M:MassRuler TM DNA Ladder, Mix (10kb,80bp). RESA DNA TOTALE µg g 1 suolo SODO_0 SODO_90 ARATO_0 ARATO_90 Fig. 3. Rese (µg g -1 suolo) di DNA totale estratto dai campioni di suolo di Ancona ( ) Fig. 4 Screening della microflora batterica nei suoli di Ancona ( ) mediante fingerprinting genetico (16S rdna-pcr-dgge) delle comunità eubatteriche. La DGGE è stata condotta su campioni di DNA totale estratti da 3 repliche per ogni trattamento (sodo 0, 90, arato 0, 90). 2

3 SITI DI CAMPIONAMENTO Nel secondo anno del progetto FISR (2007/2008) sono stati analizzati i seguenti campioni: 1) ANCONA (Agugliano): 2 campionamento, e 3 campionamento, (Fig. 5): Il campionamento è stato effettuato nella parte di campo coltivata con mais (parte A) e nella parte coltivata con frumento (parte B), ed ha riguardato per ciascun blocco, le seguenti parcelle: o Suolo lavorazione tradizionale T (ARATO) o Suolo lavorazione diretta S (SODO) o Suolo concimato (1; 90 unità azoto/ettaro) o Suolo non concimato (0; 0 unità azoto/ettaro) Sono stati prelevati tre campioni di suolo bulk (0-20 cm di topsoil), al centro e all estremità, per ogni parcella (Fig. 6). PARTE A PARTE B BLOCCO 1 BLOCCO 2 Fig. 5. Immagine campo Ancona (Agugliano) Fig. 6. Pianta lavorazioni del campo di Ancona 3

4 2) SARDEGNA: 1 campionamento, e 2 campionamento, (Fig. 8): o Vigneto inerbito (VI) o Sughereta (SU) o Erbaio (ER) o Pascolo (PA) o Vigneto lavorato (VL) o Vigneto abbandonato (VA): solo per il 2 campionamento Sono stati prelevati cinque campioni di suolo bulk (0-20 cm di topsoil), per ogni tipologia di suolo (Fig. 7). Fig. 7. Pianta dei campi in esame della Sardegna 4

5 Pascolo, 2 Maggio 2007 Pascolo, 22 Novembre 2007 Erbaio, 2 Maggio 2007 Erbaio, 22 Novembre 2007 Vigneto Lavorato, 2 Maggio 2007 Vigneto Lavorato, 22 Novembre 2007 Vigneto Inerbito, 2 Maggio 2007 Vigneto Inerbito, 22 Novembre 2007 Sughereta, 2 Maggio 2007 Sughereta, 22 Novembre 2007 Vigneto Abbandonato, 22 Novembre 2007 Fig. 8. Immagine suoli Sardegna (Berchidda) 5

6 RISULTATI a) ANALISI QUALITATIVE DEL DNA TOTALE E 16S rdna-pcr Il DNA direttamente estratto dai campioni di suolo di Ancona , (Fig. 9) e della Sardegna , (Fig. 11) è caratterizzato da un peso molecolare compreso tra 80 bp e superiore a10 kb, ed è risultato sufficientemente puro da essere amplificato mediante PCR. L amplificazione del DNA effettuata tramite l utilizzo dei primers GC968f/UNI1401r ha portato alla generazione di ampliconi di 473 bp (Fig. 10 e Fig. 12, Ancona e Sardegna, rispettivamente) bp 80 bp Fig.9. DNA totale estratto dai campioni di suolo per ogni tipo di trattamento (sodo 0, 90, arato 0, 90) di Ancona (sopra) e (sotto). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl con 1 µl di BBF (6X). L elettroforesi è stata condotta a 120 V per 50 minuti. M: MassRuler TM DNA Ladder, Mix (10kb-80 bp) bp 473 bp 80 bp bp 80 bp 473 bp Fig. 10. Amplificazione 16S rdna-pcr del DNA totale estratto dai campioni in esame di Ancona (sopra) e (sotto) mediante i primers universali GC 968f/1401r (amplicone di 473 bp). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl di BBF (6X). L elettroforesi è stata condotta a 120 V per 50 minuti. M:MassRuler TM DNA Ladder, Mix (10kb- 80bp). 6

7 bp 80 bp bp Fig. 11. DNA totale estratto dai campioni di suolo della SARDEGNA (sopra) e (sotto) delle varie tipologie di suolo: Vigneto inerbito VI, Sughereta SU, Pascolo PA, Erbaio ER, Vigneto lavorato VL. (Gel d agarosio 0.8%; DNA 5 µl, BBF 1 µl; 120 V, 50 min.; M MassRuler TM DNA Ladder Mix (10kb-80bp). 80 bp bp 473 bp 80 bp bp 473 bp 80 bp Fig. 12. Amplificazione 16S rdna-pcr del DNA totale estratto dai campioni di Sardegna (sopra) e (sotto) mediante i primers universali GC 968f/1401r (amplicone di 473bp). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl con 1 µl di BBF (6X); 120 V, 50 min.; M MassRuler TM DNA Ladder Mix (10kb-80bp). Tali amplificati 16S rdna-pcr sono stati analizzati mediante DGGE fingerprinting. In una prima analisi gli amplificati delle repliche per ogni parcella dei campioni di Ancona (Fig. 10), sono stati utilizzati separatamente. Successivamente gli ampliconi, sono stati riuniti per ciascun tipo di parcella all interno di ogni blocco e tra i due blocchi, ottenendo un campione rappresentativo per tipo di parcella (S0, S90, T0, T90 frumento; S0, S90, T0, T90 mais per entrambi i periodi di prelievo) (Fig. 13). Anche per i campioni della Sardegna gli amplificati delle cinque repliche per ciascun campo sono stati analizzati separatamente ed in una seconda analisi riuniti a dare un campione rappresentativo per tipologia di suolo (VI, SU, PA, ER, VL,VA per entrambi i periodi di prelievo) (Fig. 13). 7

8 ANCONA ANCONA FRUM EN TO M AIS FRUM ENTO M AIS C+ C- M 10 kb 473 bp 80 bp S A R D E G N A S A R D E G N A V I S U P A E R V L V I S U P A E R V L V A C + C - M 1 0 k b b p 8 0 b p Fig. 13. Controllo su gel di agarosio degli amplificati 16S rdna-pcr delle repliche riunite dei campioni di Ancona , (sopra) e Sardegna , (sotto). Il volume di DNA caricato su gel 0.8% agarosio è stato di 5 µl con 1 µl di BBF (6X); 120 V, 50 min.; M MassRuler TM DNA Ladder Mix (10kb-80bp). 8

9 b) ANALISI QUANTITATIVA DEL DNA TOTALE Le rese medie (Ancona n=3, Sardegna n=5) ottenute dall estrazione di DNA dai campioni in esame, sono riassunte nelle Tab. 1 e 2. Per quanto riguarda i campioni di Ancona (Tab. 1), tali valori, come è mostrato anche in Fig. 14 rivelano una differenza minima fra le quantità di DNA totale estratto dai vari campioni, ad eccezione della parcella di Sodo concimato (S90) coltivato con mais, del campionamento dove la resa di DNA è superiore rispetto agli altri campioni. Per i campioni della Sardegna (Tab. 2, Fig. 15) le rese di DNA sono generalmente maggiori per il primo campionamento rispetto al secondo. Per quest ultimo, si nota una differenza minima tra le varie tipologie di suolo, mentre per quanto riguarda il primo campionamento le quantità maggiori di DNA totale estratto si hanno per Pascolo e Sughereta, le rese vanno poi a diminuire per Vigneto Inerbito, Erbaio e Vigneto Lavorato. ANCONA FRUMENTO Rese medie DNA (µg g -1 di suolo) Campionamento blocco 1 1,6(±0,6) 2,6(±1,8) 1,6(±0,6) 2,4(±1,7) blocco 2 2,7(±0,6) 3,8(±1,6) 1,3(±0,2) 1,3(±0,6) blocco 1 4,0(±1,3) 6,0(±1,2) 2,3(±0,7) 2,2(±0,6) blocco 2 4,4(±1,7) 5,2(±0,8) 4,4(±1,5) 5,0(±0,5) ANCONA MAIS Rese medie DNA (µg g -1 di suolo) Campionamento blocco 1 3,5(±0,7) 1,6(±0,4) 1,5(±0,3) 1,1(±0,3) blocco 2 2,7(±0,6) 2,4(±1,7) 1,8(±0,6) 0,9(±0,4) blocco 1 7,0(±0,8) 14,4(±5,0) 1,5(±0,1) 0,9(±0,6) blocco 2 2,5(±0,5) 2,9(±0,2) 2,0(±0,9) 1,8(±0,3) Tab. 1: Rese medie del DNA (µg g -1 suolo) estratto dai suoli di Ancona in esame (n=3; tra le parentesi sono riportate le deviazioni standard). SARDEGNA Rese medie DNA (µg g-1 di suolo) Campionamento VI SU PA ER VL VA ,4(±0,9) 9,7(±3,0) 7,2(±1,7) 5,2(±0,7) 4,5(±1,0) ,7(±2,6) 2,0(±1,0) 2,0(±1,5) 2,3(±1,0) 2,0(±0,9) 0,4(±0,1) Tab. 2. Rese medie del DNA totale (µg g -1 suolo) estratto dai suoli di Sardegna in esame (n=5; tra le parentesi sono riportate le deviazioni standard). 9

10 25,0 Rese DNA totale frumento, Ancona ,0 Rese DNA totale mais, Ancona µg DNA /g suolo (n=3) 20,0 15,0 10,0 5,0 µg DNA/ g suolo (n=3) 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 blocco 1 blocco 2 0,0 blocco 1 blocco 2 25,0 Rese DNA totale frumento, Ancona ,0 Rese DNA totale m ais, Ancona µg DNA/ g suolo (n=3) 20,0 15,0 10,0 5,0 µg DNA /g suolo (n=3) 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 blocco 1 blocco 2 0,0 blocco 1 blocco 2 Fig. 14. Rese medie (µg g -1 suolo) di DNA totale estratto dai campioni di suolo di Ancona ( e ): Sodo 0, Sodo 90, Arato 0, Arato 90 (n=3; le barre indicano le deviazioni standard). 14,0 Rese DNA totale, Sardegna ,0 Rese DNA totale, Sardegna ,0 12,0 µg DNA/g suolo (n=5) 10,0 8,0 6,0 4,0 µg DNA/g suolo (n=5) 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 2,0 0,0 VI SU PA ER VL 0,0 VI SU PA ER VL VA Fig. 15. Rese medie (µg g -1 suolo) di DNA totale estratto dai campioni di suolo della Sardegna ( e ): Vigneto Inerbito (VI), Sughereta (SU), Pascolo (PA), Erbaio (ER), Vigneto Lavorato (VL) (n=5; le barre indicano le deviazioni standard). 10

11 c) 16S rdna-pcr-dgge PER LO STUDIO DELLE COMUNITA EUBATTERICHE Il DGGE fingerprinting (16S rdna-dgge) delle comunità eubatteriche ha generato patterns complessi e caratteristici per ogni suolo oggetto di studio. Le analisi dei 16S rdna PCR-DGGE fingerprinting sono state effettuate mediante Software Quantity One SW (Biorad), utilizzando l UPGMA (Unweighted Pair Group Method Analysis), per CLUSTER ANALYSIS, basato sull indice di similarità DICE, con formazione di un dendogramma che visualizza le similarità delle comunità eubatteriche tra i vari campioni. Sia per i suoli di Sardegna che per quelli di Ancona, lo screening delle comunità eubatteriche ha richiesto due tipi di analisi per meglio comprendere l effetto delle pratiche agricole, del tipo di pianta coltivata per Ancona; l effetto dell uso e della tipologia di suolo, del tipo di copertura vegetale per la Sardegna e del cambio di stagione per entrambi sulla microflora batterica. Per la prima analisi sui suoli di Ancona, sono state analizzate separatamente le repliche di ogni tipo di parcella dei due blocchi. Le DGGE hanno riguardato i campioni di mais e frumento, dei due periodi di prelievo separatamente (S0F, S90F, T0F, T90F blocco 1,2 Giugno - S0F, S90F, T0F, T90F blocco 1,2 Novembre - S0M, S90M, T0M, T90M blocco 1,2 Giugno - S0M, S90M, T0M, T90M blocco 1,2 Novembre) al fine di valutare la diversità microbica tra le parcelle con diverse pratiche agricole e la variabilità tra le repliche dei due blocchi (DGGE fingerprints non mostrati). Dal confronto dei DGGE fingerprinting delle parcelle del suolo coltivato con mais di Ancona di Giugno, i dati mostrano una similarità alta tra tutte le parcelle, con una leggera distinzione tra blocco 1 e 2. Si osserva la formazione di cluster comprendenti, per il blocco 1, da una parte le parcelle di Sodo 0 e 90 con una similarità dell 88% tra loro e dall altra le parcelle di Arato 0 e 90 con 85% di similarità. Per quanto riguarda il blocco 2, le parcelle di Sodo 0 e Arato 0 formano un cluster con un valore di similarità del 90%. A seguire, la parcella di Arato 90 e Sodo 90 con una similarità dell 88% e 85% rispettivamente con Sodo e Arato 0. La similarità tra le parcelle dei due blocchi è circa 80% (Fig. 16). 11

12 Sodo 0, blocco 1 Sodo 90, blocco 1 Arato 0, blocco 1 Arato 90, blocco 1 Sodo 90, blocco 2 Arato 90, blocco 2 Sodo 0, blocco 2 Arato 0, blocco 2 Fig. 16. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con MAIS di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) all interno di ciascun blocco, in triplo. Così possiamo dire che pur avendo una similarità alta tra tutte le parcelle, nel blocco 1 si osserva che la comunità microbica è più simile per tipo di lavorazione mentre nel blocco 2 la similarità è maggiore in relazione alla concimazione. Sempre per il suolo coltivato con mais, a Novembre rispetto a Giugno, si nota una similarità delle comunità eubatteriche maggiore tra le stesse parcelle dei due blocchi per il suolo Sodo 90 e Arato 0. Mentre le parcelle di Sodo 0 e Arato 90 si distinguono maggiormente tra blocco 1 e 2, in particolare tra le parcelle di Sodo 0. Infatti si osserva un cluster tra le parcelle di Sodo 90 del blocco 1 e 2 con 93% di similarità tra loro. Le parcelle di Arato 0 del blocco 1 e 2 hanno una similarità con quelle di Sodo 90 di circa 88 e 87% rispettivamente. Inoltre vediamo che il suolo Arato 0 del blocco 1 con il Sodo 0 del blocco 2 formano un cluster tra loro con circa 92% di similarità. Mentre il Sodo 0 del blocco 1 si discosta molto con un valore di similarità con tutti gli altri campioni di 64%. Infine, le parcelle Arato 90 hanno una similarità media con il resto dei campioni di circa 77% (Fig. 17). 12

13 Sodo 0, blocco 1 Arato 90, blocco 2 Arato 90, blocco 1 Sodo 0, blocco 2 Arato 0, blocco 1 Arato 0, blocco 2 Sodo 90, blocco 1 Sodo 90, blocco 2 Fig. 17. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con MAIS di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) all interno di ciascun blocco, in triplo. Per il suolo di Ancona coltivato con frumento nel mese di Giugno, i dati mostrano un alta similarità tra tutte le parcelle in particolare, per entrambi i blocchi, si notano cluster delle parcelle lavorate allo stesso modo. Infatti, la similarità tra le parcelle non lavorate (S0, S90) tra loro, e quelle lavorate (T0, T90) tra loro, del blocco 1 è per entrambi del 95%; per le stesse parcelle del blocco 2 la similarità è del 93% e 92%, rispettivamente. Inoltre, per quanto riguarda la similarità tra i cluster, le parcelle di Sodo (0,90) blocco1, Sodo (0,90) blocco 2 e Arato (0,90) blocco 1 hanno una similarità tra loro di circa 90%, mentre le parcelle di Arato (0,90) blocco 2 si distinguono maggiormente dalle altre con 83% di similarità (Fig. 18). 13

14 Arato 0, blocco 2 Arato 90, blocco 2 Sodo 90, blocco 1 Sodo 0, blocco 1 Sodo 0, blocco 2 Sodo 90, blocco 2 Arato 90, blocco 1 Arato 0, blocco 1 Fig. 18. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con FRUMENTO di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) all interno di ciascun blocco, in triplo. A Novembre, si osserva una diminuzione della similarità tra i profili delle parcelle coltivate con frumento rispetto a Giugno, con una distinzione maggiore tra blocco 1 e 2. In particolare la similarità tra le parcelle del blocco 1 è 78-84% e 80-86% tra quelle del blocco 2 ed una similarità tra i due blocchi del 75%. Si distingue il S0 del blocco 1 con il 65% di similarità dal resto delle parcelle (Fig. 19). Riassumendo, questa prima analisi sui suoli di Ancona non ha rivelato grandi differenze nella composizione della comunità eubatterica nei suoli attribuibile alla lavorazione del suolo ed alla concimazione, mentre notiamo che è sensibile al cambio di stagione. Infatti i dati hanno mostrato un cambiamento di similarità delle parcelle tra i due periodi di prelievo, in particolare per le parcelle coltivate con frumento per le quali la similarità diminuisce a Novembre rispetto a Giugno. Per quanto riguarda la variabilità tra le repliche per tipo di parcella dei due blocchi, possiamo dire che questa non è elevata infatti si ha una similarità generalmente alta tra tutti i profili. In particolare per le parcelle di mais, i dati hanno mostrato che questa è minore a Novembre rispetto a Giugno mentre per le parcelle di frumento si osserva il contrario. 14

15 Sodo 0, blocco 1 Sodo 90, blocco 1 Arato 0, blocco 1 Arato 90, blocco 1 Arato 90, blocco 2 Sodo 0, blocco 2 Arato 0, blocco 2 Sodo 90, blocco 2 Fig. 19. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con FRUMENTO di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) all interno di ciascun blocco, in triplo. E stata condotta una seconda analisi sui suoli di Ancona, per poter fare un confronto diretto tra i profili dei suoli con diverso tipo di coltivazione all interno della stessa stagione e dei suoli con stessa coltivazione tra le due stagioni, per indagare sull effetto del tipo di pianta coltivata e del cambio di stagione, oltre che quello delle pratiche agricole, sulla comunità eubatterica. Per questo scopo, ottenuto il dato sulla variabilità tra le repliche dei due blocchi, queste sono state riunite per ogni tipo di parcella a livello dell amplificato di PCR (Fig. 13), ottenendo così un campione rappresentativo per tipo di parcella (S0F, S90F, T0F, T90F, S0M, S90M, T0M, T90M Giugno e Novembre). I campioni sono stati ripetuti in doppio in DGGE. Per questa analisi sono state effettuate due DGGE, nella prima sono state analizzate le parcelle di suolo di Ancona coltivate con mais e frumento del mese di Giugno, e quelle di Ancona coltivate con frumento del mese di Novembre, per poter fare un confronto diretto tra tutte le parcelle di Giugno e tra le parcelle di frumento di entrambi i periodi di prelievo. I dati ottenuti mostrano una similarità molto più alta tra i campioni all interno della stessa stagione, soprattutto tra le parcelle a Giugno, mentre la similarità diminuisce notevolmente tra le parcelle dei due periodi di prelievo con un valore di 47%. A Giugno la similarità tra tutte le parcelle è dell 88-96%, eccetto la parcella di sodo non concimato coltivata con mais (S0M) che ha una similarità leggermente minore con le altre dell 85%. Per il suolo coltivato con frumento a Novembre la similarità tra le parcelle diminuisce ed 15

16 ha un valore di 80-86%, ad eccezione della parcella lavorata e concimata (T90F) che ha una similarità del 70% con gli altri campioni (Fig. 20). Frumento Novembre Frumento-Mais Giugno Fig. 20. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con FRUMENTO e MAIS di Ancona e FRUMENTO di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) e blocco, in doppio. MAIS FRUMENTO FRUMENTO ANCONA ANCONA Fig S rdna-pcr-dgge fingerprinting della microflora batterica nei suoli coltivati con MAIS e FRUMENTO di Ancona e FRUMENTO Ancona La DGGE è stata condotta sui campioni riuniti per tipo di parcella dei due blocchi (6 repliche) in doppio. 16

17 Per poter fare un confronto tra tutte le parcelle di Novembre e tra le parcelle di mais di entrambi i periodi di prelievo, sono state analizzate in DGGE le parcelle di suolo di Ancona coltivato con mais del mese di Giugno e quelle coltivate con mais e frumento di Novembre. I risultati ottenuti hanno mostrato un andamento simile rispetto ai dati della DGGE precedentemente descritta (Fig.20 e 21), si ha infatti una similarità più alta tra le parcelle all interno di ciascun periodo rispetto alla similarità tra quelle dei due periodi che è risultata del 42%. Per le parcelle di suolo coltivato con mais nel mese di Giugno la similarità tra di loro è di circa 90% ad eccezione della parcella Sodo 0 che ha una similarità di 90% con le altre. Nel confronto tra tutte le parcelle di Novembre si osserva una diminuzione della similarità soprattutto tra le parcelle di mais e frumento rispetto al confronto tra tutte le parcelle di Giugno. Infatti la similarità relativa al frumento è dell 80-86% e 77-92% per il mais, mentre la similarità tra loro è inferiore, con un valore di 68%. Si discosta la parcella lavorata, concimata e coltivata con frumento (T90F) con 60% di similarità con il resto dei campioni (Fig. 22). Mais Giugno Frumento Novembre Mais Novembre Fig. 22. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei campioni di suolo coltivato con MAIS di Ancona e FRUMENTO e MAIS di Ancona Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprinting, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per trattamento (S0, S90, T0, T90) e blocco, in doppio. 17

18 MAIS MAIS FRUMENTO ANCONA ANCONA Fig S rdna-pcr-dgge fingerprinting della microflora batterica dei suoli coltivati con MAIS di Ancona e FRUMENTO e MAIS Ancona La DGGE è stata condotta sui campioni riuniti per tipo di parcella dei due blocchi (6 repliche) in doppio. I dati ottenuti da questa seconda analisi sui suoli di Ancona, evidenziano una maggiore incidenza del cambio di stagione sulla comunità eubatterica a livello di popolazioni dominanti, rispetto all effetto delle pratiche agricole e del tipo di coltivazione. Vediamo inoltre una diminuzione della similarità della comunità microbica tra le parcelle di Novembre, con una distinzione maggiore tra le parcelle di mais e frumento, rispetto a Giugno. Questo andamento lo si può notare anche guardando i gel di DGGE dove i profili delle parcelle di Giugno e Novembre si distinguono molto tra loro mentre sono molto simili all interno del periodo di prelievo (Fig. 23). A Giugno i profili hanno una minore ricchezza in bande, cioè un numero di popolazioni dominanti minore, con la predominanza di alcune rispetto alle altre. A Novembre le popolazioni che predominavano a giugno diminuiscono e si rivelano altre generando profili più ricchi (Fig. 21, 23), questo è evidenziato anche dal numero di bande riportato in Tabella 3, che è circa la metà per i profili di Giugno rispetto a quelli di Novembre. 18

19 MAIS Giugno Novembre S S T T FRUMENTO Giugno Novembre S S T T Tab. 3. Numero di bande dei profili DGGE dei campioni riuniti per tipo di parcella di Ancona e Questi risultati possono essere spiegati dal fatto che, a Novembre, il periodo di post-raccolta della pianta, non ci sia un effetto selettivo della pianta sulle popolazioni di batteri. Il fatto che non ci sia una diversità di selezione tra i due tipi di pianta coltivata (mais e frumento) sulla comunità eubatterica è possibile sia dovuto al fatto che sono entrambe colture erbacee appartenenti alla stessa famiglia e che la loro coltivazione subisce una rotazione annuale. Inoltre trattandosi di suolo bulk, cioè di suolo prelevato più lontano dalle radici, la comunità batterica, pur risentendo l effetto della presenza/assenza della pianta, può avvertire meno la diversità della pianta rispetto alla rizosfera, la parte di suolo adesa alle radici. 19

20 Un primo screening delle comunità eubatteriche per i suoli della Sardegna ( , ), ha riguardato la diversità microbica tra le repliche all interno di ogni tipologia di suolo, ed un iniziale confronto tra i diversi suoli, in particolare tra Pascolo ed Erbaio, Vigneto Inerbito e Lavorato per entrambe le stagioni separatamente e Sughereta con Vigneto Lavorato del mese di Novembre (DGGE fingerprints non mostrati). I dati ottenuti per i suoli Pascolo ed Erbaio di Maggio, mostrano una similarità del 70-80% tra le repliche di campo per entrambi, ed una similarità del 63% tra di due campi (Fig. 24). Le similarità degli stessi suoli a Novembre, sono state del 60-80% e 40-55% tra le repliche del Pascolo e Erbaio rispettivamente e 53% tra i due campi (Fig. 25). PASCOLO ERBAIO Fig. 24. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli PASCOLO ed ERBAIO di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di campo, in doppio. 20

21 ERBAIO PASCOLO Fig. 25. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli PASCOLO ed ERBAIO di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di campo, in doppio. Per il Vigneto Inerbito e Lavorato, a Maggio le similarità tra le repliche di suolo sono state del 75-90% e 60-70% rispettivamente e del 30% tra i due campi (Fig. 26). A Novembre, 63-78% tra le repliche per entrambi e 50% tra i suoli (Fig. 27). VIGNETO INERBITO VIGNETO LAVORATO Fig. 26. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli VIGNETO INERBITO e VIGNETO LAVORATO di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di campo, in doppio. 21

22 VIGNETO LAVORATO VIGNETO INERBITO Fig. 27. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli VIGNETO INERBITO e VIGNETO LAVORATO di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di campo, in doppio. Per la Sughereta, a Maggio la similarità tra le repliche è stata del 54-70% (Fig. 28), mentre a Novembre, del 65-80%. Per il Vigneto abbandonato campionato solo a Novembre, la similarità tra le repliche di suolo è stata del 33-60% e una similarità del 28% tra i due suoli (Fig. 29). SUGHERETA Fig. 28. Cluster analysis delle comunità eubatteriche delle repliche dei suoli SUGHERETA di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di campo, in doppio. 22

23 SUGHERETA VIGNETO ABBANDONATO Fig. 29. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli SUGHERETA e VIGNETO ABBANDONATO di Sardegna Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. 5 repliche riunite per ogni tipologia di suolo, in doppio. L analisi della diversità microbica tra le repliche all interno di ogni tipologia di suolo delle comunità eubatteriche, per la Sardegna ha evidenziato l eterogeneità della microflora tra i vari punti (cinque) campionati, fenomeno noto e ampiamente documentato in letteratura, attribuibile all eterogeneità del suolo. Dal parziale confronto tra i diversi suoli, si nota inoltre un effetto selettivo probabilmente attribuibile all uso e tipologia di suolo ed al tipo di pianta principale coltivata. Inoltre si nota l effetto del cambio di stagione, infatti le similarità sia all interno dei suoli che tra loro subiscono una variazione tra le due stagioni. Ottenuto il dato sulla variabilità tra le repliche, per poter fare un confronto diretto tra tutte le tipologie di suolo all interno della stessa stagione e tra le due stagioni è stata condotta un analisi sui campioni ottenuti riunendo le cinque repliche (a livello dell amplificato di PCR, Fig. 13) di ogni tipo di suolo. Ogni campione è stato ripetuto in doppio in DGGE. I dati ottenuti mostrano una similarità maggiore tra Pascolo ed Erbaio per entrambi i periodi di prelievo, che diminuisce leggermente a Novembre (87% a Maggio e 79% a Novembre). Il Vigneto Inerbito e la Sughereta si differenziano da essi con una similarità del 75% e 67% rispettivamente a Maggio, mentre a Novembre la similarità tra loro è del 66% e 63% di entrambi con Pascolo ed Erbaio. La similarità tra gli stessi suoli dei due prelievi è del 54%. Il Vigneto Lavorato per entrambi i prelievi si discosta dagli altri con una similarità del 51% ed una similarità dello stesso suolo tra i due periodi del 74% (Fig. 30). 23

24 Maggio Novembre Novembre Maggio Fig. 30. Cluster analysis delle comunità eubatteriche dei suoli di Vigneto Inerbito (VI), Sughereta (SU), Pascolo (PA), Erbaio (ER) e Vigneto Lavorato (VL) della Sardegna e Similarità definite graficamente tramite dendogramma, ottenute analizzando i 16S rdna PCR DGGE fingerprints, mediante software Quantity One (BioRad), applicando l UPGMA basato sull indice di similarità Dice. Repliche riunite per tipologia di campo, in doppio. VI SU PA ER VL VI SU PA ER VL SARDEGNA SARDEGNA Fig S rdna-pcr-dgge fingerprinting della microflora batterica dei suoli Vigneto Inerbito (VI), Sughereta (SU), Pascolo (PA), Erbaio (ER) e Vigneto Lavorato (VL) della Sardegna e La DGGE è stata condotta sui campioni riuniti per tipo di suolo (5 repliche) in doppio. 24

25 I risultati della cluster analisi (Fig. 30) ed i profili DGGE dei suoli della Sardegna (Fig. 31), mostrano una comunità eubatterica caratteristica per ogni tipologia di suolo (Vigneto Inerbito, Sughereta, Pascolo, Erbaio, Vigneto lavorato), probabilmente attribuibile sia all uso del suolo che all effetto selettivo del tipo di pianta principale coltivata. L elevata similarità della microflora tra il Pascolo e l Erbaio può essere attribuita al fatto che per entrambi i suoli, sia la copertura vegetale (principalmente erbaio di avena), le caratteristiche chimico-fisiche e l uso dei due suoli sono molto simili (dati pervenuti dal gruppo del Prof. Pier Paolo Roggero dell Università di Sassari, Dipartimento Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria ). La diminuzione della similarità tra Pascolo ed Erbaio a Novembre rispetto a Maggio, può essere dovuta dall assenza della copertura erbacea per il suolo Erbaio nel secondo campionamento (vedi Fig. 8). Anche tra Vigneto Inerbito e Sughereta le caratteristiche dei suoli sono simili, così la diversità eubatterica osservata è possibile che sia dovuta sia alla pianta coltivata e all uso del suolo. Anche in questo caso la maggiore distinzione tra questi due campi a Maggio, può essere spiegata dall assenza della copertura erbacea per il suolo del Vigneto Inerbito in questo periodo (vedi Fig. 8). Per tutti i suoli si nota anche un effetto marcato sulla comunità eubatterica dovuto al cambio di stagione, ad eccezione del Vigneto Lavorato. La comunità microbica del Vigneto Lavorato si distingue molto con gli altri campi, e si osserva un effetto minore dovuto alla stagionalità, questi dati possono essere dovuti all effetto dell uso del suolo in particolare alla lavorazione. Il numero di bande dei profili DGGE (Fig. 21), rappresentanti le popolazioni dominanti eubatteriche, tra i diversi suoli dello stessa stagione e tra i suoli delle due stagioni non subisce grossi cambiamenti (vedi Tab. 4) CAMPO Maggio Novembre VI SU PA ER VL Tab. 4. Numero di bande dei profili DGGE dei campioni riuniti per tipologia di suolo di Sardegna e

26 In conclusione, l applicazione dell approccio molecolare coltura-indipendente ha permesso di monitorare la diversità microbica nel suolo, in termini di composizione delle comunità batteriche, in relazione a diverse condizioni ambientali. 26