METODI CHIMICI DI FISSAZIONE

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1 METODI CHIMICI DI FISSAZIONE

2 LA FISSAZIONE DELLE PROTEINE le principali responsabili delle caratteristiche morfologiche e funzionali della sostanza vivente sono le proteine la fissazione comporta la denaturazione delle proteine è ottenuta proprio grazie alla loro denaturazione la fissazione delle proteine comporta, in grado più o meno elevato, la fissazione di altri tipi di molecole che si trovano: legate chimicamente alle proteine che vengono fissate trattenute all interno delle maglie del gel proteico determinato dalla fissazione medesima

3 DENATURAZIONE DELLE PROTEINE Consiste nella trasformazione della disposizione spaziale della catena polipeptidica (o delle catene, se più di una) dalla disposizione tipica della proteina nativa (quella presente in vivo) verso una più disordinata Ne consegue la modificazione delle proprietà chimiche, fisiche e biologiche della proteina e in particolare una diminuzione della solubilità le proteine denaturate possono: flocculare (una flocculazione irreversibile si definisce coagulazione) formare un gel dello stesso volume della soluzione originaria la fissazione di cellule e tessuti deve comunque avvenire con la minima alterazione possibile della struttura delle proteine, sia primaria sia di ordine superiore

4 DENATURAZIONE DELLE PROTEINE

5 REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI I requisiti per effettuare una buona fissazione sono 1)Precocità Il tessuto va fissato il prima possibile dopo il prelievo dall organismo se si tratta di materiale autoptico, il prima possibile dopo il decesso dell individuo il requisito della precocità è particolarmente significativo per studi di microscopia elettronica la resistenza di un tessuto alle alterazioni post-mortali varia da tessuto a tessuto è anche in funzione di: stato funzionale eventuale patologia

6 REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI 2) Piccole dimensioni del frammento da fissare gli agenti fissativi penetrano nel tessuto dalla superficie verso l interno I frammenti grossi si fissano male nel loro interno 3) Idoneo mezzo di fissazione a seconda del tipo di studi che si intendono eseguire spesso è necessario l impiego di metodi fissativi differenti su frammenti dello stesso materiale biologico 4) abbondanza del mezzo fissativo nel caso di agenti fissativi chimici in soluzione

7 CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI CHIMICI I fissativi chimici si possono suddividere in: 1) fissativi primari 2) fissativi secondari 1) fissativi primari sono quelli che assicurano da soli una efficace conservazione delle cellule e dei tessuti, rispettandone l architettura generale e la struttura, in quanto agiscono sulle proteine tissutali

8 2) FISSATIVI SECONDARI O ACCESSORI da soli non sono in grado di fissare il tessuto nel suo complesso per la scarsa o nulla azione sulle proteine, utili, talora indispensabili, per fissare altre componenti macromolecolari della sostanza vivente, che non sono conservate efficacemente dai fissativi primari si devono usare insieme a quelli primari, mai da soli esempi per microscopia ottica: il cloruro ed il bromuro di etilpiridinio per microscopia elettronica, oltre ai precedenti il blu alcian 8GX o il rosso rutenio (non impiegati per il microscopio ottico perché sono dotati di colore proprio e quindi interferiscono con successive reazioni di colorazione)

9 CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI PRIMARI I fissativi primari si suddividono in: coagulanti (precipitazione grossolana di ovoalbumina) non coagulanti (fine precipitazione) La distinzione dipende dall effetto che i fissativi producono su soluzioni di ovalbumina Questa classificazione è del tutto empirica e non si riferisce all effetto dei fissativi sui tessuti (la fissazione di un tessuto biologico comporta sempre un grado variabile di coagulazione, cioè una insolubilizzazione irreversibile delle proteine tissutali)

10 I fissativi primari coagulanti sono: etanolo, metanolo, acetone, cloroformio, bicloruro di mercurio, acido picrico, triossido di cromo, acido cromico, acido tricloroacetico I fissativi primari non coagulanti sono: formaldeide, glutaraldeide, acroleina, tetrossido di osmio (impropriamente chiamato anche acido osmico), bicromato di potassio, permanganato di potassio, dietilpirocarbonato, parabenzochinone, acido acetico

11 MECCANISMI DI AZIONE DEI FISSATIVI CHIMICI PRIMARI i principali effetti dei fissativi chimici primari sulla sostanza vivente: 1) modificazione delle caratteristiche del solvente alcoli, acetone e cloroformio, si sostituiscono all acqua acidi, modificano il ph di soluzioni acquose 2) reazioni chimiche con le proteine (possibile formazione di legami chimici senza formazione di ponti intermolecolari) esempio: tetrossido di osmio che è un forte ossidante 3) reazioni chimiche con le proteine (con formazione di ponti intermolecolari) Esempio: aldeidi che sono capaci di reagire contemporaneamente con gruppi reattivi di due diverse catene peptidiche singoli agenti fissativi possono agire attraverso più meccanismi la migliore conservazione dell architettura generale e della fine struttura dei tessuti e delle cellule è fornita da agenti che formano ponti intermolecolari

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13 ARTEFATTI in tutti i casi, si deve tener conto dei possibili artefatti determinati durante la fissazione sono tutte quelle modificazioni dei caratteri morfologici ed istochimici, rispetto allo stato vivente, che insorgono durante la preparazione del tessuto per l osservazione microscopica devono essere minimi non sono mai eliminabili completamente e se ne deve tenere conto nell interpretazione dei risultati

14 ARTEFATTI DA FISSAZIONE I principali artefatti che possono insorgere durante la fissazione sono i seguenti: 1) coartazione dei tessuti, con possibili distacchi tra tessuti di diversa consistenza e con diverso contenuto in acqua 2) rigonfiamento di tutto il tessuto o di alcune sue parti 3) indurimento del tessuto 4) estrazione di sostanze solubili negli agenti fissativi 5) spostamento di sostanze all interno del preparato (esempio tipico le cosiddette immagini di fuga del glicogeno, apprezzabili nei preparati fissati con etanolo) 6) blocco di gruppi chimici, per reazione con gli agenti fissativi 7) introduzione di gruppi chimici estranei al tessuto e presenti negli agenti fissativi 8) smascheramento di gruppi chimici del tessuto che sono impegnati in legami chimici da cui vengono liberati ad opera degli agenti fissativi

15 ARTEFATTI DA FISSAZIONE gli artefatti si producono nell intervallo di tempo che intercorre tra l arrivo dell agente fissativo in una porzione del preparato e la sua completa fissazione in questo intervallo si hanno alterazioni delle proprietà delle cellule e dei tessuti prima che si completi la insolubilizzazione delle proteine tissutali una volta che l insolubilizzazione è completa, gli artefatti compaiono solo in piccola misura e in casi limitati

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17 ESEMPI DI FISSATIVI CHIMICI PRIMARI ETANOLO, METANOLO ACETONE CLOROFORMIO CH 3 CH 2 OH, CH 3 OH CH 3 -CO-CH 3 CHCl 3 agiscono sostituendosi al solvente fisiologico, l acqua; denaturano la maggior parte delle proteine, con esclusione delle nucleoproteine si impiegano per ricerche immunoistochimiche nonostante la loro azione drastica sulle proteine, si usano di solito per tempi brevi (10-15 min) e a freddo (4 C) Alcoli, acetone e cloroformio sciolgono la maggior parte dei lipidi; provocano notevole indurimento e coartazione dei tessuti

18 BICLORURO DI MERCURIO il bicloruro di mercurio (sublimato corrosivo: HgCl2) agisce stabilendo legami con le proteine; lo lone HgCl+ reagisce con gruppi sulfidrilici (tioli: SH), carbossilici ( COOH), idrossilici ( OH) delle proteine e con i gruppi fosfato degli acidi nucleici il bicloruro di mercurio è un discreto ossidante; provoca coartazione e indurimento dei tessuti di grado molto modesto il bicloruro di mercurio forma spesso dei precipitati aghiformi nei tessuti che vengono rimossi mediante trattamento con soluzione di iodio e ioduro di potassio (soluzione iodoiodurata)

19 ACIDO PICRICO L acido picrico (trinitrofenolo) presenta in superficie numerosi atomi di ossigeno elettronegativi altera le cariche superficiali delle proteine con conseguente formazione di aggregati gelificati delle proteine alterate l acido picrico può anche formare ponti intermolecolari tra proteine fibrose l acido picrico non ha effetti diretti sui lipidi, che non sono né estratti, nè insolubilizzati nei confronti dei successivi trattamenti con solventi dei lipidi conserva il glicogeno grazie alla sua azione sulle proteine con le quali il glicogeno può essere associato (formano un reticolo tridimensionale all atto della fissazione) è scarsamente penetrante e provoca fortissima coartazione dei tessuti, ma non indurimento si usa in soluzione satura acquosa (circa 1,4%) o alcolica cristallizzato idrato può essere conservato senza precauzioni particolari (è in tal caso di colore giallo) cristallizzato anidro (di colore bianco) è esplosivo

20 FORMALDEIDE la formaldeide (HCHO) è il fissativo più frequentemente impiegato nelle ricerche istochimiche, da solo o in associazione ad altri è in grado di legarsi con legami covalenti con numerosi gruppi chimici contenenti un atomo di idrogeno reattivo: R-H + HCHO à R-CH2OH la formaldeide è usata alla concentrazione di circa il 4%, a ph tra 7,3 e 7,4, a temperatura ambiente o a 4 C, alla pressione atmosferica in queste condizioni, la formaldeide reagisce soprattutto con anelli aromatici e con gruppi aminici ( NH2 ) una volta legatasi ad una proteina, la formaldeide può reagire con un idrogeno reattivo di una seconda molecola formando ponti intermolecolari la formaldeide reagisce con le strutture biologiche in modo relativamente lento; è discretamente penetrante la formaldeide conserva la maggior parte dei lipidi (li rende insolubili nei confronti dei solventi) conserva solo parzialmente il glicogeno determina indurimento dei tessuti

21 la formaldeide si trova in commercio come formolo o formalina: soluzione di formaldeide (un gas in condizioni normali) in acqua, alla concentrazione di circa 36 40% (peso/volume), stabilizzata con circa il 10% di metanolo la formalina del commercio è usata in concentrazione del 10% (corrispondente a circa il 4% di formaldeide in soluzione), per lo più viene usata in soluzione tamponata oppure con l aggiunta di cloruro di calcio, per ottenere una migliore stabilizzazione dei lipidi un lungo soggiorno dei frammenti di tessuto in formalina provoca indurimento

22 PARAFORMALDEIDE la formaldeide può essere anche ottenuta, pura, da un suo polimero, la paraformaldeide (polvere bianca) per preparare una soluzione di formaldeide si scioglie la paraformaldeide in acqua alla concentrazione desiderata, Si scalda l acqua a 60 C e si aggiungono alcune gocce di soda (Na0H, 1N) la formaldeide ottenuta dalla paraformaldeide si usa anche per studi di microscopia elettronica, la formalina non può essere usata per la microscopia elettronica a causa della presenza del metanolo nella soluzione

23 GLUTARALDEIDE La glutaraldeide (CHO (CH2)3-CHO) ha meccanismo di azione simile alla formaldeide A differenza della formaldeide, l aldeide glutarica o glutaraldeide introduce gruppi aldeidici liberi nei tessuti La glutaraldeide è molto meno penetrante della formaldeide, ma garantisce la fissazione dei fosfolipidi e degli sfingolipidi e, almeno parzialmente, di tutti gli altri lipidi E usata per microscopia elettronica, a concentrazioni comprese tra il 2% e il 6%; in commercio si trova in soluzione acquosa, in confezioni ermetiche in atmosfera di azoto per evitare processi di ossidazione e conseguente polimerizzazione ad opera dell ossigeno atmosferico; va conservata al buio La glutaraldeide è dotata di fluorescenza primaria

24 TETROSSIDO DI OSMIO Il tetrossido di osmio (OsO4) è in grado di reagire con numerosi gruppi chimici, comportandosi da energico ossidante; reagisce con gruppi alcolici ( =CHOH) con eteri (R 0 R ), con gruppi aldeidici ( CHO) e chetonici (=CO) Reagisce con gruppi sulfidrilici ( SH) e disolfuro ( S S ) con gruppi aminici ( NH2) determinando una deaminazione ossidativa, con gruppi guanidinici, imidazolici e pirrolici, con i doppi legami dei lipidi Reagisce solo se questi gruppi sono presenti in molecole a lunga catena carboniosa, Reagisce molto lentamente anche con idrocarburi saturi Il tetrossido d osmio è poco penetrante, per cui frammenti di tessuto non devono superare 1 mm di spessore; provoca una modica coartazione ed un notevole indurimento dei tessuti

25 Il tetrossido d osmio reagisce anche con i lipidi, si scioglie in essi e può così reagire con i loro gruppi reattivi, venendo ridotto a biossido di osmio (OsO2 nero) Il biossido di osmio si comporta come un colloide carico negativamente che è attratto da forze elettrostatiche verso il polo idrofilo dei fosfolipidi; questo fenomeno può spiegare, almeno in parte, la distribuzione dell osmio nelle membrane cellulari

26 ACIDO ACETICO L acido acetico (CH3-COOH) determina una acidificazione del solvente fisiologico ed esercita così la sua azione fissativa E usato in miscele fissative per microscopia ottica Dopo fissazione in miscele contenenti acido acetico si devono passare i tessuti direttamente in alcool a 80 per evitare un rigonfiamento eccessivo dei tessuti in generale e delle fibre collagene in particolare

27 MISCELE FISSATIVE Liquido di Zenker. Era un fissativo consigliato in passato come il più idoneo per eseguire comuni preparati di qualsiasi organo e di embrioni. Sublimato corrosivo gr 5 Liquido di Mùller ml 100 Si scioglie a caldo. Prima dell uso si aggiunge acido acetico 5 %. Durata della fissazione 24 ore; per pezzi piccoli bastano 6-10 ore. Si lava in acqua corrente per 24 ore, poi si passa nell alcool iodato come per i pezzi fissati in sublimato.

28 ESECUZIONE DELLA FISSAZIONE CON AGENTI CHIMICI La fissazione con agenti chimici può essere effettuata mediante: esposizione a vapori del fissativo (soprattutto formaldeide) nel caso di sottili sezioni di tessuto o cellule isolate Più comunemente, la fissazione con agenti chimici si esegue mediante soluzioni fissative che possono contenere: un solo agente fissativo sciolto in acqua o in soluzioni saline più fissativi miscelati tra loro o sciolti in acqua o in soluzioni saline

29 PROPRIETÀ E IMPIEGO DELLE MISCELE FISSATIVE queste miscele oltre agli agenti fissativi contengono sali minerali e talora saccarosio, per regolare la solubilità dei fissativi, il ph, la pressione osmotica e la forza ionica Le soluzioni fissative possono essere impiegate: Per immersione dei frammenti da fissare (fissazione per immersione), perfondendo l albero circolatorio di un organo o di un intero, piccolo animale (fissazione per perfusione)

30 PROPRIETÀ E IMPIEGO DELLE MISCELE FISSATIVE Le miscele fissative devono tener conto della compatibilità reciproca tra i fissativi impiegati: alcuni fissativi possono essere mescolati tra loro solo al momento dell uso, perché col tempo reagiscono l uno con l altro, inattivandosi Le miscele fissative si propongono di: compensare i difetti dei singoli agenti impiegati ottenere una fissazione completa ed adeguata sotto il profilo morfologico e chimico

31 MISCELE FISSATIVE Liquido di Bouin. E uno dei fissativi più usati per le preparazioni istologiche di routine. Essendo molto penetrante serve per fissare pezzi di organi anche voluminosi e permette l uso di quasi tutti i metodi di colorazione. Si presta per allestire tanto preparati di insieme quanto citologici. Soluzione satura acquosa di: acido picrico ml 15 Formalina ml 5 Acido acetico glaciale ml 1 Si mescolano le parti al momento dell uso. Durata della fissazione: secondo la grossezza dei pezzi da 12 a 48 ore.