Visione della superficie dorsale

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1 mappe gastrulazione presuntive Tracciare linee di discendenza cellulare. Mappare la struttura larvale o adulta sulla regione dell embrione dalla quale tale struttura deriverà. Visione della superficie dorsale

2 mappe presuntive 1. Osservazione dei viventi. Alcuni organismi hanno il vantaggio di essere trasparenti, composti di poche cellule le figlie delle quali rimangono in posizioni adiacenti, quindi facilmente individuabili. La mappa presuntiva del tunicato Styela partita è stata tracciata da EG Conklin nel 1905 che seguì il destino dei singoli blastomeri grazie alla loro peculiarità d essere colorati in modo differente (presenza di pigmento) a seconda del destino.

3 mappe presuntive 1. Marcatura con coloranti vitali. Coloranti vitali (es. blu Nilo, rosso neutro) colorano le cellule senza ucciderle. Se ne può quindi seguire il destino. Vogt (1929)

4 mappe presuntive 2. Marcatura con radioisotopi. Un area dell embrione viene resa radioattiva: si incuba un embrione in terreno contenente timidina radioattiva (che verrà incorporata nel DNA delle cellule che si replicano); l area di interesse viene espiantata e con essa si sostituisce la regione corrispondente in un embrione incubato in terreno freddo. Le cellule marcate verranno riconosciute nell embrione non marcato mediante tecniche autoradiografiche. Vogt (1929)

5 mappe presuntive 3. Marcatura con coloranti fluorescenti. Coloranti vitali e radioisotopi vengono diluiti nel succedersi delle divisioni cellulari. La detection dei composti diviene difficoltosa. Si usano quindi coloranti fluorescenti (es. carbocianine), di maggiore intensità. Tali coloranti vengono microiniettati nella cellula(e) d interesse, la cui discendenza sarà tutta marcata. Alternativamente, l iniezione del colorante fluorescente inattivo (caged) avviene ai primissimi stadi di sviluppo in modo che diffonda nell intero embrione. Successivamente, mediante un laser, si colpisce la cellula(e) d interesse nella quale il colorante verrà liberato e diverrà fluorescente. Si bypassa il macchinoso step della microiniezione in blastomeri specifici a stadi più avanzati di sviluppo.

6 mappe presuntive 4. Marcatura genetica. Costruzione di embrioni chimera nel quale le cellule sono geneticamente (quindi fenotipicamente) differenti. Trapianto di cellule di quaglia in embrione di pollo.

7 equivalenza del genoma Tutte le cellule dell organismo hanno effettivamente lo stesso identico genoma? Oppure il patrimonio genetico della cellula ormai differenziata ha subito delle modificazioni funzionali irreversibili?

8 Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

9 equivalenza del genoma Hans Spemann e la Teoria del Trasferimento Nucleare 1938: una cellula già terminalmente differenziata è in grado di riprogrammare l'informazione in termini di espressione genica e di controllare lo sviluppo embrionale? Spemann propose di prelevare il nucleo da una cellula di un embrione in avanzata fase di sviluppo e trasferirlo nel citoplasma di una cellula uovo enucleata. Spemann non pote' condurre l'esperimento per la mancanza di strumenti adatti alla manipolazione e dissezione delle cellule somatiche e germinali.

10 equivalenza del genoma exp. Robert Briggs e Tom J. King, 1952 Rana pipiens

11 equivalenza del genoma

12 equivalenza del genoma Briggs e King pongono le basi sperimentali (creano quegli strumenti che erano mancati a Spemann 14 anni prima quando elaborava la teoria del Trasferimento Nucleare) per fornire le risposte ai quesiti di quegli anni: (?) Il nucleo di una cellula differenziata conserva ancora tutte le informazioni originarie; inoltre, tale nucleo risulta riprogrammabile ed in grado di originare un nuovo individuo. (?) La sinergia tra il citoplasma ospite dell uovo e il nucleo che in esso viene rilocato è sufficiente a riattivare il nucleo a dirigere lo sviluppo del nuovo individuo.

13 equivalenza del genoma 1962: J. Gurdon ritenta l'esperimento di Briggs e King, usando nuclei di cellule differenziate d'intestino di girino di Xenopus laevis. 1.4 la % di successo a girino. Utilizzando il trapianto in serie - il nucleo viene trapiantato nell uovo che viene lasciato sviluppare fino a blastula. Il nucleo della cellula di blastula si trasferisce in un altro uovo enucleato e così via - ottenne un successo del 7% comprendente 7 rane adulte fertili. Gurdon dimostra che i nuclei di cellule somatiche differenziate, trasferiti nel citoplasma di un uovo enucleato, modificano il proprio programma genetico.

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15 equivalenza del genoma 1997: I. Wilmut e collaboratori clonano il primo mammifero. Prelievo cellule somatiche da ghiandola mammaria di adulto (razza Finn-Dorset). Coltura cellulare e arresto in G1 (le cellule, 2n, son quindi sincronizzate). Oociti dalla donatrice (razza Scottish blackface) in seconda metafase meiotica enucleati. Fusione cellulare somatica/oocito e attivazione dell oocito stesso mediante impulsi elettrici. Trasferimento in utero di pecora gravida. % di successo: 1/434 oociti impiantati = Dolly. Dimostrazione della totipotenza del nucleo dei mammiferi: il genoma rimane inalterato e capace di differenziare in tutti i tipi cellulari.

16 primi stadi di sviluppo Segmentazione: rapide divisioni cellulari (mitosi) che dividono il citoplasma dell uovo fecondato in numerose cellule (blastomeri). Gastrulazione: le cellule formate in segmentazione si muovono in modo coordinato, ridistribuendosi. Con la gastrulazione si formano i tre foglietti embrionali, Ectoderma, Mesoderma, Endoderma, che daranno origine, successivamente, alle strutture di competenza.

17 segmentazione segmentazione Segmentazione: rapide divisioni cellulari (mitosi) che dividono il citoplasma dell uovo fecondato in numerose cellule figlie (blastomeri). Rana pipiens

18 segmentazione MBT (midblastula transition transizione della blastula intermedia) ( Factor MPF (Mitosis Promoting MPF si compone di 2 subunità: - cdc2, capace di trasferire gruppi fosfato dall ATP a specifici residui di Ser e Thr di specifiche proteine - ciclina B, che regola la cdc2. MPF fosforila diverse proteine, tra cui: - le condensine, che favoriscono la condensazione della cromatina e la segregazione dei cromosomi; - le lamìne, i cui dimeri vengono dissociati determinando la degradazione della membrana nucleare; - istoni.

19 tipi di segmentazione 1 Il solco di segmentazione interessa l intero uovo

20 tipi di segmentazione 2 Il solco di segmentazione non penetra nella regione ricca di vitello

21 segmentazione Blastula riccio di mare

22 blastocele 1. Permette la migrazione cellulare durante i massivi movimenti della gastrulazione 2. Impedisce il contatto quindi l interazione tra le cellule. emisfero (calotta) animale Nieuwkoop (1973)

23 adesione cellulare Cell Adhesion Molecules

24 adesione cellulare

25 oligonucleotidi antisenso anti-ep-caderina. Heasman et al, 1994

26 anfibi - segmentazione Morula (16-64 cellule) Blastocele (cavità) Blastula (128 cellule)

27 blastocele controllo oligonucleotidi antisenso anti-ep-caderina Heasman et al, 1994

28 adesione cellulare

29 doi: /pnas adesione cellulare

30 x e n o p u s gastrulazione

31 assi corporei ASSE ANTEROPOSTERIORE (cefalocaudale): capo > coda ASSE DORSOVENTRALE: dorso > addome ASSE DESTRA-SINISTRA: lato Dx > lato Sx