Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie Primo anno della Laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico

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Rosalia Gattini
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1 Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie Primo anno della Laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico ALESSIA PERINO

2 La leptina è una piccola proteina non glicosilata di 16 kda, prodotta soprattutto a livello del tessuto adiposo bianco. Una volta prodotta, essa viene secreta nel torrente circolatorio, dal quale è trasportata agli organi bersaglio. Il principale luogo d azione della leptina è a livello del cervello, ma essa agisce anche su altri organi quali il fegato, i polmoni ed il muscolo scheletrico. I livelli circolanti della leptina sono proporzionali alla massa grassa presente nell organismo. Il gene per la leptina, chiamato gene ob, è stato scoperto nel 1994 utilizzando la tecnica del positional cloning. Per quanto riguarda il topo, il gene ob mappa sul cromosoma 6, mentre nell uomo esso si trova sul cromosoma 7. In questo lavoro del 1994 hanno considerato l espressione del gene per la leptina e l hanno rilevata solamente a livello del tessuto adiposo bianco.

Il principale luogo d azione della leptina è a livello del cervello, ma essa agisce anche su altri organi quali il fegato, i polmoni ed il muscolo scheletrico.

3 In realtà, in lavori successivi, si è visto che il gene per la leptina è espresso in modo regolato anche in molti altri tessuti, espressione non rilevata in questo articolo, forse per l utilizzo di tecniche meno sensibili. La leptina è una molecola abbastanza conservata ed è presente in molte specie diverse. La sequenza aminoacidica della leptina di topo e quella umana hanno un omologia dell 84 %. Questi studi sulla leptina sono stati effettuati su topi wt ma anche su topi ob/ob. I topi ob/ob presentano una mutazione puntiforme non-senso a livello del residuo 105 della leptina: nel topo wt si ha un arginina, mentre nel topo ob/ob è presente un codone di stop. Questa mutazione causa la presenza, in questi topi, di una forma tronca e non funzionale della leptina. I topi ob/ob presentano un fenotipo obeso con molte complicanze, quali: iperfagia, senso della sazietà compromesso, ipercolesterolemia, iperinsulinemia, iperglicemia, aumento non lineare della crescita, ipotermia, basso consumo di energia e di ossigeno, aumento della concentrazione di glucocorticoidi, ipogonadismo ovvero sterilità e anomalie nella funzionalità immunitaria, soprattutto a livello dei linfociti T.

La sequenza aminoacidica della leptina di topo e quella umana hanno un omologia dell 84 %. Questi studi sulla leptina sono stati effettuati su topi wt ma anche su topi ob/ob.

4 Una volta identificata la leptina, si è voluto clonare il suo recettore. Per la ricerca del recettore, sono state usate leptina marcata con iodio 125 e una proteina di fusione leptinafosfatasi alcalina. Dopo una ricerca in linee cellulari e tessuti di mammifero, si è visto che le due forme di leptina marcata si legavano in modo specifico al plesso coroide del topo. Si è quindi creata una library di cdna partendo dall mrna estratto dal plesso coroide di 300 topi. La library è stata screenata con la proteina di fusione leptina-fosfatasi alcalina e l inserto di cdna del clone positivo è stato sequenziato e si è visto che era presente una sola ORF, codificante per una proteina di 894 aminoacidi, corrispondente al recettore per la leptina. Il recettore per la leptina, detto anche OB-R, è espresso in molti tessuti come i polmoni, il fegato, il muscolo scheletrico e il rene ma la sua espressione più abbondate si trova a livello del cervello e, più precisamente, a livello del plesso coroide e dell ipotalamo.

Dopo una ricerca in linee cellulari e tessuti di mammifero, si è visto che le due forme di leptina marcata si legavano in modo specifico al plesso coroide del topo.

5 Il recettore OB-R appartiene alla famiglia dei recettori per la citochine di classe I. Questi recettori hanno un dominio extracellulare di legame al ligando, un dominio transmembrana e un dominio intracellulare necessario per la traduzione del segnale. Il recettore OB-R presenta un omologia elevata, soprattutto nei confronti del recettore gp130. Nel topo sono presenti sei isoforme del recettore per la leptina e tutte e sei sono dei prodotti di splicing alternativo.

intracellulare necessario per la traduzione del segnale.

6 Solamente la forma lunga, detta anche OB-Rb, è in grado di segnalare. Quattro isoforme sono invece definite corte poiché mancano di una parte del dominio intracellulare. Queste quattro isoforme, dette OB-Ra, OB-Rc, OB-Rd e OB-Rf, non sono in grado di trasdurre il segnale ma hanno un ruolo nel trasporto della leptina attraverso la barriera ematoencefalica e nell internalizzazione e nella degradazione della leptina. La sesta isoforma, chiamata OB-Re è una forma solubile, priva del dominio intracellulare e di quello transmembrana. OB-Re ha il ruolo di trasportare la leptina nel circolo ematico, agli organi bersaglio. OB-Re può essere prodotto per splicing alternativo oppure per taglio proteolitico del dominio extracellulare di OB-Rb. Le vie di trasduzione del segnale attivate dalla leptina sono molteplici.

internalizzazione e nella degradazione della leptina. La sesta isoforma, chiamata OB-Re è una forma solubile, priva del dominio intracellulare e di quello transmembrana.

7 Innanzitutto, il recettore OB-Rb forma un omodimero non funzionale in assenza di leptina. Quando la leptina lega l omodimero, essa causa un cambiamento conformazionale del recettore che espone il dominio di legame per JAK2. OB-Rb non ha attività tirosinchinasica e recluta la tirosin-chinasi JAK2 che media le fosforilazioni successive. JAK2 attiva si autofosforila a fosforila il recettore su due residui tirosinici essenziali: Y958 e Y1138. Alla tirosina fosforilata in posizione 1138 si lega STAT3 che viene fosforilato da JAK2. STAT3, una volta fosforilato, dimerizza, trasloca nel nulcleo e va ad attivare l espressione di geni come c-fos. SOCS3 si lega invece alla fosfotirosina in posizione 958 e agisce come inibitore della via di segnale, poiché lega JAK2 e non ne permette l attivazione. Allo stesso sito di legame di SOCS3, si lega anche il dimero SHP2-Grb2 che va ad attivare la via di segnale delle MAP chinasi. Una via di segnalazione secondaria passa attraverso l AMP e porta all ossidazione degli acidi grassi. Inoltre è importante la presenza del cross-talk tra il recettore per la leptina e quello per l insulina. Il recettore per l insulina recluta e fosforila IRS-1 che va ad attivare la via di segnalazione di PI3K. Si è visto che l attivazione del recettore della leptina causa un aumento di fosforilazione di IRS1 e, quindi, un aumento dell attivazione della via di segnalazione di PI3K. Questo tipo di cross-talk è importante perché l insulina, come la leptina, è un ormone coinvolto nella regolazione dell omeostasi energetica. Dopo questi studi sul recettore della leptina e sul suo ligando, si è analizzata l espressione della leptina a livello del sangue di topi di controllo, di topi ob/ob e di topi db/db, ovvero di topi aventi una mutazione che rende tronco e quindi non funzionale il recettore della leptina. La lepina è espressa nel sangue dei topi di controllo ma non in quello dei topi ob/ob, nei quali la forma mutata della leptina non viene secreta a livello del torrente circolatorio. Nel sangue dei topi db/db sono presenti livelli maggiori di leptina, ma, nonostante ciò, questi

OB-Rb non ha attività tirosinchinasica e recluta la tirosin-chinasi JAK2 che media le fosforilazioni successive.

8 topi sono obesi. I topi db/db producono una forma normale di leptina ma, non avendo il recettore funzionale, sono resistenti ad essa. Non c è quindi una via di segnalzione che compensa la carenza di OB-R. Gli effetti biologici della leptina sono stati studiati su topi wt, su topi ob/ob e su topi db/db ai quali è stata inettata intraperitonealmente una dose di leptina ricombinante per più giorni successivi. Ogni giorno sono stati misurati due parametri: l assunzione di cibo e la massa corporea. I topi wt trattati con leptina ricombinante mostrano una riduzione dell assunzione di cibo e della massa corporea rispetto ai topi non trattati. L assunzione di cibo cala in modo significativo nei primi giorni di trattamento ma poi si stabilizza a valori leggermente più bassi del normale. La massa corporea diminuisce lievemente. L assunzione di cibo dei topi ob/ob trattati con leptina ricombinate cala in modo veramente significativo, tanto che, dopo soli quattro giorni dall inizio del trattamento, l assunzione di cibo dei topi ob/ob è pari a quella dei topi wt non trattati. Anche la riduzione della massa corporea dei topi ob/ob trattati è rilevante: già dopo quattro giorni iniziano a perdere peso e dopo 33 giorni di trattamento il loro peso si è ridotto del 40%. I topi db/db trattati con leptina ricombinante non diminuiscono né l assunzione di cibo, né la loro massa corporea e ciò è in accordanza con la resistenza alla leptina endogena.

Gli effetti biologici della leptina sono stati studiati su topi wt, su topi ob/ob e su topi db/db ai quali è stata inettata intraperitonealmente una dose di leptina ricombinante per più giorni

9 Quindi, in conclusione: La leptina è un omone che regola l omeostasi energetica, il peso corporeo, l appetito, i depositi di grasso, il metabolismo di glucoso e l azione dell insulina. La leptina regola l equilibrio presente tra assunzione di cibo e dispendio energetico. La leptina è un ormone circolante prodotto dal tessuto adiposo che, se assente, causa profonda obesità (topi ob/ob). Se fornita dall esterno, riduce in modo importante sia l assunzione di cibo sia il peso corporeo. Il recettore per la leptina ha anch esso un ruolo essenziale nella regolazione del metabolismo. In caso di mutazione i topi db/db presentano un fenotipo molto simile a quello dei topi ob/ob. BIBLIOGRAFIA Zhang Y. et al. Postional cloning of the mouse obese gene and its human homologue Nature (1994) 372, Zabeau L. et al. The ins and outs of leptin receptor activation FEBS (2003) 546, Halaas J.L. et al. Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene Science (1995) 269, Tartaglia L.A. et al. Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R Cell (1995) 83, Hegyi K. et al. Leptin induced signal transduction pathways Cell Biology International (2004) 28,

La leptina è un ormone circolante prodotto dal tessuto adiposo che, se assente, causa profonda obesità (topi ob/ob).

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