Effetti delle LDL ossidate sull uptake del glucosio in cellule adipocitarie mature
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- Giulietta Filomena Quarta
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1 Effetti delle LDL ossidate sull uptake del glucosio in cellule adipocitarie mature Beatrice Scazzocchio Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Istituto Superiore di Sanità
2 INSULINO-RESISTENZA L insulino-resistenza viene definita come una ridotta capacità dell insulina nel regolare l omeostasi del glucosio in tessuti specifici E comunemente associata a patologie quali obesità, diabete di tipo II, ipertensione e aterosclerosi L insulino resistenza può avere una base genetica ma può anche essere influenzata da fattori acquisiti o ambientali.
3 Scarsa attività fisica Eccesso ponderale INSULINO-RESISTENZA Fumo di sigaretta Localizzazione viscerale dell adipe Dieta iperlipidica Uso di farmaci (es. glucocorticoidi)
4 INSULINO-RESISTENZA La ridotta sensibilità all insulina può dipendere da vari difetti molecolari. Tali difetti sono eterogenei e possono coinvolgere: il recettore insulinico la catena di trasduzione del segnale insulinico
5 GLUT-4
6 GLUT 4 Il GLUT 4 è la molecola trasportatrice del glucosio principalmente espressa nel tessuto adiposo e nel muscolo. E stato ipotizzato che alterazioni quantitative o qualitative del GLUT 4 possano contribuire alla patogenesi dell insulinoresistenza. Infatti studi sull espressione dell mrna del GLUT4 nel tessuto adiposo hanno dimostrato una riduzione dei livelli di questo trasportatore nei pazienti diabetici tale da giustificare la ridotta responsività del tessuto all azione dell ormone.
7 Insulina e uptake del glucosio Insulina Glucosio Recettore Insulinico Membrana Plasmatica GLUT4 IRS Y-P Y-P PI 3-Chinasi3 SH2 p85 SH2 p110 PI 3-P3 PKCζ/λ PDK1 Akt/PKB Jiang et al, J Clin Invest, 1999 modificato Vescicola di GLUT4
8 Membrana plasmatica Flotillina Insulina Caveolina CAP Cbl APS crk C3G TC10 Actina? da Watson RT et al, Endocr Rev 2004, modificato
9 Poiché il contenuto plasmatico delle oxldl aumenta in corso di obesità, diabete di tipo II e arteriosclerosi, e avendo le oxldl un ruolo attivo come modulatrici delle diverse attività cellulari (apoptosi, proliferazione, differenziamento), abbiamo voluto valutare il ruolo delle oxldl sull uptake del glucosio indotto dall insulina negli adipociti maturi.
10 Disegno Sperimentale Le 3T3-L1 sono state utilizzate al 14 giorno di differenziamento. Per l esperimento di uptake del glucosio le cellule sono state lasciate per 4h senza siero e senza glucosio e trattate contemporaneamente con oxldl. Al termine delle 4h le cellule vengono trattate con: insulina 1µM 1 M per 30 ; 2 DG marcato per 45 ; 2 lavaggi in PBS freddo; permeabilizzazione con TRITON X 0.5% in PBS per 15 prelevati 200 µl; Lettura al β-counter in liquido di scintillazione; Correzione per l uptake aspecifico in presenza di florizina
11 CTR oxldl 140 mrna AP2 140 mrna leptina % rispetto CTR % rispetto CTR CTR INS oxldl 0.1 mg/ml 0 CTR INS oxldl 0.1 mg/ml
12 300 2DG uptake RISULTATI 120 mrna GLUT % rispetto CTR * % rispetto CTR ^ * CTR INS oxldl 0.1 mg/ml *p<0.005 vs INS ^p<0.001 vs CTR CTR INS oxldl 0.1 mg/ml
13 RISULTATI GLUT4 (proteina di membrana) % rispetto CTR * * ^ ^ CTR INS oxldl 0.1 mg/ml *p<0.001 vs CTR ^p<0.001 vs INS
14 RISULTATI % rispetto CTR CTR URIDINA oxldl 0.1 mg/ml
15 Membrana plasmatica IKKβ P IkB IkB IkB p50 p65 p50 p65 proteasoma p50 p65 NUCLEO
16 RISULTATI * p<0.005 vs ins ^ p<0.001 vs oxldl 2DG uptake % rispetto CTR * ctr ins oxldl0.1mg/ml in NFkB in NFkB+oxLDL ^
17 NFkB RISULTATI Western-blot NFkB e IkB IkB % rispetto CTR % rispetto CTR CTR INS oxldl 0.1 mg/ml CTR INS oxldl 0.1 mg/ml
18 mrna PPARγ % rispetto CTR CTR INS oxldl 0.1 mg/ml
19 CONCLUSIONI Le oxldl inducono insulino resistenza in 3T3L1 adipociti: diminuendo l uptake del glucosio indotto dall insulina diminuendo la trascrizione genica del GLUT 4 diminuendo la traslocazione del GLUT 4 alla membrana plasmatica
20 CONCLUSIONI Western-blot IRS-1 % rispetto CTR 8,00 * 6,00 4,00 2,00 ^ 0,00 CTR INS oxldl 0.1 mg/ml * p<0.001 vs CTR ^ p<0.001 vs INS
21 CONCLUSIONI Le oxldl possono quindi modulare il segnale di trasduzione dell insulina : intervenendo direttamente in uno dei vari step del signaling insulinico che termina con la traslocazione del GLUT 4 sulla membrana plasmatica (es. IRS1, PKC, Akt, p38 MAPK, PI3K.); oppure, tramite il fattore di trascrizione NFkB. In questa ipotesi NFkB, riducendo la trascrizione del PPARγ, responsabile della trascrizione dei geni dell adipogenesi, provoca indirettamente la downregolazione del messaggero del GLUT 4.
22 Collaborazioni Rosaria Varì Massimo D Archivio Roberta Di Benedetto Carmelina Filesi Claudio Giovannini Roberta Masella Carmela Santangelo
23 Traslocazione del GLUT 4 da Watson RT et al, Endocr Rev 2004
24
25 RISULTATI ROS CTR INS oxldl 0.1 mg/ml DHR 123 DHE Produzione di ROS intracellulare (unità arbitrarie)
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