Dr. Ilda D Annessa ilda.dannessa@uniroma2.it

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1 Docking and Drug design Dr. Ilda D Annessa ilda.dannessa@uniroma2.it

2 Le proteine sono oggetti flessibili e non corpi rigidi. Nella maggior parte dei casi esplicano la loro azione in concerto con altre molecole: Corecettori Ligandi Substrati Acidi nucleici Spesso l interazione di una proteina con un altra molecola ne modifica la struttura tridimensionale. Per studiare a fondo la funzione di una proteina è opportuno conoscere le interazioni che questa stabilisce con altre molecole.

3 Docking Il docking è una tecnica computazionale che ha la funzione di predire la modalità di interazione tra due macromolecole biologiche, o tra una macromolecola ed un piccolo ligando. Il docking cerca di individuare quelle molecole che possono occupare uno specifico sito di legame in una macromolecola e di studiare tutte le caratteristiche del legame. Questa tecnica richiede la conoscenza della struttura del sito di legame, che può essere acquisita tramite tecniche cristallografiche a raggi X, NMR e/o modellazione per omologia con strutture note. I metodi di docking posizionano un ligando nel sito di legame di una proteina mediante ottimizzazione della complementarità sterica, idrofobica ed elettrostatica e, in alcuni casi, mediante la stima dell'energia libera d'interazione (scoring).

4 Generalità sul Docking L associazione fra due molecole è basata su interazioni: Idrofobiche Van der Waals Elettrostatiche Legami idrogeno Le interazioni (Van der Waals Elettrostatiche Legami idrogeno) sono deboli e a corto raggio L associazione implica complementarietà geometrica Nel docking si cerca di determinare la geometria del complesso intermolecolare formato fra le due molecole L energia di binding è la differenza di energia fra il complesso e le due molecole separate: Il solvente (acqua) gioca un ruolo importante L entropia ha un impatto significativo sul binding.

5 Le variabili che contribuisco all interazione tra due molecole Interazioni idrofobiche: sono le interazioni più forti che stabilizzano le interazioni tra due molecole. Interazioni elettrostatiche: le interazioni elettrostatiche (o Culombiane) sono meno forti delle interazioni idrofobiche e caratterizzano spesso la specificità dell interazione. Legami idrogeno: i legami idrogeno contribuiscono a rafforzare l interazione e garantiscono un buon grado di specificità tra le due molecole. PH: il ph è estremamente importante durante la reazione di legame tra due molecole poiché può contribuire a mascherare o a esporre delle cariche elettrostatiche nelle regioni d interazione (il ph non viene preso in considerazione dai programmi di docking). Solvente: il ruolo del solvente è estremamente importante durante l interazione tra due molecole (Es. legami idrogeno specifici, ecc.) ma molto difficile da stimare (in molti programmi di Docking non viene considerato l effetto del solvente sullo stato dell interazione).

6 Importanza del Docking Il docking permette di studiare come una molecola si leghi ad una macromolecola biologica (enzima, proteina, DNA, recettore) processo alla base del riconoscimento molecolare 1. Il riconoscimento molecolare è un fenomeno di enorme importanza in biologia: Enzima substrato Anticorpo antigene Recettore ligando (agonista, antagonista, inibitore) 2. Strutture di complessi proteina-ligando: Raggi X NMR 3. Importanza in chimica farmaceutica: Ligando = Molecola con azione farmacologica!

7 Lock and key model Il modello d interazione Lock and Key è bastato principalmente su una complementarità geometrica. In questo modello d interazione il ligando e il recettore sono considerati corpi completamente rigidi. Questo modello d interazione non tiene conto di tutti i cambiamenti strutturali dovuti all interazione (è molto approssimativo)

8 Calcolo dell energia d interazione Energia di interazione: somma di interazione VdW (comprensive di legami idrogeno) e elettrostatica fra gli atomi di una molecola e quelli dell altra E int = C r i j ij ij 12 D r ij ij 6 + q q i εr ij j i=1,2,3 j=1,2 Se fra i e j è presente anche un legame idrogeno, si deve aggiungere un contributo di tipo VdW con esponenti 12 e 10 A ij r ij 12 _ B ij 10 r ij 1 3 i j

9 Calcolo dell energia del complesso Interazioni a corto raggio implicano elevata complementarietà geometrica fra le superfici a contatto. Ligando e proteina sono conformazionalmente flessibili La stima dell energia totale del complesso; devono essere considerati molti fattori: energie conformazionali effetto del solvente effetto entropico energia elettrostatica

10 Docking e calcolo dell energia del complesso- TERMODINAMICA La formazione del complesso è guidata dalla variazione di: ENTROPIA e ENTALPIA Sistema = solvente + ligando + recettore solvente + complesso Equazione dell energia libera G= H - T S

11 Protein-protein Docking Protein-ligand Docking

12 Assunzioni Proteina rigida Ligando rigido Docking rigido Applicazioni Docking di molecole piccole e poco flessibili Docking di data base di molti conformeri Esempi Programmi DOCK e HEX basati su complementarietà geometriche Matching delle caratteristiche geometriche delle due molecole (proteina ligando) nello spazio A a c B C D b receptor ligand

13 Docking flessibile La flessibilità del ligando è limitata agli angoli di torsione e alle conformazioni di anello Insieme delle possibili conformazioni Docking rigido di ciascuna delle possibili conformazioni del ligando Frammentazione del ligando Costruzione incrementale (FlexX) Search conformazionale esplicito Monte Carlo (LigandFit) Algoritmo genetico (AutoDock, GOLD)

14 Docking flessibile

15 Gli step nel Docking La tecnica del Docking segue una serie di step successivi: Calcolo dei gradi di libertà, 6 per il docking rigido, e frammentazione del ligando per trovare le regioni di snodo nel docking flessibile Calcolo delle superfici molecolari per trovare la complementarita geometrica Calcolo delle forze di legame ( VdW, elettrostatiche, idrofobiche, legami idrogeno) Posizionamento del ligando nella zona d interazione Analisi dei risultati

16 Gli step nel Docking Gradi di libertà Superficie molecolare Interazioni elettrostatiche

17 Gli step nel Docking Legami Idrogeno e interazioni idrofobiche Posizionamento del ligando

18 Come funzionano i programmi di Docking? I programmi di docking utilizzano degli ALGORITMI per generare una risposta al problema dell interazione tra due molecole Esistono numerosissimi programmi per il docking: Dock Docking proteina-proteina (complementarità geometrica) Hex Docking proteina-proteina (complementarità geometrica e elettrostatica) AutoDock Docking proteina ligando (tratta il ligando come una molecola flessibile, algoritmo genetico ) Flexm Docking proteina ligando (tratta il ligando come una molecola flessibile, algoritmo incrementale) Questi programmi si differenziano tra loro per l implementazione dell algoritmo di ricerca del migliore complesso molecola-molecola

19 Che cos è un algoritmo? Definizione di algoritmo: In informatica, con il termine algoritmo si intende un metodo per la risoluzione di un problema adatto a essere implementato sotto forma di programma. Intuitivamente, un algoritmo si può definire come un procedimento che consente di ottenere un risultato atteso eseguendo, in un determinato ordine, un insieme di passi semplici corrispondenti ad azioni scelte solitamente da un insieme finito

20 L algoritmo genetico ibrido con la ricerca locale del fenotipo è chiamato Lamarckian Genetic Algorithm (LGA), poiché utilizza la nozione Lamarckiana che i caratteri che determinano l adattamento di un individuo al suo ambiente possono essere ereditati dalla progenie. Jean Antoine Baptiste Pierre de Lamarck

21 Algoritmi Genetici (GA) Sono algoritmi di ricerca del minimo globale basati sull analogia con la genetica e l evoluzione Nel docking la posizione relativa del ligando rispetto alla proteina è descritta dalle seguenti variabili: - tre coordinate del centro di massa - tre angoli che descrivono l orientamento nello spazio - angoli di torsione dei legami rotabili Nell analogia genetica lo stato del ligando corrisponde al genotipo, le sue coordinate al fenotipo Nel docking la fitness è rappresentata dall energia di interazione del ligando con la proteina

22 Algoritmi Genetici (GA) Nell algoritmo genetico lo stato del ligando corrisponde al cromosoma e ognuna delle variabili ad un gene In genere le variabili sono rappresentate in cifre binarie Si parte da una certo numero di stati del ligando (insiemi di coordinate angoli di rotazione e angoli di torsione) cioè di cromosomi, ovvero individui che costituiscono una popolazione Coppie di individui (stati del ligando) vengono accoppiate mediante processi di crossover e variazione casuale di una cifra Si passa così ad una generazione successiva che corrisponde ad una nuova popolazione Si procede così ottenendo tante nuove popolazioni successive sempre più sane cioè con energia minore Dopo un certo numero di generazioni si valuta l individuo con l energia più bassa

23 Algoritmi Genetici (GA) Si crea una popolazione iniziale di M conformazioni: Ciascuna conformazione è rappresentata da un cromosoma O OH Nel cromosoma, ciascuna torsione può essere rappresentata da uno dei 2 5 =32 valori corrispondenti a numeri binari a 5 cifre Si calcola la funzione di fitness ( l energia) per ciascun cromosoma

24 Algoritmi Genetici (GA) Si applicano alla nuova popolazione gli operatori genetici: Sono propagati gli individui con la miglior fitness Crossover: Mutazione puntiforme: Si ripete la procedura su nuove popolazioni

25 AutoDock Automated Docking of Flexible Ligands to Receptors Una valutazione rapida dell'energia viene ottenuta precalcolando i potenziali atomici di affinità per ogni atomo della molecola di substrato nel modo descritto da Goodford. Questo metodo studia la superficie della proteina non con una sfera neutra, ma piuttosto con una sonda più realistica dotata di forma e di carica. Le molecole della sonda usate includono: acqua, il gruppo metilico, l'azoto amminico, l'ossigeno carbossilico e l'ossidrile. I profili di superficie sono disegnati ai vari livelli di energia. Il metodo comprende anche il contributo dei legami a idrogeno. Nella procedura di AutoGrid la proteina viene posizionata all'interno di una griglia tridimensionale e un atomo sonda viene disposto in ogni punto di griglia. L'energia di interazione di questo atomo sonda con la proteina viene assegnata al punto di griglia. Una griglia di affinità viene calcolata per ogni tipo di atomo del substrato, tipicamente carbonio, ossigeno, azoto ed idrogeno, così come una griglia di potenziale elettrostatico, sia usando una carica puntiforme +1 come sonda, sia usando il metodo di Poisson-Boltzmann alle differenze finite del programma DelPHI. L'energetica di una particolare configurazione del substrato viene ottenuta tramite interpolazione tri-lineare dei valori di affinità degli otto punti di griglia che circondano ciascuno degli atomi del substrato. L'interazione elettrostatica viene valutata allo stesso modo, interpolando i valori del potenziale elettrostatico e moltiplicando per la carica sull'atomo (il termine elettrostatico valutato esclusivamente per permettere il controllo più fine delle cariche atomiche del substrato). Il tempo necessario per effettuare un calcolo di energia usando le griglie è proporzionale soltanto al numero di atomi del substrato ed è indipendente dal numero di atomi della proteina.

26 Drug design L utilizzo del computer sta alla base della progettazione dei farmaci. La bioinformatica e la chimica computazionale permettono di analizzare farmaci già esistenti e utilizzarli come template per sintetizzarne nuovi e sempre più efficaci. Il computer permette un analisi dettagliata della struttura tridimensionale sia dei composti che dei recettori. Nel Drug Design si utilizzano tutte le informazioni disponibili (proprietà chimico-fisiche, farmacologiche, effetti collaterali, ecc.) di principi attivi (Drug) noti o non noti, per progettare (Design) e quindi realizzare la sintesi di farmaci con migliori caratteristiche rispetto al tipo di malattia e ai principi attivi già conosciuti.

27 Drug design e Computer-Assisted Molecular Design(CAMD) o Modelling (CAMM) Mediante l utilizzo di adatti computer (workstations) e adeguati calcoli quantistici o di meccanica molecolare si ottiene una rappresentazione spaziale (3D) della molecola organica (il farmaco) nelle sue possibili conformazioni e della proteina (il recettore). Confronti tra molecole a struttura diversa (allineamento). Studio di interazioni molecola / recettore ( docking ). Vantaggi del DRUG DESIGN 1. Sintesi più mirata e specifica per ogni singola patologia 2. Riduzione dei costi di sperimentazione 3. Riduzione dei tempi sia di sintesi che di sperimentazione

28 Drug design e studio QSAR QSAR = Quantitative Structure Activity Relationships Nel drug design è importantissimo l utilizzo delle tecniche QSAR poiché attraverso calcoli matematici e statistici è possibile quantificare il rapporto tra la struttura della molecola in progettazione e l attività futura del farmaco stesso con un ottima approssimazione. ESEMPIO Y= b0 + b1x1 + b2x2 +.bnxn Y corrisponde all attività farmacologica del composto che è uguale alla somma di tutti i descrittori molecolari sia della struttura del recettore(b) e sia di quella del ligando(x). I descrittori molecolari della struttura corrispondo a tutte le interazioni atomiche che si trovano nel composto, ai gradi di libertà dei legami e alle caratteristiche chimico-fisiche di ogni atomo. Non tratteremo gli studi QSAR ma è importante conoscerne l esistenza

29 De novo drug design Le tecniche di "de novo design" hanno lo scopo di generare nuove strutture chimiche attraverso l estrapolazione diretta delle informazioni contenute nella struttura del sito attivo. La costruzione di nuove molecole è un processo che attualmente si basa largamente sul docking interattivo tramite l'impiego di computer. Fra tali metodi di analisi dell interazione bisogna ricordare il potenziale elettrostatico, le mappe di idrofobicità - idrofilia locale, l utilizzo di griglie di punti per la valutazione rapida dell'energia e la minimizzazione energetica di semplici strutture.

30 Virtual screening Il virtual screening è una tecnica computazionale usata nell ambito della ricerca nel campo del drug discovery. L approccio si avvale del test in silico di una libreria di contenete un elevato numero di composti chimici, al fine di identificare quelli che con maggiore affinità leghino una proteina target, che solitamente risulta essere un recettore o un enzima. Se si è in possesso di una banca dati di strutture di piccole molecole, usando il docking è possibile definire l affinità di ciascuna molecola per un dato recettore, con lo scopo di trovare possibili candidati per trilas clinici.