HEV ELISA DESCRIZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI

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1 DESCRIZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI Sui prodotti MP Diagnostics e relative confezioni si possono trovare i simboli grafici descritti di seguito. Sono i simboli generalmente utilizzati per l etichettatura dei dispositivi medici. Per informazioni più dettagliate consultare la norma britannica ed europea BS EN 980: HEV ELISA DATA DI REVISIONE: 05/05 MBK 0011-ITA T (96 kit per test) NOME E USO PREVISTO Nota: modifiche evidenziate HEV ELISA di MP Diagnostics (MPD) è un test immunoenzimatico indicato per il rilevamento degli anticorpi IgG anti virus dell Epatite E (HEV) nel siero o nel plasma umano. Utilizzare entro Sinonimo: Data di scadenza Codice partita Sinonimi: Numero di lotto: Numero di partita Limitazione di temperatura Produttore Contiene il necessario per l esecuzione di <n> analisi Non riutilizzare Dispositivo medico diagnostico in vitro Numero di catalogo Attenzione. Vedere le Istruzioni per l uso Rappresentante autorizzato per la Comunità Europea Vedere le Istruzioni per l uso INTRODUZIONE La diagnosi dell epatite virale dovuta a infezione da virus dell Epatite A (HAV) e da virus dell Epatite B (HBV) è possibile grazie alla disponibilità di test sierologici affidabili e sensibili per i rispettivi marker. L assenza clinica e diagnostica di marker sia per l HAV che per l HBV ha indotto al riconoscimento di un altro gruppo di agenti dell epatite virale, denominati collettivamente virus dell epatite non-a, non-b (NANBH) (1,2). Due forme epidemiologicamente distinte di NANBH sono state individuate come trasmissibili per via parenterale o per via fecale/orale (3,4,5). Il virus responsabile della maggior parte dei casi di epatite NANBH trasmessa per via parenterale è stato clonato (6). La clonazione di questo agente, denominato virus dell Epatite C (HCV), ha dato origine allo sviluppo di test diagnostici per il rilevamento della presenza degli anticorpi anti HCV. Una seconda forma di NANBH, distinta sul piano epidemiologico e denominata NANBH trasmessa per via enterale (ET-NANBH), è stata riscontrata in alcune nazioni in via di sviluppo. I principali focolai epidemici dell epatite ET- NANBH sono stati rilevati in Asia, nell ex Unione Sovietica, in America Centrale e in Africa (7,8). Il decorso della patologia è generalmente acuto e autolimitante, senza lo sviluppo di sequele croniche. È tuttavia caratterizzato da una elevata incidenza della mortalità (10-20%) nelle donne incinte (7) e da una mortalità pari all 1-2% nella popolazione generale, ossia 10 volte superiore al tasso di mortalità dell HAV. L agente eziologico dell ET-NANBH è stato clonato (9) ed è stato denominato virus dell epatite E (HEV). La clonazione dell HEV da parte degli scienziati ha portato all identificazione di epitopi virali comuni utili ai fini dello sviluppo di un test diagnostico per gli anticorpi anti HEV (10). L HEV ELISA DI MP Diagnostics sfrutta questi antigeni HEV ricombinanti, presenti nella regione strutturale del genoma virale, per rilevare la presenza degli anticorpi HEV. 1 PRINCIPI CHIMICI E BIOLOGICI DELLA PROCEDURA I pozzetti delle strisce di micropiastre in polistirene sono rivestiti da tre antigeni HEV ricombinanti che corrispondono alle regioni strutturali del virus dell Epatite E. Il siero o il plasma umano, diluiti in soluzione tampone, vengono incubati in questi pozzetti rivestiti. Gli anticorpi specifici dell HEV, se presenti, si legano alla fase solida degli antigeni HEV. I pozzetti vengono quindi accuratamente lavati per rimuovere ogni residuo di sostanze non legate e un anticorpo anti IgG umane purificato per affinità e coniugato con perossidasi di rafano viene aggiunto ai pozzetti. Questo anticorpo coniugato si lega a qualsiasi complesso antigene-anticorpo precedentemente formato e gli anticorpi coniugati non legati in eccesso vengono rimossi con il lavaggio. Una soluzione di substrato contenente 3, 3, 5, 5 - tetramethylbenzidine (TMB) viene quindi aggiunta in ciascun pozzetto. La presenza di anticorpi specifici viene rivelata mediante la comparsa di colore blu dopo l aggiunta del substrato. La reazione viene arrestata tramite l aggiunta di acido cloridrico. L intensità del colore viene misurata con uno spettrofotometro a 450 nm ed è proporzionale alla quantità di anticorpi presenti nel campione.

2 COMPONENTI DEL KIT Descrizione dei componenti MICROPIASTRA HEV Dodici strisce a 8 pozzetti per piastra, sigillate in confezioni di alluminio con materiale assorbente. Ciascun pozzetto della micropiastra contiene proteine HEV ricombinanti adsorbite. Conservare a 2-8 C. CONTROLLO NON REATTIVO Siero umano normale inattivato, non reattivo per anti-hcv, anti-hev, HBsAg e anti-hiv 1. Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti. Conservare a 2-8 C. CONTROLLO REATTIVO Siero umano inattivato contenente anticorpi IgG ad alto titolo specifici per HEV. Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti. Conservare a 2-8 C. DILUENTE Soluzione salina tris contenente siero di capra normale trattato al calore, albumina di siero bovino e stabilizzanti. Contiene Bronidox TM come conservante. Conservare a 2-8 C. SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA (20X) Soluzione salina tamponata al fosfato con Tween-20. Contiene cloroacetamide come conservante. Conservare a 2-8 C. CONIUGATO Anticorpi anti IgG umane di capra coniugate con perossidasi di rafano. Contiene thimerosal come conservanti. Conservare a 2-8 C. SUBSTRATO Tampone contenente 3, 3, 5, 5 - tetramethylbenzidine. Conservare al buio a 2-8 C. SOLUZIONE DI ARRESTO Soluzione di acido cloridrico 1N. Conservare al buio a 2-8 C. COPERCHI PER PIASTRE Coperchi adesivi per micropiastre da applicare durante l incubazione. MANUALE DI ISTRUZIONI Quantità fornita 1 piastra (96 pozzetti) 1 provetta (160 Øl) 1 provetta (120 Øl) 1 flacone (100 ml) 1 flacone (120 ml) 1 provetta (70 Øl) 1 flacone (12,5 ml) 1 flacone (30 ml) 4 pezzi 1 copia AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per uso professionale. 3. Per informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi leggere le etichette apposte sui prodotti. NORME DI SICUREZZA ATTENZIONE: Questo kit contiene sostanze di origine umana. Nessun metodo di prova è in grado di garantire con assoluta certezza che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettono infezioni. MANEGGIARE TUTTI I CAMPIONI D ANALISI, NONCHÉ I CONTROLLI REATTIVI E NON REATTIVI, COME AGENTI POTENZIALMENTE INFETTIVI. Si consiglia di manipolare i componenti e i campioni di analisi nel rispetto delle normali pratiche operative di laboratorio. Lo smaltimento del materiale dovrà essere effettuato in conformità alle procedure di sicurezza stabilite. Il controllo reattivo e il controllo non reattivo contengono thimerosal e sodio azide. Il sodio azide può reagire con il rame o il piombo utilizzati in alcuni impianti idraulici con la conseguente formazione di sali esplosivi. Sebbene le quantità utilizzate in questo kit siano limitate, si raccomanda comunque di smaltire sempre i materiali contenenti azide in abbondante acqua corrente onde evitare l accumulo di metallo-azide nell impianto idraulico. 1. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali. 2. Non pipettare con la bocca. 3. Maneggiare i campioni d analisi, le micropiastre, i controlli reattivi e non reattivi come agenti potenzialmente infettivi. 4. Indossare indumenti da laboratorio e guanti monouso durante l esecuzione delle analisi. I guanti devono essere gettati negli appositi contenitori a rischio biologico. Lavarsi accuratamente le mani al termine dell operazione. 5. Si raccomanda di eseguire il test in una struttura apposita per test con rischio di contaminazione biologica. 6. Evitare il contatto dei materiali con cibi e bevande. 7. In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente con abbondante acqua e richiedere assistenza medica. 8. In caso in ingestione o di contatto dei materiali contaminati con ferite aperte o altre lacerazioni cutanee, consultare immediatamente il medico. 9. Non aggiungere mai acqua alla soluzione di arresto. Bronidox TM è un marchio di Henkel Chemical Co. 2

3 10. Asciugare immediatamente ogni versamento di materiale potenzialmente infettivo con carta assorbente e tamponare l area contaminata con una soluzione di ipoclorito di sodio all 1% prima di riprendere il lavoro. In presenza di versamenti di sostanze contaminanti acide, asciugare l area con carta assorbente prima di applicare l ipoclorito di sodio. Tutto il materiale usato (inclusi i guanti monouso) dovrà essere smaltito come materiale a rischio biologico. Non autoclavare il materiale contenente ipoclorito di sodio. 11. Prima dell eliminazione, sterilizzare in autoclave tutto il materiale utilizzato e contaminato a 121 C a 15 p.s.i. per 30 minuti. In alternativa, decontaminare i materiali in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% per minuti prima di gettarli negli appositi contenitori a rischio biologico. 12. Decontaminare tutti i reagenti e le sostanze chimiche impiegate in una soluzione di ipoclorito di sodio con una concentrazione finale pari almeno all 1%. Lasciare agire per 30 minuti per garantire un efficace decontaminazione. PRECAUZIONI DI IMPIEGO 1. Per ottenere prestazioni ottimali dal test occorre SEGUIRE RIGOROSAMENTE le procedure illustrate nel presente Manuale di istruzioni. Qualsiasi deviazione dalla procedura può provocare risultati erronei. 2. NON MODIFICARE O SCAMBIARE REAGENTI DI KIT APPARTENENTI A LOTTI DIVERSI. I controlli, il coniugato e le micropiastre sono stati abbinati per ottenere prestazioni ottimali. Utilizzare unicamente i reagenti forniti con il kit. 3. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza riportata sulla confezione. 4. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali poiché ne potrebbero derivare risultati erronei nonché la prematura riduzione della durata di conservazione del prodotto. Utilizzare tecniche asettiche, incluse pipette o punte di pipette monouso, per l aspirazione dei materiali dai flaconi. 5. Per evitare una contaminazione incrociata, cambiare la punta della pipetta tra un campione e l altro e non toccare le estremità delle strisce, il bordo dei pozzetti o il liquido contenuto nei pozzetti con le dita o con le punte delle pipette. 6. Tutto il materiale di vetro che sarà utilizzato con i reagenti dovrà essere lavato con acido cloridrico 2M e sciacquato abbondantemente con acqua distillata o deionizzata prima dell uso. 7. Per ottenere risultati ottimali, lasciare che tutti i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente (25 C ± 3 C) prima dell uso. Riportarli ad una temperatura di 2-8 C subito dopo l uso. 9. Tutti i reagenti dovranno essere miscelati accuratamente prima dell uso. 10. La soluzione di lavoro del coniugato e il tampone di lavaggio diluito devono essere preparati subito prima dell uso. 11. Evitare di esporre i reagenti o di eseguire i test in un ambiente contenente un grado elevato di vapori di disinfettanti chimici (es. vapori di ipoclorito) durante le fasi di conservazione e incubazione. Il contatto inibisce la reazione cromatica. Non esporre i reagenti ad eccessiva luminosità. 12. Non rimuovere le micropiastre delle apposite confezioni se non immediatamente prima dell uso. Le strisce aperte e non utilizzate devono essere conservate a 2-8 C nel portastrisce dotato di materiale assorbente. 13. I controlli del kit devono essere analizzati contemporaneamente ai campioni dei pazienti per ogni ciclo di analisi. 14. Evitare accuratamente di toccare il bordo del pozzetto o di contaminarlo con schizzi di coniugato. Non soffiare materiale fuori dalle micropipette. Laddove possibile, si raccomanda di utilizzare il pipettaggio inverso. 15. L utilizzo di campioni altamente emolizzati, di siero non completamente coagulato, di campioni di plasma contenenti fibrina o di campioni con contaminazione microbica può essere causa di risultati erronei. 16. NON UTILIZZARE INCUBATRICI AD ACQUA PER INCUBARE LE PIASTRE. 17. Non utilizzare incubatrici al CO Durante l incubazione a 37 C, è necessario impedire l evaporazione. Coprire pertanto le piastre con i coperchi adesivi forniti in dotazione. 19. Evitare la ripetuta apertura e chiusura della porta dell incubatrice durante le fasi di incubazione. 20. Evitare di conservare la soluzione di stop in un piatto piano o di versarla in un flacone di scorta dopo l utilizzo. 21. Accertarsi che il fondo della piastra sia pulito e asciutto e che non si siano formate bolle sulla superficie del liquido prima di leggere la piastra. Rimuovere le eventuali bolle presenti nel pozzetto picchiettando delicatamente. 22. In caso di impiego di strumentazione automatica, accertarsi che questa sia validata prima dell uso. 23. Si raccomanda vivamente di condurre la manutenzione ordinaria del sistema di aspirazione / lavaggio per evitare ogni rischio di contaminazione dai campioni altamente reattivi ai campioni non reattivi. 8. Utilizzare unicamente acqua ionizzata, distillata o comunque di qualità idonea per la diluizione dei reagenti. 3

4 ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE 1. Conservare il kit HEV ELISA di MPD e i relativi componenti a 2-8 C quando non sono utilizzati. 2. Se conservati alla temperatura di 2-8 C, tutti i reagenti di analisi e le micropiastre mantengono la stabilità fino alla data di scadenza indicata sul kit. Non congelare i reagenti. 3. La conservazione della Soluzione di Lavaggio concentrata (20x) a 2-8 C può provocare la formazione di cristalli che dovranno essere sciolti riscaldando il concentrato a 37 C prima dell uso. 4. La conservazione del diluente a 2-8 C può provocare la formazione di precipitato. Questo, tuttavia, non avrà alcuna influenza sulle prestazioni del kit. 5. Le strisce di micropiastre aperte e non utilizzate devono essere conservate a 2-8 C con il materiale assorbente in dotazione in una confezione chiusa. RACCOLTA, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI I campioni devono essere conservati a 2-8 C se il test deve essere eseguito entro 7 giorni dalla raccolta oppure congelati a -20 C o temperature inferiori se il test è previsto per una data successiva. Utilizzare preferibilmente campioni trasparenti e non emolizzati. I campioni lipemici, itterici o contaminati (per via particellare) devono essere filtrati (0,45Øm) o centrifugati prima dell analisi. Il siero dei pazienti può essere inattivato, tuttavia ciò non è indispensabile per ottenere risultati ottimali. Per l inattivazione, procedere nel modo seguente: 1. Allentare i cappucci dei contenitori del siero. 2. Riscaldare il siero a 56 C per 30 minuti in un bagno d acqua. 3. Lasciare raffreddare il siero prima di serrare nuovamente i cappucci. 4. Fino al momento dell analisi, il siero può essere conservato congelato. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 1. SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO a. La SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO deve essere preparata subito prima dell uso. b. Per preparare il coniugato diluito, diluire il coniugato 1:500 nel diluente fornito con il kit, ad esempio 10 Øl di coniugato in 5 ml di diluente. c. Utilizzare unicamente contenitori o provette in polipropilene. TABELLA DI PREPARAZIONE DEL CONIUGATO Numero di test Vol. di coniugato (Øl) Vol. di diluente (ml) 24 10,0 5, ,0 8, ,0 10, ,0 12,0 2. TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO a. Il TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO deve essere preparato subito prima dell uso. b. Diluire 1 volume di SOLUZIONE DI LAVAGGIO CENCENTRATA in 19 volumi di acqua distillata (qualità idonea per reagenti). Mescolare accuratamente. Per il lavaggio di 1 piastra sono necessari circa 400 ml di tampone di lavaggio. Si raccomanda di non sottoporre il siero dei pazienti a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento prima del test. MATERIALI OCCORRENTI MA NON PRESENTI NEL KIT 1. Carta assorbente da banco monouso e salviette di carta. 2. Provette o contenitori in polipropilene. 3. Pipette graduate: 5 ml, 10 ml. 4. Pipetta multicanale in grado di erogare 50 Øl, 100 Øl e 200 Øl. 5. Pipetta in grado di erogare Øl. 6. Puntali di pipette monouso. 7. Serbatoi di reagente (vaschette) con capacità di 25 ml. 8. Acqua deionizzata o distillata, di qualità idonea per reagenti. 9. Matracci: 500 ml, 1 litro. 10. Un incubatore da 37 C. 11. Lettore di piastre per microanalisi a lunghezza d onda doppia (A 450 -A 620 ) o singola (A 450 ). 12. Soluzione di ipoclorito di sodio (5%) o candeggina liquida per uso domestico. 4

5 PROCEDURA DI ANALISI IMPORTANTE:- Le analisi immunologiche di questo tipo sono sensibili alla temperatura e soggette a vincoli temporali. La rigorosa osservanza della presente procedura garantisce prestazioni ottimali dell analisi. Qualsiasi deviazione dalla procedura raccomandata può provocare risultati erronei. 1. Estrarre la micropiastra dalla confezione in alluminio. B. Lavatore manuale per micropiastre - Aspirare completamente il contenuto di tutti i pozzetti abbassando lentamente la punta dell aspiratore fino al fondo di ciascun pozzetto. FARE ATTENZIONE A NON GRAFFIARE LA SUPERFICIE DEI POZZETTI. Riempire l intera piastra con almeno 300 Øl per ciascun pozzetto, quindi aspirare immediatamente nello stesso ordine. Eseguire questo ciclo per sei (6) volte. 2. Agitare il campione e controllare le provette prima dell uso. 3. Riempire una vaschetta con DILUENTE. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 Øl di DILUENTE a ciascun pozzetto. 4. I pozzetti A1 e B1 sono per i BIANCHI NON VERSARE CAMPIONI IN QUESTI POZZETTI. Aggiungere ulteriori 10 Øl di diluente in questi pozzetti. 5. Aggiungere 10 Øl di campione al pozzetto assegnato, iniziando dal pozzetto H1. Ne risulterà una diluizione finale del campione di 1: 21. NON INTRODURRE CAMPIONE NEI POZZETTI VUOTI. 6. Una volta aggiunto il campione di analisi, aggiungere 10 Øl di CONTROLLO NON REATTIVO per pozzetto nei pozzetti C1, D1 & E Øl 10 Øl 10 Øl 10 Øl 12. Asciugare a fondo capovolgendo la micropiastra e picchiettando energicamente sulla carta assorbente. Tutti i residui di tampone di lavaggio della piastra dovranno essere asciugati. La permanenza di residui di tampone di lavaggio delle piastre potrebbe impedire la formazione del colore durante l incubazione del substrato. 13. Riempire una vaschetta con SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO in ciascun pozzetto. Applicare un nuovo coperchio sulla piastra. 14. Incubare la micropiastra per 30 minuti a 37 C (non utilizzare incubatori ad acqua a 37 C per l incubazione). 100 Øl 30 minuti 7. Aggiungere 10 Øl di CONTROLLO REATTIVO per pozzetto nei pozzetti F1 e G1. Mescolare accuratamente picchiettando delicatamente su tutti i lati della micropiastra, prestando attenzione a tenere la piastra in posizione orizzontale sul banco di lavoro. 8. Coprire attentamente la micropiastra con il coperchio in dotazione per impedire l evaporazione durante l incubazione. 10 Øl 15. Togliere il coperchio dalla piastra e gettarlo via. Ripetere la procedura di lavaggio indicata ai punti 11 e Riempire un serbatoio di reagente con SOLUZIONE DI SUBSTRATO. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI SUBSTRATO in ciascun pozzetto. Applicare un coperchio sulla piastra. 300 Øl per pozzetto x Øl 9. Incubare per 30 minuti a 37 C (per l incubazione non utilizzare incubatrici ad acqua a 37 C). 30 minuti 17. Incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente (25 ± 3 C). 15 minuti 10. Preparare LA SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO secondo quanto illustrato nella PREPARAZIONE DEI REAGENTI prima di lavare la micropiastra. 11. Rimuovere e gettare il coperchio, quindi lavare la micropiastra con il TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO adottando l uno o l altro metodo raccomandato: A. Lavatore automatico o semiautomatico per micropiastre - Lavare sei (6) volte con almeno 300 Øl per pozzetto ad ogni lavaggio. 300 Øl per pozzetto x Togliere il coperchio dalla piastra e gettarlo via. 19. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ØI di SOLUZIONE DI ARRESTO in ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente picchiettando sulla piastra. 20. Determinare l assorbanza per ciascun pozzetto a 450 nm. Se si utilizza una strumentazione a doppio filtro, la lunghezza d onda di riferimento sarà 620 nm. 100 Øl NOTA: La lettura dell assorbanza deve essere effettuata entro 10 minuti dall aggiunta della SOLUZIONE DI ARRESTO. 5

6 CONTROLLO QUALITÀ 1. Si raccomanda di effettuare l analisi del BIANCO e del CONTROLLO REATTIVO in duplicato e l analisi del CONTROLLO NON REATTIVO in triplicato, su ciascuna piastra e per ogni ciclo di campioni. 2. I valori del bianco devono avere un assorbanza pari a 0, I valori del controllo non reattivo devono avere un assorbanza di 0,100 dopo la sottrazione del bianco. 4. Almeno 2 dei 3 valori di controllo non reattivo devono avere un assorbanza di 0,100 dopo la sottrazione del bianco. 5. Ciascuno dei due valori di controllo reattivo deve avere un assorbanza pari a 0,700 2dopo la sottrazione del bianco. Qualora 1 o più valori del controllo reattivo si discostino per oltre il 30% dalla rispettiva media di controllo, il ciclo si intenderà nullo e dovrà essere ripetuto. 6. Perché l analisi sia considerata valida, la differenza tra l assorbanza media del controllo reattivo e del controllo non reattivo (RC x -NRC x) deve essere almeno uguale a 0,600. In caso contrario, la tecnica può essere considerata sospetta e l analisi dovrà essere ripetuta. In presenza di valori RC x - NRC x costantemente bassi, si può sospettare un deterioramento dei reagenti. RISULTATI Ai fini del calcolo e dell interpretazione dei risultati, ciascuna micropiastra dovrà essere considerata singolarmente, a prescindere dal numero di piastre analizzate contemporaneamente. PRIMA DELL INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI, DAI VALORI DI ASSORBANZA DEI CONTROLLI E DEI CAMPIONI OCCORRE SOTTRARRE I VALORI DELL ASSORBANZA MEDIA DEL BIANCO. La presenza o l assenza di anticorpi IgG specifici per l HEV viene stabilita mettendo a confronto l assorbanza dei campioni con il VALORE DI CUT-OFF della piastra. IL VALORE DI CUT-OFF per HEV ELISA di MPD è calcolato come 0,500 + l assorbanza media del controllo non reattivo. CALCOLO DEI RISULTATI 1. Calcolo dell assorbanza media dei controlli non reattivi (NRC x ) Esempio: Pozzetto n. Assorbanza C1 0,048 D1 0,046 E1 0,047 Totale 0,141 Media 0,141/3 = 0,047 (NRC x ) a. I valori del singolo controllo non reattivo devono essere di 0,100. Se un valore di controllo non reattivo non soddisfa uno dei due criteri sopra menzionati, deve essere escluso in quanto aberrante. Sarà quindi necessario ripetere il calcolo della media dei controlli non reattivi (RC x) utilizzando i singoli valori rimanenti di controllo non reattivo. Tali valori devono soddisfare i criteri di cui sopra. Diversamente l analisi è considerata nulla e deve essere ripetuta. 2. Calcolo dell assorbanza media dei controlli reattivi (RC x ) Esempio: Pozzetto n. Assorbanza F1 1,048 G1 1,056 Totale 2,104 Media 2,104/2 = 1,052 (RC x) a. Il singolo controllo reattivo deve essere pari a 0,700. Se un solo valore di controllo reattivo non soddisfa entrambi i criteri sopra menzionati, l analisi è considerata nulla e deve essere ripetuta. 3. Calcolo della differenza tra RC x e NRC x. Esempio: NRC x = 0,047 RC x = 1,052 RC x-nrc x = 1,052-0,047 = 1,005 Perché l analisi sia considerata valida, il valore RC x - NRC x deve essere 0,600. In caso contrario, si può sospettare che sia stata utilizzata una tecnica impropria o che i reagenti si siano deteriorati e l analisi dovrà essere ripetuta. 4. Calcolo del valore di CUT-OFF. Valore di CUT-OFF = 0,500 + NRCx Esempio: NRC x = 0,047 Valore di CUT-OFF = 0, ,047 = 0,547 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1. I campioni con valori di assorbanza inferiori al valore di CUT-OFF sono considerati Non-Reattivi da HEV ELISA di MPD. 2. I campioni con valori di assorbanza superiori o uguali al valore di CUT-OFF sono considerati inizialmente reattivi in base ai criteri di HEV ELISA di MPD e devono essere sottoposti a nuovo test in duplicato, prima dell interpretazione. 3. I campioni risultati reattivi con il nuovo test dovranno essere interpretati come ripetutamente reattivi per gli anticorpi anti HEV in base ai criteri HEV ELISA di MPD. 4. I campioni inizialmente reattivi che invece risultino Non- Reattivi con il nuovo test sono considerati negativi secondo i criteri HEV ELISA di MPD. 6

7 CARATTERISTICHE ANALITICHE SPECIFICHE Dalle analisi effettuate su campioni di donatori di sangue random provenienti da aree non endemiche come la Germania e l Australia è emersa una tendenza piuttosto bassa alla siero prevalenza, attorno all 1-2%. In paesi come la Cina e Hong Kong, dove si verificano invece focolai epidemici di HEV durante la stagione delle piogge, la siero prevalenza è più alta, raggiungendo il 15% circa. La siero reattività al test HEV ELISA di MPD indica una precedente esposizione. La siero reattività fra gli individui sani di popolazioni a basso rischio si attesta su livelli piuttosto bassi, circa < 1%, mentre la siero reattività fra gli individui sani in aree endemiche raggiunge valori leggermente più alti. Una quota significativa di infezioni HEV sono asintomatiche, il che spiega la siero reattività in assenza di condizioni patologiche. LIMITI DELLA METODICA I risultati ripetutamente reattivi ottenuti con il test HEV ELISA di MPD costituiscono la prova presuntiva della presenza di anticorpi anti HEV nel campione. Un risultato NON-REATTIVO ottenuto con il test HEV ELISA di MPD indica l assenza probabile di anticorpi rilevabili anti-hev nel campione. Un risultato NEGATIVO non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HEV. Con un kit di analisi di questo genere è possibile sospettare risultati falsamente reattivi. La proporzione di falsi reattivi dipende dalla sensibilità e dalla specificità del kit. Nella maggior parte dei test di screening, maggiore è la prevalenza di anticorpi in una popolazione, minore è la proporzione di campioni falsamente reattivi. ESCLUSIONE DI GARANZIA E GARANZIA LIMITATA ESPRESSA Il produttore non fornisce altra garanzia per il kit, tranne l uso come dosaggio diagnostico in vitro nel quadro delle specifiche e delle limitazioni indicate nel Manuale di istruzioni del prodotto, sempre se viene usato seguendo le istruzioni ivi fornite. Il produttore non fornisce alcuna garanzia, espressa o implicita, compresa qualsiasi garanzia espressa o implicita di commerciabilità, adeguatezza all uso o utilità implicita ad altri scopi. Il produttore riconosce solo la sostituzione del prodotto o il rimborso del prezzo di acquisto del prodotto stesso. Il produttore non potrà essere ritenuto responsabile nei confronti dell acquirente o di terzi per danni, lesioni o danni economici di qualsiasi entità comunque causati dal prodotto nell uso o nell applicazione sopra indicati. Il produttore non è in grado di garantire, in forma implicita o esplicita, che questo prodotto non viola i diritti di proprietà intellettuale di terzi. PROBLEMI TECNICI/RECLAMI In caso di problemi tecnici o di reclami, attenersi alla seguente procedura: 1. Prendere nota del numero di lotto e della data di scadenza dei kit. 2. Conservare i kit e risultati ottenuti. 3. Contattare il più vicino centro MP Biomedicals o il proprio distributore locale. BIBLIOGRAFIA 1. Feinstone, S., A.Z. Kapikian, R.H. Purcell, H.J. Alter e P.V. Holland Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. New England Journal of Medicine. 292: Prince, A.M., G.F. Grady e C.Hazzi Long-incubation post-transfusion hepatitis without serological evidence of exposure to hepatitis B virus. Lancet 2: Alter, H.J., R.H. Purcell, P.V. Holland e H. Popper Transmissible agent in non-a, non-b hepatitis. Lancet 1: Balayan, M.S., A.G. Andzhapandze, S.S. Savinskaya, E.S. Ketiladze, D.M. Braginski, A.P. Savinow, V.F. Poleschuk Evidence for a virus in non-a, non-b hepatitis transmitted via the fecal oral route. Intervirology 20: Tabor, E., R.J. Gerety, J.A. Drucker, et al Transmission of non-a, non-b hepatitis from man to chimpanzee. Lancet 1: Choo, Q.L., G. Kuo, A.J. Weiner, L.R. Overby, D.W. Bradley e M. Houghton Isolation of a cdna clone derived from a blood-borne non-a, non-b hepatitis genome. Science 244: Bradley, D.W Enterically-transmitted non-a, non-b hepatitis. pp In A.J. Zuckerman (ed) British Medical Bulletin 46(2). Churchill Livingstone, New York. 8. Purcell, R.H. e J.R. Ticehurst Enterically transmitted non-a, non-b hepatitis: Epidemiology and clinical characteristis. pp In A.J. Zuckerman (ed). Viral Hepatitis and Liver Disease. Alan R. Liss Inc., New York. 9. Reyes, G.R., M.A. Purdy, J.P. Kim, K.C. Luk, L.M. Young, K.E. Fry e D. Bradley Isolation of a cdna from the virus responsible for enterically-transmitted non-a, non-b hepatitis. Science 247: Yarbough, P.O., A.W. Tam, K.E. Fry, K. Krawczynski, K.A. McCaustland, D.W. Bradley e G.R. Reyes Hepatitis E virus: Identification of type-common epitopes. Journal of Virology 65:

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