RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

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1 RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin Art. No.: C0601 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 1. Campo di applicazione Per diagnostica in vitro. Il RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin è un test immuno-enzimatico per la rilevazione qualitativa di enterotossina Clostridium perfringens in campioni di feci. 2. Sintesi e spiegazione del test Il C. perfringens, come tutti gli altri clostridi, è un batterio a diffusione ubiquitaria che produce spore, gram positivo, anaerobico che si trova anche regolarmente nella flora intestinale dell'uomo. Si differenzia dagli altri clostridi per la mancanza di flagelli peritrichi. Si distinguono 5 tipi di Clostridium perfringens (A-E). Mentre per l'uomo sono significativi prevalentemente il tipo A e, in particolari circostanze (alimentazione, carenza di tripsina) il tipo C, che provocano l'enteritis necroticans, negli animali sono riscontrabili tutti i tipi. La suddivisione in questi gruppi è in relazione alla capacità di produrre le principali tossine (tossina alfa, beta, ipsilon e iota) che agiscono tutte in modo citotossico e necrotizzante. Oltre a queste quattro tossine principali, i ceppi di C. perfringens producono una serie di ulteriori tossine delle quali l'enterotossina, un grande polipeptide 35-kDa, è importante per l'uomo dal punto di vista patogenetico. La più nota, è una intossicazione dei generi alimentari provocata da questa enterotossina del C. perfringens (CPE). Con l'ingestione di cibi conservati in modo inadeguato, in particolare cibo precotto, si assumono grandi quantità di C. perfringens. Questi ultimi formano a loro volta grandi quantità di tossine con conseguente affezione intestinale diarroica e spasmi intestinali. La sintomatologia si manifesta circa 8 24 ore dopo l'ingestione del cibo contaminato e decresce dopo ulteriori 24 ore. Vomito, febbre ed emicrania sono sintomi concomitanti piuttosto rari. Oltre all'intossicazione dei generi alimentari causata da CPE, negli ultimi hanni si è assistito sempre di più alla diffusione di diarrea associata agli antibiotici (AAD) da C. perfringens in circa il 10 % dei casi e nel 5-20 % dei casi diarrea a manifestazione sporadica (SPOR), non causate da intossicazione alimentare. Questa forma di affezione diarroica che conduce alla Colite pseudomembranosa (PMC) ha un decorso notevolmente peggiore e più lungo (10-30 giorni), sempre più frequentemente associato a sangue e muco nelle feci. All'esame istologico di sezioni del tratto intestinale inferiore del colon e del retto, si riscontrano aree edematose generate da lesioni provocate dal CPE. Nuovi esami hanno mostrato che l'enterotossina può essere codificata sia in modo cromosomale che episomale, ma che contiene sempre la stessa sequenza di aminoacidi. Inoltre è stato scoperto che gli isolati presenti nelle intossicazioni alimentari formavano sempre CPE codificati in modo cromosomale, mentre gli isolati di pazienti affetti da AAD o SPOR formavano CPE codificate da plasmide. Le conseguenze chiaramente più gravi del CPE nelle AAD e SPOR sono presumibilmente riconducibili allo stato di salute dei portatori affetti già colpiti da altre patologie, anziani o immunocompromessi. RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

3 In particolare tra gli anziani, soprattutto tra i viaggiatori che rientrano dall'estero o anche tra i pazienti ricoverati in ospedale, si riscontra da un lato una maggiore sensibilità alla colonizzazione e dall'altro anche un alto numero di portatori cronici di Clostridium perfringens. Il test RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin rappresenta, insieme con il test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B, un ulteriore importante sistema di rilevazione per la determinazione di affezioni diarroiche associate agli antibiotici e sporadiche. Questo test consente una diagnosi radida e attendibile trovando quindi utile impiego nella decisione terapeutica. 3. Principio del test Nel test RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin gli anticorpi altamente specifici sono posizionati a sandwich. Sulla superficie del vano della micropiastra sono legati anticorpi specifici anti epitopi dell'enterotossina di C. perfringens. Una sospensione del campione di feci da esaminare viene inserita mediante pipetta insieme con un ulteriore anticorpo monoclonale anti enterotossina Clostridium perfringens, coniugato con perossidasi di rafano, per l'incubazione nel vano della micropiastra. Alla presenza di enterotossina Clostridium perfringens (CPE) si forma un complesso a sandwich composto dall'anticorpo immobilizzato, il CPE e l'anticorpo coniugato. Rimuovere gli anticorpi marcati con enzima non legati in un ulteriore lavaggio. Dopo l'aggiunta di substrato, l'enzima legato trasforma nei campioni positivi la soluzione incolore contenuta nei vani della micropiastra in una soluzione blu. Con l'aggiunta di reagente bloccante, avviene una variazione cromatica dal blu al giallo. L'estinzione è proporzionale alla concentrazione del CPE presente nel campione. 4. Contenuto della confezione I reagenti di una confezione bastano per 96 determinazioni Plate 96 Det. Micropiastra, 12 strisce per microtitolazione (separabili) in telaio di fissaggio; rivestimento con anticorpi specifici anti epitopi di enterotossina C. perfringens; Diluent ml Tampone di diluizione dei campioni, soluzione proteica tamponata NaCl; contiene 0,1 % NaN 3 ; pronto per l'uso; colorazione in rosso Wash 100 ml Tampone di lavaggio, soluzione tamponata al fosfato NaCl (conc. 10 volte); contiene 0,1 %Thimerosal Control + 1,8 ml Enterotossina C. perfringens inattivata; pronto per l'uso; colorazione in rosso Conjugate 10 ml Anticorpi monoclonali coniugati in perossidasi in soluzione proteica pronto per l'uso, colorazione in blu RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

4 Substrate 10 ml Perossido ureico/tmb; pronto per l'uso Stop 6 ml Reagente bloccante; 1 N acido solforico; pronto per l'uso 5. Reagenti e relativa conservazione Tutti i reagenti devono essere conservati a temperatura compresa tra 2 e 8 C e sono utilizzabili fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Il tampone di lavaggio diluito è conservabile per quattro settimane ad una temperatura compresa tra 2 8 C. Evitare la contaminazione microbica. Dopo la data di scadenza, non può essere più fornita alcuna garanzia di qualità. La busta in alluminio deve essere aperta con le forbici, in modo tale da non rimuovere la chiusura a clip. Le strisce da microtitolazione inutilizzate devono essrere subito nuovamente conservate nella busta in alluminio chiusa ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Evitare l'esposizione diretta alla luce del substrato incolore, per evitare la decomposizione o colorazione blu per autoossidazione. In caso di sopraggiunta colorazione blu il substrato non può più essere riutilizzato. 6. Reagenti aggiuntivi necessari - accessori richiesti 6.1. Reagenti - acqua distillata o deionizzata 6.2. Accessori - Ansa di inoculazione - Pipette monocanale (Art. Nr.: Z0001) - Vortex Mixer (opzionale, cfr 9.3.) - Micropipetta da μl e 1 ml in volume - Cilindro graduato (1000 ml) - Cronometro - Dispositivo di lavaggio per micropiastre o pipetta multicanale (300 µl) - Fotometro per micropiastre (450 nm, event. filtro di riferimento 600 nm) - Carta filtrante (carta da laboratorio) - Contenitore di rifiuti con soluzione di ipoclorito allo 0,5 % 7. Precauzioni Solo per diagnostica in vitro. RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

5 Questo test deve essere condotto esclusivamente da personale di laboratorio qualificato. Osservare le disposizioni per il lavoro nei laboratori medici. Attenersi rigorosamente alle istruzioni per l'uso nell'esecuzione del test. Il controllo positivo contenuto nel kit contiene enterotossina C. perfringens inattivata. Quest'ultimo, tuttavia, deve essere trattato come potenzialmente infettivo, analogamente ai campioni dei pazienti, e maneggiato in conformità alle disposizioni di sicurezza nazionali vigenti. Non introdurre con la bocca campioni o reagenti mediante pipetta, evitare il contatto con la cute lesa o con le mucose. Durante la manipolazione dei campioni indossare guanti monouso e lavare le mani dopo aver eseguito il test. Non fumare, mangiare o bere negli ambienti in cui si opera con i campioni o con i reagenti del test. Il tampone di diluizione dei campioni contiene 0,1 % NaN 3, il coniugato 0,1 % Kathon come conservante. Evitare il contatto con la pelle o con le mucose. Il tampone di lavaggio contiene Thimerosal allo 0,1 % come conservante. Evitare il contatto con la pelle o con le mucose Il perossido ureico è una sostanza che può provocare corrosioni. Maneggiare con cautela! Il reagente bloccante contiene 1 N acido solforico. Evitare il contatto con la pelle e con gli indumenti! In caso di contatto con la pelle lavare con acqua. Tutti i reagenti e materiali che entrano in contatto con campioni potenzialmente infettivi devono essere trattati con adeguato disinfettante o sottoposti a sterilizzazione a vapore per almeno un'ora a 121 C. ATTENZIONE: per evitare la formazione di gas velenosi, i residui liquidi contenuti nel reagente bloccante devono essere neutralizzati prima dell'immissione in una soluzione di ipoclorito. 8. Raccolta e deposito dei campioni Il materiale del test deve essere conservato ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino all'utilizzo. Qualora il materiale non possa essere utilizzato nel test entro 3 giorni, si raccomanda una temperatura di conservazione di 20 C o più fredda. Evitare il ripetuto congelamento e scongelamento del campione. Campioni di feci o prelievi rettali non devono essere riposti in contenitori da trasporto contenenti sostanze per il trasporto, conservanti, sieri animali, ioni metallici, agenti ossidanti o detergenti, in quanto potrebbero crearsi interferenze con il test RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin. Nell'inserimento dei prelievi rettali, assicurarsi che sia presente una quantità sufficiente di materiale fecale (ca. 100 mg) per RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

6 l'esecuzione del test. Nelle indagini ambientali devono essere prelevati anche campioni di feci di persone di contatto ininfluenti dal punto di vista clinico, al fine di identificare portatori asintomatici. 9. Esecuzione del test 9.1. Generalità Prima dell'utilizzo portare tutti i reagenti e la micropiastra Plate a temperatura ambiente (20 25 C). Rimuovere le strisce per microtitolazione dalla busta in alluminio solo dopo il raggiungimento della temperatura ambiente. Mescolare con cura i reagenti immediatamente prima dell'utilizzo. Dopo l'uso, conservare nuovamente le strisce per microtitolazione (nella busta chiusa) e i reagenti a temperatura compresa tra 2 e 8 C. La strisce per microtitolazione usate non possono essere riutilizzate. Reagenti e strisce per microtitolazione non devono essere utilizzati se l'imballaggio è danneggiato o se i contenitori non sono ermetici. Evitare il contatto diretto dei campioni con i componenti del kit per evitare la contaminazione incrociata. Evitare l'esposizione diretta all'irradiazione solare durante l'esecuzione del test. Si raccomanda di coprire o sigillare la piastra per microtitolazione per evitare la perdita per evaporazione Preparazione del tampone di lavaggio 1 parte di concentrato per tamponi di lavaggio Wash viene mischiata con 9 parti di acqua distillata. Eventuali cristalli presenti nel concentrato devono essere precedentemente disciolti per riscaldamento (bagnomaria a 37 C) Preparazione dei campioni Introdurre in una provetta graduata 1 ml di tampone di diluizione dei campioni RIDASCREEN Diluent 3. Introdurre le feci liquide in una pipetta monocanale (Art. Nr. Z0001) fino a superare di poco il secondo spessore (100 µl) e procedere alla sospensione nell'apposito tampone. In caso di feci solide rimuovere una quantità equivalente di feci (ca mg) con una spatola o ansa di diluizione monocanale e procedere alla sospensione. L'omogeneizzazione della sospensione di feci avviene o per introduzione ed espulsione mediante la pipetta monocanale o in alternativa miscelando con un Vortexmixer. Dopo aver lasciato brevemente in posa per la sedimentazione della particella di feci di grosse dimensioni, il supernatante di sospensione fecale così depurato può essere direttamente utilizzato nel test. Se il test viene eseguito con trattamento automatico Elisa tale sospensione deve essere priva di particelle. In questo caso si consiglia una centrifuga di 5000 upm (ca G) per 5 minuti. RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

7 9.4. Prima incubazione Dopo aver introdotto un numero sufficiente di cavità nei telai di fissaggio instillare nelle cavità 2 gocce (100 µl) di controllo positivo Control + del tampone di diluizione dei campioni Diluent 3 (= controllo negativo) o la sospensione del campione di feci. Aggiungere quindi 2 gocce (100 µl) di anticorpo enzima-coniugato Conjugate e dopo aver mischiato per 60 minuti incubare a temperatura ambiente (20 25 C) Lavaggio Un accurato lavaggio è importante per ottenere i giusti risultati e deve pertanto essere effettuato in stretta conformità con le istruzioni. Il prodotto di incubazione nelle cavità deve essere innanzitutto svuotato in un contenitore per rifiuti con ipoclorito per favorire la disinfezione. Tamponare quindi la piastra su carta assorbente per rimuovere l'umidità residua. Successivamente lavare per 5 volte con 300 µl di tampone di lavaggio. Dopo ogni lavaggio, provvedere al completo svuotamento tramite tamponatura con un punto di carta non utilizzato ancora asciutto. In caso di utilizzo di lavatrice automatica prestare attenzione alla corretta posizione del dispositivo sul tipo di micropiastra utilizzato. L'eventuale sospensione fecale non completamente priva di particelle prima del primo lavaggio deve essere quindi rimossa manualmente dalle cavità mediante espulsione, per evitare intasamento dell'ago di lavaggio. Durante il lavaggio, assicurarsi inoltre del completo assorbimento del liquido. Dopo l'ultimo lavaggio tamponare a fondo la piastra con carta assorbente o da laboratorio pulita per rimuovere l'umidità residua. Per ottenere risultati di lavaggio ottimali si raccomanda il lavaggio in modalità Overflow con almeno 600 μl di tampone di lavaggio per cavità e lavaggio. É possibile aumentare il numero dei lavaggi oltre ai 5 contribuendo, nel caso specifico, al conseguimento di risultati di lavaggio migliori Seconda incubazione Aggiunta di 2 gocce (100 µl) di substrato Substrate in tutti i vani. Incubare quindi la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) al buio. Con l'aggiunta di 1 goccia (50 µl) di reagente bloccante Stop in tutti i vani si procede poi all'arresto della reazione. Dopo un'accurata miscelazione (con dei leggeri colpi sul bordo della piastra) si procede alla misurazione dell'estinzione a 450 nm (opzionale: lunghezza d'onda di riferimento 600 nm). La taratura del valore zero deve avvenire contro aria - quindi senza micropiastra -. Indicazione : campioni di pazienti altamente positivi possono causare precipitati nerastri del substrato. RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

8 10. Controllo della qualità - Segni di scadenza dei reagenti Per il controllo della qualità eseguire controllo positivo e negativo ad ogni esecuzione del test, per garantire la stabilità del reagente e la corretta esecuzione del test. Il test è stato eseguito correttamente, quando il valore di estinzione (O.D.) del controllo negativo a 450 nm è inferiore a 0,2 e il valore misurato del controllo positivo a 450 nm è superiore a 0,8. Un valore del controllo negativo superiore a 0,2 può indicare un lavaggio insufficiente. Una discordanza dei valori richiesti può anche manifestarsi come segno di scadenza dei reagenti con l'opacizzazione o colorazione blu del substrato incolore prima dell'aggiunta nelle cavità. In caso di non conformità con i valori indicati, prima della ripetizione del test verificare quanto segue: periodo di conservazione dei reagenti utilizzati funzionalità dei dispositivi utilizzati (ad es. calibratura) corretta esecuzione del test controllo visivo dei componenti del kit per contaminazione o mancanza di ermeticità; non utilizzare una soluzione di substrato di colore blu. In caso di non conformità con tali condizioni dopo la ripetizione del test, rivolgersi al produttore o al distributore locale R-Biopharm. 11. Valutazione e interpretazione Calcolo del valore limite Per la determinazione del valore limite si sommano all'estinzione misurata del controllo negativo 0,15 le unità di estinzione. cut off = valore di estinzione del controllo negativo + 0, Risultato del test Sono valutati positivi i campioni con valore di estinzione superiore al 10 % rispetto al valore limite calcolato. Sono valutati valori limite e da ripetere i campioni con valore di estinzione superiore o inferiore rispetto al valore limite dell'ordine del 10 %. Qualora il risultato della ripetizione del test con un campione di feci fresco rientri nuovamente nell'area grigia, il campione deve essere considerato negativo. I campioni con valori inferiori al valore limite calcolato di più del 10 %, devono essere valutati negativi. RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

9 12. Limiti del metodo Il test RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin rileva l'enterotossina del Clostridium perfringens in campioni di feci. Non è possibile dedurre una relazione tra la proporzione del valore di estinzione rilevato e l'insorgenza o la gravità della sintomatologia clinica. I risultati ottenuti devono essere sempre interpretati in relazione al quadro clinico. Un risultato positivo non esclude la presenza di altri agenti patogeni infettivi. Un risultato negativo non esclude una possibile infezione da Clostridium perfringens. Tale risultato può essere causato dal rilascio intermittente dell'enterotossina o dalla scarsa quantità di tossina nel campione. Qualora sussista a livello anamnestico il fondato sospetto di una infezione da Clostridium perfringens, occorre esaminare un ulteriore campione di feci. Un risultato entro il valore limite può risultare dalla distribuzione disomogenea del batterio nel campione di feci. Pertanto, in tal caso, deve essere esaminata una seconda sospensione dello stesso campione o un ulteriore campione di feci. 13. Prestazioni opzionali Reattività incrociata Diversi germi patogeni del tratto intestinale sono stati esaminati con il Test RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin e non hanno rilevato alcuna reattività incrociata. Sono stati condotti esami con sospensioni batteriche che presentavano una concentrazione da 10 5 a 10 8 di organismi per ml. I risultati sono elencati nella Tabella 1. Tab. 1: Reazioni incrociate con microrganismi patogeni Germe testato Provenienza Risultato Sospensione Acinetobacter lwoffii DSM 2403 negativo 0,002 Aeromonas hydrophilia anaerogenes DSM negativo 0,002 Aeromonas hydrophilia hydrophilia DSM negativo 0,004 Citrobacter freundii DSM negativo 0,004 Citrobacter freundii DSM negativo 0,004 Enterobacter cloacae DSM negativo 0,008 Enterococcus faecalis DSM 2570 negativo 0,005 Enterococcus faecium DSM negativo 0,010 Escherichia coli Isolato negativo 0,002 Escherichia coli Isolato negativo 0,005 RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

10 Escherichia coli Isolato negativo 0,004 Escherichia hermannii DSM 4560 negativo 0,003 Lactococcus lactis DSM negativo 0,008 Listeria innocua SLCC 5639 negativo 0,006 Proteus mirabilis DSM 788 negativo 0,003 Proteus mirabilis DSM 4479 negativo 0,005 Proteus vulgaris DSM negativo 0,000 Providencia stuartii DSM 6676 negativo 0,001 Pseudomonas arruginosa DSM 939 negativo 0,018 Pseudomonas fluorescens DSM 4358 negativo 0,007 Pseudomonas fluorescens DSM negativo 0,003 Pseudomonas putida DSM 291 negativo 0,007 Salmonella Agona Isolato negativo 0,003 Salmonella Cholerasuis DSM 4224 negativo 0,005 Salmonella Infantis Isolato negativo 0,005 Salmonella Ohio Isolato negativo 0,006 Salmonella Typhimurium Isolato negativo 0,004 Germe testato Provenienza Risultato Sospensione Serratia proteamaculans DSM 4487 negativo 0,003 Shigella flexneri DSM 4782 negativo 0,003 Shigella sonnei DSM 5570 negativo 0,004 Staphylococcus aureus DSM negativo 0,014 Streptococcus agalactiae Isolato negativo 0,001 Streptococcus dysgalactiae Isolato negativo 0,000 Streptococcus uberis Isolato negativo 0,005 Escherichia coli (O157:H-) Isolato negativo 0,001 Escherichia coli (O116:H21) Isolato negativo 0,000 Escherichia coli (O111:H-) Isolato negativo 0,001 Escherichia coli (O26:H8) Isolato negativo 0,002 Controllo negativo (TSB) 0,004 Controllo positivo (kit del test) 2,018 cut-off 0,150 Provenienza Risultato Sospensione Candida albicans ATCC negativo 0,000 Campylobacter coli DSM 4689 negativo -0,001 Campylobacter fetus DSM 5361 negativo 0,000 Campylobacter jejuni DSM 4688 negativo 0,001 Morganella morganii DSM 6675 negativo 0,003 RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

11 Samonella Enteritis DSM 9898 negativo 0,001 Controllo positivo 2,091 Controllo negativo 0,001 cut-off 0, Precisione La riproducibilità Intra-Assay è stata verificata su campioni di feci con enterotossina C. perfringens in 3 diverse concentrazioni, 24 volte, con reagenti di un kit. Valore medio, deviazione standard e coefficiente di variazione sono stati verificati. I risultati sono riassunti nella Tabella 2. Tab. 2: Riproducibilità intra-assay Intra-Assay (n=24) Campione Valore medio di estinzione Deviziazione standard Coefficiente di variazione % A B C NEGKO 2,494 1,253 0,549 0,051 0,0302 0,0471 0,0337 0,0046 1,21 3,76 6,13 8,96 Valore medio 5,1 La riproducibilità Intra-Assay è stata verificata su campioni di feci con enterotossina C. perfringens in 3 diverse concentrazioni, 5 volte, con kit di test diversi. I risultati sono riassunti nella Tabella 3. Tab. 3: Riproducibilità inter-assay Inter-Assay (n=5) Campione Valore medio di estinzione Deviziazione standard Coefficiente di variazione % A B C NEGKO 2,481 1,213 0,58 0,054 0,0464 0,0757 0,0198 0,0051 1,87 6,24 3,41 9,37 Valore medio 5,22 RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin

12 Letteratura 1. Collie, Renee E.; McClane, Bruce A.: Evidence That the Enterotoxin Gene Can Be Episomal in Clostridium perfringens Isolates Associated with Non-Food-Borne Human Gastrointestinal Diseases; J. Clin. Microbiol. 36 No. 1, (1998) 2. Collie, Renee E. et al.: Phenotypic Characterization of Enterotoxigenic Clostridium perfringens Isolates from Non-foodborne Human Gastrointestinal Diseases; Anaerobe, No. 4, (1998) 3. Borriello, S.P. Newly described clostridial diseases of the gastrointestinal tract: Clostridium perfringens enterotoxin-associated diarrhea and neutropenic due to Clostridium septicum. In Borriello S.P. (eds.) Clostridia in Gastrointestinal Disease, pp , CRC Press, Inc., Boca Raton (1985) 4. Borriello, S.P. et al.:enterotoxigenic Clostridium perfringens: a possible cause of antibiotic-associated diarrhea. Lancet 1, (1984) 5. Brett, M.M. et al.: Detection of Clostridium perfringens and its enterotoxin in cases of sporadic diarrhea. J. Clin. Pathol. 45, (1992) 6. Jackson, S. et al.: Diagnostic importance of Clostridium perfringens enterotoxin analysis in recurring enteritis among the elderly, chronic care psychiatric patients. J. Clin. Microbiol 23, (1986) 7. Mpamugo, O. et al.: Enterotoxigenic Clostridium perfringens, as a cause of sporadic cases of diarrhoea. J. Med. Microbiol. 43, (1995) 8. Borriello, S.P., Clostridial Disease of the Gut. Clin. Infect. Dis., Suppl 2; (1995) 9. Rood, Julian I. Virulence Genes of Clostridium perfringens. Annu. Rev. Microbiol. 52, (1998) 10. Sakurai, Jun et al.: Major Toxins of Clostridium perfringens. J. Toxicol. Toxin Reviews. 16(4), (1997) 11. Titball, Richard W. et al.: The Clostridium perfringens α-toxin. Anaerobe 5, (1999) 12. Wnek, Andrew P. et al.: Production an Characterization of Monoclonal Antibodies against Clostridium perfringens Type A Enterotoxin. Infektion and Immunity. Vol. 50, No. 2., (1985) 13. Hanna, Philip C. et al.: Mapping of Functional Regions of Clostridium perfringens Type A Enterotoxin. Infektion and Immunity. Vol. 60, No. 5, (1992) 14. Brockmann, S.; Gastroenteritis-Ausbruch verursacht durch Clostridium perfringens. Epidemiologisches Bulletin Nr. 18, (2000) 15. Graf, P.; Gastroenteritis-Ausbruch verursacht durch Clostridium perfringens; Robert Koch- Institut; Epidemiologisches Bulletin Nr. 41, (2000) RIDASCREEN Clostridium perfringens Enterotoxin