RIDASCREEN. Total IgE. Art.No.: A0141

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1 RIDASCREEN Total IgE Art.No.: A0141 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany, Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 1. Campo di applicazione Per diagnostica in vitro. RIDASCREEN Total IgE è un test immuno-enzimatico (EIA) per la rilevazione quantitativa di anticorpi IgE nel siero umano. Il test deve essere impiegato insieme con l'ige specifico come indicazione di una patologia atopica. Esso trova inoltre impiego come ausilio per l'interpretazione nella valutazione dei risultati di un test IgE specifico. 2. Sintesi e spiegazione del test Il compito del sistema immunitario consiste nella difesa da batteri patogeni, virus e altri microorganismi. L'azione di difesa serve a proteggere l'organismo dal primo contatto con gli agenti patogeni, ma anche per l'immunizzazione in caso di contatto ripetuto. Inoltre, tutte le reazioni allergiche sono l'esito di un primo contatto asintomatico, nel quale si sono già formati anticorpi specifici della classe E (anticorpi IgE). In caso di contatto ripetuto con l'allergene attivo, tali anticorpi IgE reagiscono con l'allergene favorendo la distribuzione di mediatori (prevalentemente mastociti) quali istamina, leucotriene, prostaglandina, ecc., che a loro volta determinano l'insorgenza della sintomatologia allergica. La rilevazione di un livello IgE totale elevato fornisce, in un contesto di diagnosi fondata di allergia, una indicazione sulla presenza di sensibilizzazione o allergia. I massimi valori IgE si riscontrano nella dermatite atopica e possono raggiungere un valore > U/ml Valori elevati di IgE totale possono inoltre essere provocati da altre patologie quali parassitosi, patologie infiammatorie quali infezioni del micoplasma, pertussis, HIV, mieloma maligno, nonché da immunodeficienza. Valori di IgE totale molto bassi possono indicare l'assenza di allergia ma non la escludono. 3. Principio del test Il principio del test corrisponde ad un test immuno-enzimatico (EIA) per la rilevazione di anticorpi. Anticorpi IgE anti umani, di origine non umana, sono fissati alla superficie interna delle cavità di una micropiastra. Anticorpi umani IgE presenti provenienti da standard, controlli e campioni dei pazienti vengono fissati mediante tali anticorpi. In una seconda fase avviene l'aggiunta di un anticorpo IgE anti umano coniugato con fosfatasi alcalina che si lega agli anticorpi IgE umani fissati. In una terza fase viene aggiunto un substrato defosforilato mediante fosfatasi alcalina. La conseguente variazione cromatica dal neutro al giallo viene misurata mediante fotometro a 405 nm 2 RIDASCREEN Total IgE

3 con lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm e sulla base della curva standard. I risultati sono indicati in IU/ml. 4. Contenuto della confezione Tab.1: Contenuto della RIDASCREEN Total IgE (Art. No. A0141) Plate AllergySB AllergyWB 1-96 Det. 15 ml 60 ml Micropiastra, 12 strisce per microtitolazione, separabile, in telaio di fissaggio, rivestimento con anticorpi anti umani IgE Tampone dei campioni, pronto per l'uso, Colore del coperchio: bianco Tampone di lavaggio, concentrato 16 volte, 0,9% NaN 3, Colore del coperchio: trasparente Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Control high 130 µl Control low 130 µl Conjugate 12 ml Siero standard 1, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 0; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 2, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 5; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 3, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 25; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 4, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 100; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 5, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 250; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 6, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 500; in soluzione proteica stabilizzata Siero standard 7, diluito Siero umano; concentrazione (in IU IgE/ml): 1000; in soluzione proteica stabilizzata Controllo alto IgE, diluito Siero umano, pronto per l'uso, concentrazione: si veda certificato; in soluzione proteica stabilizzata, colore del coperchio: coperchio verde piccolo Controllo basso IgE, diluito Siero umano, pronto per l'uso, concentrazione: si veda certificato; in soluzione proteica stabilizzata, colore del coperchio: coperchio giallo piccolo coniugato IgE anti-umani (da coniglio); pronto per l'uso; anticorpi coniugati in fosfatasi alcalina in soluzione proteica stabilizzata, RIDASCREEN Total IgE

4 AllergySub AllergyStop 12 ml 12 ml colore del coperchio: rosso Soluzione substrato, soluzione pnpp in dietanolamina, pronto per l'uso, colore del coperchio: nero Soluzione bloccante, 7,4% EDTA, pronta per l'uso Colore del coperchio: verde 5. Reagenti e relativa conservazione Il kit del test deve essere conservato a 2-8 C ed è utilizzabile, anche dopo l'apertura, fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Il tampone di lavaggio diluito è conservabile per un massimo di quattro settimane ad una temperatura compresa tra 2-8 C. Evitare la contaminazione microbica. Dopo la data di scadenza, non può essere più fornita alcuna garanzia di qualità. La busta in alluminio contenente la micropiastra deve essere aperta con le forbici senza rimuovere la chiusura a clip. Le strisce per microtitolazione inutilizzate devono essere conservate nella busta in alluminio chiusa ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Evitare assolutamente la contaminazione della soluzione substrato con il coniugato, in quanto ciò comporta la colorazione del substrato. Evitare inoltre l'esposizione diretta alla luce del substrato, per evitare la decomposizione o colorazione per idrolisi. In caso di sopraggiunta colorazione il substrato non può più essere riutilizzato. Si veda anche il Punto 10 Controllo della qualità - segni di scadenza dei reagenti. 6. Reagenti aggiuntivi necessari - accessori richiesti 6.1. Reagenti acqua distillata o deionizzata 6.2. Accessori Fotometro per micropiastre (con filtro da 405 nm e 620 nm), lavatrice automatica per micropiastre o sistema di lavaggio a mano (comb, pompa, contenitore per tamponi e rifiuti) Incubatrice da 37 C Micropipetta da µl Pipetta da 8 canali o Multi Step Cilindro graduato (1000 ml) 4 RIDASCREEN Total IgE

5 7. Precauzioni Solo per diagnostica in vitro. Questo test deve essere condotto esclusivamente da personale di laboratorio qualificato. Osservare le disposizioni per il lavoro nei laboratori medici. Attenersi rigorosamente alle istruzioni per l'uso nell'esecuzione del test. Non introdurre con la bocca campioni o reagenti mediante pipetta, evitare il contatto con la cute lesa o con le mucose. Durante la manipolazione dei campioni indossare guanti monouso e lavare le mani dopo aver eseguito il test. Non fumare, mangiare o bere negli ambienti in cui si opera con i campioni o con i reagenti del test. I sieri di controllo contenuti nel kit (sieri standard, controllo alto e basso) sono stati sottoposti ad esame di anticorpi HIV, HCV, HbsAg e sifilide CFR e sono risultati negativi. Tuttavia questi ultimi devono essere trattati come potenzialmente infettivi, analogamente ai sieri dei pazienti e a tutti i materiali che entrano in contatto con essi, e maneggiati in conformità alle disposizioni di sicurezza nazionali vigenti. Il concentrato del tampone di lavaggio contiene azoturo di sodio come conservante. Evitare il contatto con la pelle o con le mucose. Al contatto con tubazioni in piombo o rame possono generarsi azoturi metallici esplosivi. Dopo l'uso tutti i componenti del kit devono essere debitamente smaltiti con responsabilità. Tutti i reagenti e materiali che entrano in contatto con campioni potenzialmente infettivi devono essere trattati con adeguato disinfettante o sottoposti a sterilizzazione a vapore per almeno un'ora a 121 C. 8. Raccolta e deposito dei campioni Il test è stato sviluppato per l'esame di campioni di siero umano. Dopo il prelievo ematico, al fine di evitare l'emolisi, il siero deve essere separato dal coagulo sanguigno il più velocemente possibile. I campioni devono essere conservati refrigerati o congelati fino all'esecuzione del test. Evitare assolutamente il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni, così come la contaminazione microbica. L'utilizzo di calore nei campioni inattivati, lipemici, emolitici, itterici o opachi può portare a risultati falsati. Tab. 2: Conservazione dei campioni siero non diluito 2-8 C -20 C 1 settimana > 1 settimana RIDASCREEN Total IgE

6 9. Esecuzione del test 9.1. Generalità Prima dell'utilizzo portare tutti i reagenti, i sieri dei pazienti e la micropiastra a temperatura ambiente (20-25 C). Mescolare con cura i reagenti immediatamente prima dell'utilizzo. Subito dopo l'uso, conservare nuovamente il kit a temperatura compresa tra 2 e 8 C. Le strisce per microtitolazione non possono essere utilizzate più di una volta. Reagenti e strisce per microtitolazione non devono essere utilizzati se l'imballaggio è danneggiato o se i contenitori non sono ermetici. Lo scambio o la combinazione di componenti del kit con numeri di lotto diversi non sono consentiti. La discordanza con i tempi di incubazione e le temperature indicati comporta lo spostamento della curva standard rispetto al certificato. La forte variazione dei valori della curva standard comporta l'invalidità dei risultati del test. Evitare l'esposizione diretta ai raggi solari durante l'esecuzione del test. Si raccomanda di coprire la micropiastra. Per l'incubazione della micropiastra non deve essere utilizzata la camera umida! 9.2. Preparazione del tampone di lavaggio Riempire il contenuto del flacone di concentrato del tampone di lavaggio AllergyWB con acqua distillata a 1000 ml. Eventuali cristalli presenti nel concentrato devono essere precedentemente disciolti per riscaldamento (bagnomaria a 37 C) Prima incubazione Dopo l'inserimento di un numero sufficiente di cavità nel telaio di fissaggio, si procede all'introduzione mediante pipetta di 20 µl degli standard Standard 1, Standard 2, Standard 3, Standard 4, Standard 5, Standard 6 e Standard 7 in doppia determinazione (consigliato), dei controlli Control high e Control low e dei sieri dei pazienti. Successivamente dispensare mediante pipetta in tutte le cavità con standard, controlli e sieri dei pazienti, 100 µl di tampone campione AllergySB e mescolare accuratamente. Coprire la piastra Plate e incubare in una incubatrice chiusa (consigliato) a 37 C per 60 min Lavaggio Le cavità vengono lavate per 5 volte per mezzo di riempimento con tamponi di lavaggio e successiva aspirazione. L'ultima aspirazione deve avvenire il più possibile 6 RIDASCREEN Total IgE

7 quantitativamente. Svuotare quindi completamente la piastra tamponando accuratamente su superficie assorbente. In caso di utilizzo di lavatrice automatica (che si raccomanda) si procede con il lavaggio mediante tampone di lavaggio a 300 µl con contemporanea aspirazione (con adeguata regolazione di Overflow). Assicurarsi prima della corretta regolazione del dispositivo sulla base delle dimensioni del tipo di piastra impiegata. In caso di impiego di un sistema di lavaggio manuale lavare ugualmente per 5 volte con µl di tampone di lavaggio. Le pipette non sono adeguate per il lavaggio Seconda incubazione Aggiunta di 100 µl di coniugato Conjugate in tutte le cavità. Incubare quindi la piastra Plate coperta per 60 minuti a 37 C Lavaggio Lavare in conformità con il Punto 9, Terza incubazione e misurazione Dispensare mediante pipetta 100 µl di substrato AllergySub in maniera continuata in tutte le cavità. Incubare quindi la piastra per 15 minuti a 37 C. La reazione viene arrestata mediante l'aggiunta di 50 µl di soluzione bloccante AllergyStop in ogni cavità. La misurazione dell'estinzione avviene a 405 nm contro una lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm. La piastra può essere nuovamente misurata entro 24 ore, se conservata refrigerata e coperta. 10. Controllo della qualità - Segni di scadenza dei reagenti Eseguire ad ogni esecuzione del test su ogni piastra gli Standard 1-7 in doppia determinazione (consigliato) e per il controllo qualità un controllo alto e un controllo basso. Il test è stato eseguito correttamente se le concentrazioni dei controlli sono comprese negli intervalli riportati nel certificato. Una discordanza dei valori richiesti può anche manifestarsi come segno di scadenza dei reagenti con l'opacizzazione o colorazione gialla del substrato prima dell'aggiunta nelle cavità. In caso di non conformità con i valori indicati, prima della ripetizione del test verificare quanto segue: periodo di conservazione dei reagenti utilizzati funzionalità dei dispositivi utilizzati (ad es. calibratura) corretta esecuzione del test RIDASCREEN Total IgE

8 controllo visivo dei componenti del kit per contaminazione o mancanza di ermeticità; non utilizzare una soluzione substrato di colore giallo In caso di non conformità con tali condizioni dopo la ripetizione del test, rivolgersi al distributore locale. 11. Valutazione e interpretazione Diagnosi sierologica Basi di calcolo Per la valutazione del test è necessario eseguire la curva di riferimento. A tal fine si dispongono gli standard in doppia determinazione su ogni piastra. Per l'esecuzione della curva di riferimento i valori medi delle estinzioni ottenuti dalle doppie determinazioni degli standard come funzione delle relative concentrazioni (IU/ml) in maniera semi-logaritmica (rappresentazione y-lin/x-log) vengono riportati in una rappresentazione point-to-point. La concentrazione degli anticorpi IgE può essere rilevata dal valore OD misurato sulla base della curva standard. La valutazione può essere eseguita anche per mezzo di un apposito software. La calibratura della curva Standard del RIDASCREEN IgE totale avviene sulla base della preparazione internazionale di riferimento "2nd WHO IRP 75/502 for human IgE" Concentrazioni e valutazione dei valori rilevati La tabella seguente espone i valori normali di IgE totale a seconda dell'età. Tab. 3: valori normali IgE in IU/ml, a seconda dell'età, 95 % percentile Neonato < 2 1. anno anno anno anno anno 150 > 16 anni 120 I valori su riportati sono solo a titolo indicativo. Non è possibile riportare dati esatti, in quanto l'intervallo di sovrapposizione delle concentrazioni di IgE totale di allergici e non allergici è molto vasto. 12. Limiti del metodo Non è possibile dedurre una relazione tra la proporzione della concentrazione di IgE totale rilevata e l'insorgenza o la gravità della sintomatologia clinica. A causa delle 8 RIDASCREEN Total IgE

9 alte oscillazioni individuali del valore di IgE totale, sia in soggetti sani di controllo sia in atopici, la determinazione di un intervallo di norma è relativamente inattendibile. Un normale valore di IgE totale nel singolo caso non esclude una allergia, d'altro canto una concentrazione elevata di IgE non è indicativa della presenza di una patologia atopica. Altre cause di elevate concentrazioni di IgE possono essere: parassitosi (spesso caratterizzate da alto numero di acidofili) immunodeficienza congenita determinate malattie autoimmuni sindrome di Churg-Strauss alcune patologie maligne sindrome di Wiskott-Aldrich linfoma Pertanto i risultati ottenuti devono essere sempre interpretati in relazione all'anamnesi, al quadro clinico e ai risultati del test IgE specifico. RIDASCREEN Total IgE

10 13. Prestazioni opzionali Tab. 4: Varianza Inter-Assay, i risultati in sono stati i presupposti per tutti i calcoli. Inter-Assay Campione Concentrazione in IU/ml 3,5 20,6 77,7 162,3 1092,3 Nr. Assays 8x3 8x3 8x3 8x3 8x3 CV 31,6 26,2 6,6 5,9 23,1 Tab. 5: Varianza Intra-Assay, i risultati in IU/ml sono stati i presupposti per tutti i calcoli Intra-Assay Campione Concentrazione in IU/ml 6,3 16,3 78,5 150,4 470,1 Nr. Repl CV 11,7 8,2 8,2 9,7 12,5 10 RIDASCREEN Total IgE

11 Letteratura 1. Renz, H., Becker, W.-M., Bufe, A., et al.: Positionspapier der Deutschen Gesellschaft für Allergologie und klinische Immunologie (DGAI). Allergo J 2002;11; Kjellman, N.I.M.: Prediction and prevention of atopic allergy, Allergy 37, (1982) 3. Debelic, M.: Die klinische Bedeutung der Bestimmung von Serum-Gesamt IgE und spezifischem IgE für die Diagnostik und Verlaufsbeobachtung allergischer Krankheitsbilder. Therapiewoche 29, (1979) 4. Kjellman, N.I.M., et al.: Serum IgE levels in healthy children quantified by a Sandwich technique (PRIST), Clin. Allergy 6, (1976) 5. Turner, K.J.: IgE globulins and immunity. Medical Journal of Australia 2, 846 (1974) 6. Johannson, S.G.O.: Raised levels of a new immunoglobulin class (IgND) in asthma. Lancet II, (1967) 7. Ishizaka, K., Ishizaka, T., Hornbook, M.M.: Physico-chemical properties of human reaginic antibody. IV. Presence of a unique immunoglobulin as a carrier of reaginic activity. Journal of Immunology 97, 75 (1966) 8. Bennich, H.H., et al.: Immunoglobulin E, a new class of human immunoglobulin. Bulletin World Health Organisation 38, 151 (1964) RIDASCREEN Total IgE