RIDASCREEN. Chlamydia IgG/IgM. Art. No.: KGM3101

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1 RIDASCREEN Chlamydia IgG/IgM Art. No.: KGM3101 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel: / Telefax:

2 1. Campo di applicazione Per diagnostica in vitro. I RIDASCREEN Chlamydia è un test immuno-enzimatico (EIA) per la rilevazione di anticorpi IgG o IgM anti specie Chlamydia nel siero umano. I test devono essere condotti in caso di fondato sospetto di infezione da Clamidia o per un esame dello stato immunitario. 2. Sintesi e spiegazione del test Il gruppo delle Clamidie comprende tre agenti umanopatogeni: Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci e Chlamydophila pneumoniae. La Chlamydia trachomatis è uno degli agenti patogeni batterici a più frequente trasmissione sessuale ed è spesso causa di uretrite, cervicite o salpingite. I neonati di mamme infette possono sviluppare congiuntivite o polmonite. Alcune varietà di sieri possono provocare il linfogranuloma venereo. Altri tipi di siero sono la causa del tracoma trasmesso per infezione da sudiciume. Fino a pochi anni fa si sosteneva che la Chlamydia pneumoniae fosse una sottospecie di Chlamydia psittaci. Nel 1989 è stata consolidata l'esistenza di questa terza specie di Chlamydia. Nuove ricerche hanno portato alla concezione di un genere proprio della Chlamydophila. A seconda di fattori specifici dell'ospite, la Chlamydophila pneumoniae può causare patologie acute delle alte vie respiratorie, dei bronchi e dei polmoni. Risultati di ricerche lasciano presupporre la compartecipazione della Chlamydophila pneumoniae nell'asma, patologie polmonari ed altre affezioni croniche. Il Chlamydophila psittaci è un agente patogeno ampiamente diffuso negli uccelli e nei mammiferi. Tale agente è presente nell'uomo solo raramente provocando normalmente affezioni di carattere respiratorio. Per la diagnosi dell'infezione da Clamidia è necessario un esame dei tessuti (striscio) o una determinazione degli anticorpi del siero. Se l'accumulo di antigeni è difficile o se gli antigeni esistono solo in quantità non identificabile, è preferibile la determinazione degli anticorpi. L'utilizzo dell'antigene LPS specifico per la Clamidia (LPS = lipopolisaccaride) consente contemporaneamente l'individuazione degli anticorpi contro tutte e tre le specie. 3. Principio del test L'antigene LPS depurato è fissato ad una micropiastra. Gli anticorpi presenti nei campioni dei pazienti si legano all'antigene e vengono rilevati in una seconda fase mediante anticorpi antiumani marcati con enzima (coniugato). L'enzima trasforma il substrato incolore (H 2 O 2 /TMB) in un prodotto finale blu. La reazione enzimatica viene arrestata mediante l'aggiunta di acido solforico. Ne consegue contemporaneamente una variazione cromatica dal blu al giallo. La misurazione finale avviene in un fotometro a 450 nm (lunghezza d'onda di riferimento 620 nm). RIDASCREEN Chlamydia

3 4. Contenuto della confezione I reagenti di una confezione bastano per 96 determinazioni. Plate 96 Det. Micropiastra; 12 strisce per microtitolazione (separabili) in telaio di fissaggio; rivestimento con antigene LPS di Chlamydia Diluent 30 ml Tampone campione, pronto per l'uso; tampone al fosfato di colorazione blu; contiene stabilizzanti proteici e Proclin Wash 50 ml Tampone di lavaggio, (conc. 20 volte); Tampone al fosfato, contiene Tween 20 e Proclin Control IgG µl Controllo positivo IgG, siero umano; contiene Proclin Control IgM µl Controllo positivo IgM, siero umano; contiene Proclin Control IgG 250 µl Controllo negativo IgG, siero umano; contiene Proclin Control IgM 250 µl Controllo negativo IgM, siero umano; contiene Proclin Cut Off IgG 250 µl Controllo Cut Off IgG, siero umano; contiene Proclin Cut Off IgM 250 µl Controllo Cut Off IgM, siero umano; contiene Proclin Conjugate IgG 15 ml Coniugato anti IgG umani (da capra), pronto per l'uso; coniug. perossidasi Anticorpi in soluzione tampone di colorazione arancione, contiene Proclin Conjugate IgM 15 ml Coniugato anti IgM umani (da capra), pronto per l'uso; coniug. perossidasi Anticorpi in soluzione tampone di colorazione arancione, contiene Proclin Substrate 15 ml Substrato, H 2 O 2 /tereametilbenzilina; pronto per l'uso Stop 15 ml Reagente bloccante, 1 N acido solforico; pronto per l'uso 5. Reagenti e relativa conservazione Il kit deve essere conservato a 2 8 C e deve essere usato fino alla data di scadenza indicata in etichetta. Il tampone di lavaggio dilutio si puó usare fino ad un massimo di 4 settimane se conservato a 2 8 C oppure 5 giorni se conservato a temperatura ambiente (20 25 C). Oltre la data di scadenza la garanzia di qualità non è valida. La busta in alluminio contenente la micropiastra deve essere aperta senza rimuovere la chiusura a clip. Le strisce per microtitolazione inutilizzate devono essere immediatamente riposte nella busta in alluminio chiusa e conservate ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Dopo la prima apertura, le strisce per microtitolazione possono essere appropriatamente conservate per tre mesi. RIDASCREEN Chlamydia

4 Occorre inoltre evitare una contaminazione dei reagenti come l'esposizione diretta alla luce del substrato incolore. 6. Reagenti aggiuntivi necessari - accessori richiesti 6.1. Reagenti acqua distillata o deionizzata assorbente RF (cfr. Punto 9.3.) 6.2. Accessori Incubatrice o camera umida a 37 C Ansa di inoculazione Vortex Mixer Micropipette da µl e µl Volumina Cilindro graduato (1000 ml) Cronometro Dispositivo di lavaggio per micropiastre o pipetta multicanale Fotometro per micropiastre (450 nm, filtro di riferimento 620 nm) Carta filtrante (carta da laboratorio) Contenitore di rifiuti con soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5 % 7. Precauzioni Solo per diagnostica in vitro. Questo test deve essere condotto esclusivamente da personale di laboratorio qualificato. Osservare le disposizioni per il lavoro nei laboratori medici. Attenersi rigorosamente alle istruzioni per l'uso nell'esecuzione del test. Non introdurre con la bocca campioni o reagenti mediante pipetta, evitare il contatto con la cute lesa o con le mucose. Durante la manipolazione dei campioni indossare guanti monouso e lavare le mani dopo aver eseguito il test. Non fumare, mangiare o bere negli ambienti in cui si opera con i campioni o con i reagenti del test. RIDASCREEN Chlamydia

5 I sieri di controllo contenuti nel kit (controllo positivo, controllo negativo e controllo Cut Off) sono stati sottoposti ad esame di anticorpi HIV, HCV e HbsAg e sono risultati negativi. Tuttavia questi ultimi devono essere trattati come potenzialmente infettivi, analogamente ai campioni dei pazienti e a tutti i materiali che entrano in contatto con essi, e maneggiati in conformità alle disposizioni di sicurezza nazionali vigenti. Il perossido di idrogeno (substrato) è una sostanza che può provocare corrosioni. Maneggiare con cautela! In caso di contatto con la pelle lavare con acqua. Il reagente bloccante contiene 1 N acido solforico. Evitare il contatto con la pelle e con gli indumenti! In caso di contatto con la pelle lavare con acqua. Tutti i reagenti e materiali che entrano in contatto con campioni potenzialmente infettivi devono essere trattati con adeguato disinfettante o sottoposti a sterilizzazione a vapore per almeno un'ora a 121 C. ATTENZIONE: per evitare la formazione di gas velenosi, i residui liquidi contenuti nel reagente bloccante devono essere neutralizzati prima dell'immissione in una soluzione di ipoclorito. 8. Raccolta e deposito dei campioni Il test è stato sviluppato per l'esame di campioni di siero umano. Dopo il prelievo ematico, al fine di evitare l'emolisi, il siero deve essere separato dal coagulo sanguigno il più velocemente possibile. I campioni devono essere conservati refrigerati o congelati fino all'esecuzione del test. Evitare assolutamente il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni, così come la contaminazione microbica. L'utilizzo di calore nei campioni inattivati, lipemici, emolitici, itterici o opachi può portare a risultati falsati. Tab. 2: Conservazione dei campioni siero non diluito siero diluito 2 8 C -20 C 2 8 C 1 settimana > 1 settimana 7 ore 9. Esecuzione del test 9.1. Generalità Prima dell'utilizzo portare tutti i reagenti e le strisce per microtitolazione a temperatura ambiente (20 25 C). Rimuovere le strisce per microtitolazione dalla busta in alluminio solo dopo il raggiungimento della temperatura ambiente. Mescolare con cura i reagenti immediatamente prima dell'utilizzo. Subito dopo l'uso, conservare nuovamente il kit a temperatura compresa tra 2 e 8 C. RIDASCREEN Chlamydia

6 Si raccomanda di prelevare soltanto il quantitativo di reagente necessario all'esecuzione del test. Il reagente in eccesso non deve essere nuovamente riposto nei contenitori, in quanto ciò potrebbe causare contaminazione. Le strisce per microtitolazione non possono essere utilizzate più di una volta. Reagenti e strisce per microtitolazione non devono essere utilizzati se l'imballaggio è danneggiato o se i contenitori non sono ermetici. Tamponi campione, tamponi di lavaggio, substrato e reagente bloccante non sono specifici per il test e possono essere utilizzati anche per altri RIDASCREEN EIA per l'identificazione di anticorpi anti Clamidie Preparazione del tampone di lavaggio 1 parte di concentrato per tamponi di lavaggio Wash viene mischiata con 19 parti di acqua distillata. A tale scopo, inserire 50 ml di concentrato in un cilindro da 1000 ml riempito con acqua distillata fino a 1000 ml. Eventuali cristalli presenti nel concentrato devono essere precedentemente disciolti per riscaldamento (bagnomaria a 37 C). Il tampone di lavaggio dilutio si puó usare fino ad un massimo di 4 settimane se conservato a 2 8 C oppure 5 giorni se conservato a temperatura ambiente (20 25 C) Preparazione dei campioni I campioni di siero da esaminare e i controlli vengono diluiti prima dell'inizio del test con il tampone campione Diluent nel rapporto 1:21. Effettuare la diluizione direttamente nella micropiastra. Eseguire il controllo Cut Off in doppia determinazione. Utilizzare i controlli corrispondenti alla determinazione (IgG, IgM). A1 Controllo negativo B1 Controllo Cut Off C1 Controllo Cut Off D1 Controllo positivo E1, F1 Siero del paziente 1, 2, etc. Dopo l'inserimento di un numero sufficiente di cavità per i controlli e per i campioni nel telaio di fissaggio, procedere, per la determinazione IgG, all'introduzione mediante pipetta di 100 µl di tampone campione nelle rispettive cavità della piastra e aggiungere quindi 5 µl di campione o controllo. Per mischiare agitare la piastra per poco tempo: 100 µl di Diluent + 5 µl di siero o controllo RIDASCREEN Chlamydia

7 Per le determinazioni IgM sottoporre i campioni nella piastra ad assorbimento IgG (ad es. con l'assorbente RIDA RF-Absorbens, Art. No. Z0202) e solo dopo procedere alla diluizione necessaria per il test con il tampone campione. Nell'utilizzo dell'assorbente RIDA RF- Absorbens procedere come segue: 1) inserire 50 µl di assorbente RIDA RF-Absorbens nelle cavità per i campioni 2) aggiungere 5 µl di siero; mischiare 3) introdurre quindi 5 µl di controlli nelle cavità corrispondenti 4) aggiungere 100 µl di Diluent ai controlli 5) aggiungere 50 µl di Diluent ai campioni; mischiare Attenzione! I controlli non devono essere assorbiti Prima incubazione La piastra viene quindi incubata in una incubatrice o camera umida per 45 minuti a 37 C. Durante tale processo, il fondo delle cavità non deve entrare in contatto con materiale termoconduttore (metallo o carta umida). Coprire la micropiastra durante l'incubazione. Attenzione! Non posizionare la micropiastra in un contenitore da incubazione freddo, che si riscalda solo durante l'incubazione a 37 C. Il contenitore deve essere già adattato a 37 C Lavaggio Le cavità devono essere svuotate per la disinfezione in un contenitore di rifiuti con soluzione di ipoclorito. Tamponare successivamente la piastra con carta assorbente per rimuovere l'umidità residua. Successivamente lavare per 5 volte con 300 µl di tampone di lavaggio diluito. Dopo ogni lavaggio, provvedere al completo svuotamento tramite tamponatura con una parte di carta non utilizzata. In caso di utilizzo di lavatrice automatica prestare attenzione alla corretta posizione dei dispositivi sul tipo di piastra utilizzato. Dopo il lavaggio tamponare la piastra con carta assorbente pulita per rimuovere l'umidità residua Seconda incubazione Aggiunta di 100 µl di coniugato Conjugate IgG o Conjugate IgM nelle cavità corrispondenti. Incubare quindi la piastra per 30 minuti a 37 C (cfr. Punto 9.4.). RIDASCREEN Chlamydia

8 9.7. Lavaggio Lavare per 5 volte in conformità con il Punto Terza incubazione Aggiungere 100 µl di substrato Substrate in tutte le cavità. Incubare quindi la piastra coperta per 20 minuti a temperatura ambiente. Con l'aggiunta di 50 µl di reagente bloccante Stop in tutti i vani si procede poi all'arresto della reazione. Dopo un'accurata miscelazione (con leggeri colpi sul bordo della piastra) si procede alla misurazione dell'estinzione in un fotometro per piastre a 450 nm (lunghezza d'onda di riferimento 620 nm). La taratura del valore zero avviene contro aria. La misurazione deve essere effettuata entro un'ora dall'aggiunta del reagente bloccante. Attenzione: in caso di utilizzo di una camera umida per la rimozione dell'acqua condensata asciugare la parte inferiore della micropiastra prima di effettuare la misurazione. 10. Controllo della qualità - Segni di scadenza dei reagenti Per il controllo della qualità eseguire controllo positivo, negativo e Cut Off ad ogni esecuzione del test. Eseguire il controllo Cut Off in doppia determinazione e il valore medio è costituito da entrambe le singole misurazioni. Il test è stato eseguito correttamente se i valori di estinzione (O.D.) dei controlli sono conformi ai seguenti criteri: Tab. 3: Criteri per il controllo qualità O.D. Controllo negativo < 0,55 Controllo positivo > 0,9 Controllo Cut Off (valore medio) < 0,7 x O.D. del controllo positivo > 1,5 x O.D. del controllo negativo Una discordanza dei valori richiesti può anche manifestarsi come segno di scadenza dei reagenti con l'opacizzazione o colorazione blu del substrato prima dell'aggiunta nelle cavità. RIDASCREEN Chlamydia

9 In caso di non conformità con i valori indicati, prima della ripetizione del test verificare quanto segue: periodo di conservazione dei reagenti utilizzati funzionalità dei dispositivi utilizzati (ad es. calibratura) corretta esecuzione del test controllo visivo dei componenti del kit per contaminazione o mancanza di ermeticità; non utilizzare una soluzione cromogenica di colore blu In caso di non conformità con tali condizioni dopo la ripetizione del test, rivolgersi al distributore locale R-Biopharm. 11. Valutazione e interpretazione Calcolo dell'indice dei campioni 1. Calcolare il valore medio di estinzione del controllo Cut Off. 2. Dividendo il valore di estinzione del campione per il valore medio calcolato si ottiene l'indice dei campioni. es.: Controllo 1 Cut Off O.D. = 0,821 Controllo 2 Cut Off O.D. = 0,865 Valore medio = 0,843 Campione O.D. = 1,508 Indice dei campioni = 1,508 0,843 = 1, Risultato del test Tab. 4: Valutazione dell'indice dei campioni IgG, IgM negativo valore limite positivo Indice dei campioni < 0,9 0,9-1,1 > 1,1 12. Limiti del metodo Il RIDASCREEN Chlamydia EIA rileva anticorpi IgG e IgM anti Clamidie. Non è possibile dedurre una relazione tra l'entità del valore di estinzione rilevato e l'insorgenza o la gravità della sintomatologia clinica. Il test non è idoneo per localizzare il sito dell'infezione. I risultati ottenuti RIDASCREEN Chlamydia

10 devono essere sempre interpretati in relazione al quadro clinico e ad altri metodi diagnostici (ad es. isolamento dell'agente patogeno). Un risultato negativo non esclude un'infezione, in quanto il prelievo di siero può essere avvenuto in un momento così precoce, da non consentire la rilevazione degli anticorpi. Se sussiste un sospetto clinico fondato, a distanza di due fino a tre settimane deve essere testato un ulteriore campione sierologico. In generale, per una migliore predittività diagnostica, nelle analisi sierologiche devono essere esaminati in parallelo sempre due sieri consecutivi di un paziente. Il decorso del titolo è importante per l'interpretazione del risultato. Risultati IgG positivi nei neonati devono essere interpretati con cautela, in quanto potrebbero essere stati prodotti da anticorpi materni. La rilevazione di anticorpi IgM è preferibile nei bambini al di sotto del sesto mese. Titoli IgG molto elevati possono causare nelle determinazioni IgM falsi negativi. Inoltre in caso di determinazioni IgM mediante fattori reumatoidi possono ottenersi risultati falsi positivi. Ciò può essere evitato mediante assorbimento del siero prima dell'esecuzione del test (cfr. Punto 9.3.). Reazioni incrociate con anticorpi anti Chlamydophila psittaci non sono state esaminate dal presente test a causa della bassa prevalenza di tale affezione e della carenza di campioni positivi. La risposta immunitaria in caso di infezione oculare da C. trachomatis è bassa. Il test non è stato convalidato in termini di idoneità al controllo della terapia. La predittività del test in caso di affezioni croniche dei bambini e dei pazienti affetti da Lymphogranuloma venereum (LGV) e flogosi cronica del bacino non è stata studiata. Un risultato positivo non esclude la presenza di altri agenti patogeni infettivi come causa della patologia. 13. Prestazioni opzionali Tab. 4: Coefficiente di variazione in % della varianza Inter-Assay (n=10) Varianza Inter-Assay IgG IgM Controllo positivo 3,22% 2,62% Controllo negativo 10,99% 9,24% RIDASCREEN Chlamydia

11 Controllo Cut Off 5,00% 7,36% Tab. 5: Coefficiente di variazione in % della varianza Intra-Assay (n=10) Varianza Intra-Assay IgG IgM Controllo positivo 1,83% 2,16% Controllo negativo 6,98% 8,00% Controllo Cut Off 6,55% 7,79% Tab. 6: Sensibilità e specificità in confronto ad un test di microimmunofluorescenza (MIF) Numero di campioni Sensibilità Specificità IgG % 98% IgM 60 92% 100% Sono stati inoltre esaminati undici campioni di pazienti con test IgG, affetti da infezione da Rickettsia conorii o altri agenti patogeni, che causano un quadro patologico simile alle Clamidie (HSV-2, L. pneumophila, C. burnetii, M. pneumoniae). Nel test IgM sono stati analizzati sette campioni dalle stesse caratteristiche, nonchè tre sieri positivi al fattore reumatoide. Nei sieri esaminati non si sono riscontrate alcune reazioni incrociate o influenze del risultato ELISA. RIDASCREEN Chlamydia

12 Letteratura 1. Finn, M. P., A. Ohlin, and J. Schachter Enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin G and M antibodies to Chlamydia trachomatis in human sera. J Clin Microbiol 17: Gonen, R., Y. Shemer-Avni, P. A. Csango, B. Sarov, and M. G. Friedman Serum reactivity to Chlamydia trachomatis and C. pneumoniae antigens in patients with documented infection and in healthy children by microimmunofluorescence and immunoblotting techniques. APMIS 101: Gutierrez, J., J. Mendoza, F. Fernandez, J. Linares-Palomino, M. J. Soto, and M. C. Maroto ELISA test to detect Chlamydophila pneumoniae IgG. J Basic Microbiol 42: Jauhihainen, T., T. Tuomi, M. Leinonen, J. D. Kark, and P. Saikku Interference of immunoglobulin G (IgG) antibodies in IgA antibody determinations of Chlamydia pneumoniae by microimmunofluorescence test. J Clin Microbiol 32: Jones, R. B., S. C. Bruins, and W. J. Newhall 5 th Comparison of reticulate and elementary body antigens in detection of antibodies against Chlamyida trachomatis by an enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 17: Ladany, S., C. M. Black, C. E. Farshy, J. M. Ossewaarde, an R. C. Barnes Enzyme immunoassay to determine exposure to Chlamydia pneumoniae (strain TWAR). J Clin Microbiol 27: Mahony, J. B., J. Schachter, and M. A. Chernesky Detection of antichlamydial immunoglobulin G and M antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 18: Numazaki, K., T. Ikebe, and S. Chiba Detection of serum antibodies against Chlamydia pneumoniae by ELISA. FEMS Immunol Med Microbiol 14: Ossewaarde, J. M., A. de Vries, J. A. van den Hoek, and A. M. van Loon Enzyme immunoassay with enhanced specificity for detection of antibodies to Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 32: RIDASCREEN Chlamydia