Dipartimento Biodiversità ed Ecologia Molecolare (DBEM), Fondazione Edmund Mach, San Michele all'adige (TN)

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1 Progetto MAZE.ROE DNA metabarcoding + Next-Generation Sequencing per lo studio del microbiota intestinale e della dieta di una specie in espansione: il caso del capriolo (Capreolus capreolus) nelle Alpi Marco Ballardini 1, Riccardo Orusa 1, Wibke Peters 2,3, Barbara Crestanello 2, Matteo Girardi 2, Serena Robetto 1, Cristina Guidetti 1, Heidi Hauffe 2, Annapaola Rizzoli 2, Massimo Pindo 2, Francesca Cagnacci 2 1 Centro Nazionale di Referenza per le Malattie degli Animali Selvatici (CeRMAS), Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'aosta, Quart (AO). marco.ballardini@izsto.it 2 Dipartimento Biodiversità ed Ecologia Molecolare (DBEM), Fondazione Edmund Mach, San Michele all'adige (TN) 3 Ungulate Ecology Research Lab, University of Montana, USA

2 Progetto MAZE.ROE Progetto di Ricerca Corrente 2012 IZSPLV 15/12 RC Unità Operative: 1) Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'aosta (IZSPLV) S.C. Valle d'aosta - Centro di Referenza Nazionale per le malattie degli animali selvatici (CeRMAS) 2) Fondazione Edmund Mach (FEM) Centro di Ricerca e Innovazione (CRI) Coordinatori principali: Riccardo ORUSA (IZSPLV - CeRMAS) Francesca CAGNACCI (FEM) Durata del progetto: 3 anni ( )

3 Introduzione IL CAPRIOLO IN ITALIA: UNA SPECIE IN ESPANSIONE Distribuzione del Capriolo al 1998 (Pedrotti et al. 2001) Distribuzione del Capriolo al 2006 (Carnevali et al. 2009) Distribuzione del Capriolo al 2010 (ISPRA, Manuali e Linee Guida 91/2013) Negli ultimi 30 anni, le popolazioni di capriolo in Italia hanno espanso il proprio areale (Carnevali et al. 2009)

4 Introduzione IL CAPRIOLO IN ITALIA: UNA SPECIE IN ESPANSIONE Distribuzione e densita delle popolazioni di Capriolo nelle unita di gestione (Carnevali et al. 2009)

5 Introduzione IL CAPRIOLO IN ITALIA: UNA SPECIE IN ESPANSIONE

6 Introduzione Il capriolo (Capreolus capreolus) è implicato nel ciclo di trasmissione di diverse malattie infettive e parassitarie, comprese alcune zoonosi (Carpi et al. 2009, Solarczyk et al. 2012) Malattie vettoriali: - Encefalite da zecche (TBE) - Malattia di Lyme - Anaplasmosi - Babesiosi

7 Introduzione Il capriolo (Capreolus capreolus) è implicato nel ciclo di trasmissione di diverse malattie infettive e parassitarie, comprese alcune zoonosi (Carpi et al. 2009, Solarczyk et al. 2012)

8 Introduzione Il capriolo (Capreolus capreolus) è implicato nel ciclo di trasmissione di diverse malattie infettive e parassitarie, comprese alcune zoonosi (Carpi et al. 2009, Solarczyk et al. 2012)

9 Introduzione MICROBIOTA INTESTINALE DEL CAPRIOLO Il ruolo del capriolo come serbatoio di batteri patogeni intestinali è poco conosciuto Le tecniche tradizionali (isolamento in coltura, identificazione microscopica da feci, PCR sequenze target) non consentono l'identificazione di tutte le specie presenti e sono poco informative in rapporto al tempo d'indagine Le tecniche molecolari Metabarcoding + Next-Generation Sequencing (NGS) per l'identificazione del microbiota a partire da matrici complesse (es. suolo, acqua, feci) sono molto più efficaci

10 Introduzione Definizioni Microbiota Microbioma!!! Microbiota = insieme dei microrganismi di un determinato Microbioma Microbioma = habitat + microrganismi + loro genomi + condizioni ambientali (cioè fattori biotici + fattori abiotici)

11 Introduzione Il microbiota varia nei diversi tratti dell'apparato gastro-intestinale?

12 Introduction Il microbiota varia nei diversi tratti dell'apparato gastro-intestinale? N.B. Il microbiota delle feci rappresenta un proxy del microbiota intestinale!!

13 Introduzione DIETA DEL CAPRIOLO Il capriolo si nutre di diverse specie vegetali l'analisi della dieta fornisce informazioni sull'impatto ecologico e sullo stato di salute Le tecniche tradizionali (osservazione diretta sul campo, identificazione tramite micro-istologia delle piante contenute nell'intestino di caprioli cacciati o nelle feci) necessitano di molto tempo e non permettono l'identificazione di tutte le specie Le tecniche molecolari Metabarcoding + Next-Generation Sequencing (NGS) si sono rivelate molto più efficaci e veloci (Soininen et al. 2009)

14 Introduzione Definizioni Barcoding standard Metabarcoding!!! Barcoding = identificazione di specie, a partire da un dato campione, attraverso una sequenza standard di DNA = sequenziamento di un singolo frammento di DNA Metabarcoding = identificazione di più specie all'interno di un pool di campioni o di una matrice complessa (es. suolo, acqua, feci) contenente DNA degradato = sequenziamento massivo e parallelo di numerosi frammenti di DNA

15 Introduzione Definizioni I metabarcodes sono sequenze corte!!

16 Introduzione DIETA applicazioni pratiche del metabarcoding

17 Introduzione Definizioni Metabarcoding (Metatassonomica) Metagenomica!!! Metabarcoding = identificazione di più specie all'interno di un pool di campioni o di una matrice complessa (es. suolo, acqua, feci) contenente DNA degradato = sequenziamento massivo e parallelo di numerosi frammenti di DNA Metagenomica = studio degli interi genomi (e quindi dei geni) degli organismi all'interno di una matrice complessa

18 Introduzione METABARCODING + NGS

19 Introduzione Firma del microbiota

20 Introduzione MICROBIOTA INTESTINALE Metabarcode procariotico

21 Introduction PROBLEMI: possibile cross-amplificazione di DNA Eucariotico

22 Introduzione Obiettivi del progetto 1. Caratterizzare il microbiota intestinale degli individui (con una particolare attenzione nei confronti dei batteri patogeni) 1.1. Verificare le differenze tra individui, sessi o categorie comportementali (residenti vs. migratori) 1.2. Verificare se vi siano variazioni stagionali nella composizione del microbiota individuale 1.3. Verificare se vi siano differenze tra i microbiota dei caprioli della Provincia di Trento e quelli della Regione Valle d'aosta (outgroup) 2. Caratterizzare la dieta (plante vascolari) degli individui nel corso delle stagioni 2.1. Verificare le differenze tra individui, sessi o categorie comportementali (residenti vs. migratori) 3. Verificare le correlazioni tra microbiota intestinale e dieta

23 Materiali & Metodi Area di studio SVIZZERA AUSTRIA SLOVENIA FRANCIA Regione Valle d'aosta ITALIA Provincia di Trento

24 Materiali & Metodi Campionamento SVIZZERA AUSTRIA SLOVENIA FRANCIA 66 caprioli cacciati (2013) ITALIA 19 caprioli catturati e marcati mediante radiocollare ( ) e monitorati per 1-2 anni

25 Materiali & Metodi Campionamento SVIZZERA AUSTRIA SLOVENIA FRANCIA Nécroscopie - tamponi rettali conservati a -80 C (66 campioni) ITALIA Cattura In campo - pelo (19 campioni) - biopsie (orecchio) - campioni fecali prelevati dal retto conservati in RNA-later (19 campioni) - campioni fecali raccolti sul campo (341 campioni) 1 aliquota conservata in RNA-later 1 aliquota conservata in Silica gel Lavoro di campo: 3 stagioni di campionamento/anno (inizio estate, estate, fine estate) 2-3 sessioni/stagione

26 Materiali & Metodi Per ogni animale: Provincia di Trento Catture In campo 1. pelo 2. biopsie (orecchio) 3. feci prelevatre dal retto 4. feci raccolte in campo Identificazione individuale Microbiota intestinale Identificazione individuale Microbiota intestinale Dieta (piante vascolari) Regione Valle d'aosta Necroscopie 1. tamponi rettali Microbiota intestinale

27 Materiali & Metodi

28 Materiali & Metodi Metabarcodes

29 Materiali & Metodi Per ogni animale: Provincia di Trento Catture In campo 1. pelo 2. biopsie (orecchio) 3. feci prelevatre dal retto 4. feci raccolte in campo Identificazione individuale Microbiota intestinale Identificazione individuale Microbiota intestinale Dieta (piante vascolari) Regione Valle d'aosta Necroscopie 1. tamponi rettali Microbiota intestinale

30 Materiali e Metodi Estrazione del DNA Necessità di ottenere DNA di capriolo + DNA batterico + DNA vegetale di buona qualità a partire da campioni di diverso tipo Diversi kit e protocolli d'estrazione sono stati testati: 1) Thermo Scientific KingFisher Cell and Tissue DNA kit (con modifiche) 2) QIAmp DNA Stool Minikit (Qiagen) 3) Mag-Bind Stool DNA kit (Omega bio-tek)

31 Materiali & Metodi Approccio generale identificazione individuale MARCATORI MICROSATELLITI (SSR) + marcatore del sesso 24 loci microsatelliti dinucleotidici (es: gtgtgtgt) + gene AMEL X,Y sono stati testati

32 Materiali & Metodi Approccio generale MICROBIOTA INTESTINALE (identificazione delle specie batteriche) sequenziamento della regione V3 V4 del gene 16S rrna (~450bp) Illumina MiSeq METABARCODING + NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS) DIETA (piante vascolari identificazione delle specie) sequenziamento del P6 loop dell'intronee cloroplastico trnl(uaa) (taglia media: 50bp) - Illumina HiSeq 2000

33 Materiali & Metodi Approccio generale Allineamento e comparazione delle sequenze (algoritmo BLAST) per l'identificazione dei batteri e delle piante Variazioni nelle sequenze (SNPs e/o indels) permettono l'identificazione delle diverse specie

34 Materiali & Metodi Approccio generale LIMITI del metabarcode P6 loop del trnl(uaa) intron: 1. necessità di un database di riferimento, focalizzato sulla flora locale 2. sequenze metabarcodes molto corte, inefficaci per l'identificazione a livello di specie nel caso di alcune famiglie (la sequenza completa dell'introne trnl(uaa) è più informativa, ma il DNA contenuto nelle feci è degradato) Per alcune famiglie, occorrono ulteriori metabarcodes (De Barba et al. 2014): Asteraceae, Cyperaceae, Poaceae : ITS1 Rosaceae: ITS2

35 RisultatI Identificazione individuale Elettroforesi su QIAxcel Ampliconi della regione di controllo (mtdna D-loop) DNA di capriolo da campioni fecali

36 Risultati Identificazione individuale MARCATORI MICROSATELLITI 2 loci non hanno amplificato 8 loci si sono rivelati monomorfi scartati 14 loci si sono rivelati polimorfi analisi in corso!

37 Risultati Identificazione individuale

38 Risultati Sessaggio Elettroforesi su Qiaxcel DNA di capriolo (gene AMEL X,Y) da biopsie

39 Risultati - Microbiota intestinale DNA batterico estratto e amplificazione metabarcode (regione V3-V4 del gene 16S rrna) Elettroforesi su QIAxcel Sequenziamento (ABI3130 Sequencer) Diverse sequenze sovrapposte = Diverse specie batteriche presenti Next-Generation Sequencing (NGS) (Illumina MiSeq) PROSSIMA TAPPA!!

40 Résultati - Dieta DNA vegetale estratto e amplificazione metabarcode (p6 loop de l'intron trnl) Sequenziamento (ABI3130 Sequencer) Elettroforesi su QIAxcel Diverse sequenze sovrapposte = Diverse specie vegetali presenti Next-Generation Sequencing (NGS) (Illumina HiSeq 2000) PROSSIMA TAPPA!!

41 SI RINGRAZIANO : Tutti coloro che hanno partecipato alla raccolta dei campioni Cristiano Vernesi, responsabile del Gruppo di Ricerca di Genetica di Conservazione (FEM) e Grazie a tutti voi per l'attenzione!!