STUDIO DELL INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA

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1 STUDIO DELL INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA Two-Hybrid Three-Hybrid Split-Ubiquitina Co-Immunoprecipitazione GST pull-down TAP-tag FRET Split YFP

2 Perchè studiare le interazioni proteina-proteina? Le interazioni tra due o più proteine sono necessari per regolare un gran numero di processi biologici. Infatti possono: Modificare le proprietà cinetiche di un enzima Permettere la corretta canalizzazione del substrato Formare nuovi siti di legame per molecole effettrici Inattivare/attivare proteine Cambiare la specificità per il substrato interagendo con differenti partner Svolgere attività regolative della funzione proteica IN BASE ALLE CARATTERISTICHE LE INTERAZIONE PROTEICHE POSSONO DIVIDERSI IN: - Omodimeri o eterodimeri - Obbligata/non obbligata (in base alla stabilità) - Permanenti o transienti: legami transienti sono necessari per le vie di segnalazioni, i legami permanenti formano complessi stabili L 80% delle proteine non funzionano da sole, ma in complessi

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5 Sistema del doppio ibrido (Yeast Two-Hybrid) Il sistema del doppio ibrido è una metodologia basata sulla modularità dei fattori di trascrizione, che permette di identificare eventuali interazioni proteiche. Grazie al doppio ibrido è possibile identificare e clonare contemporaneamente il gene che codifica per la proteina senza bisogno di informazioni preliminari o di strumenti precostituiti (es. anticorpi). Due proteine X e Y possono essere fuse rispettivamente al dominio di legame al DNA e al dominio di attivazione trascrizionale, che se separati non sono funzionali. Solo se X e Y interagiscono, allora il fattore trascrizionale si ricostituisce e c è attività trascrizionale.

6 Sistema del doppio ibrido (Yeast Two-Hybrid)

7 Fase 1: Costruzione dell esca e della preda E possibile ligare i geni che codificano per le due proteine di cui voglio testare l interazione, in frame, al dominio di legame al DNA (BD) di GAL4 o al dominio di attivazione trascrizionale di GAL4 (AD) così da ottenere due diverse proteine di fusione l esca e la preda rispettivamente. ESCA PREDA

8 Fase 2: Trasformazione di lievito Una volta ottenuti i costrutti dell esca e della preda, si introducono in ceppi di lievito che contengono un gene reporter controllato da una GAL4 UAS: Non si ha attivazione del gene reporter, a meno che il gene esca non codifichi per un attivatore trascrizionale. Non si ha attivazione del gene reporter, perché il dominio di attivazione trascrizionale non si troverà mai alla giusta distanza dal promotore, in quanto non c è il dominio di legame al DNA

9 Fase 3: Verifica dell interazione I costrutti esca e preda vengono trasformati contemporaneamente in lievito. Se le due proteine interagiscono il BD-esca e l AD-preda si ricostituiscono e si ha attivazione del gene reporter. Gene reporter utilizzati: AUR1-C conferisce resistenza all Aureobasidina A HIS3 conferisce al lievito la capacità di crescere su terreno minimo HislacZ, codifica per l enzima α- galattosidasi, che in presenza del substrato, X-gal, rende le colonie blu.

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11 Sistema del doppio ibrido (Yeast Two-Hybrid) «A novel Genetic System to detect protein-protein interactions» by S. Fields and O-K Song in 1989

12 Il problema dei falsi positivi.

13 Three Hybrid System Il Three Hybrid System viene utilizzato quando è necessario l intervento di un terzo componente per visualizzare l interazione proteina-proteina: 1. Modifiche post-traduzionali 2. Interazioni RNA-proteine 3. Interazioni Proteina- Piccole molecole 4. Attività enzimatica

14 Un esempio di applicazione di Three Hybrid System: Interazione RNA-proteina Il DNA binding site è costituito da 17pb del recognition site della proteina LexA di E. Coli, a monte dei 2 reporter His3 e LacZ; La prima proteina chimerica è costituita da LexA BD fuso alla proteina del coat del batteriofago MS2, piccolo polipeptide che lega come dimero una corta sequenza stem-loop; L RNA ibrido consiste di 2 Binding Sites per MS2 legati ad una sequenza RNA di interesse X; La seconda proteina chimerica è costituita dal AD di GAL4 fuso ad una RNA Binding Protein di interesse Y.

15 Sistema split-ubiquitina Il sistema dello split-ubiquitina, permette di studiare proteine che non possono essere espresse nel nucleo, quindi non analizzabili con il doppio ibrido, o fortemente idrofobiche, quindi difficili da studiare con metodi biochimici, come ad esempio le proteine di membrana. L ubiquitina è una piccola proteina che si lega covalentemente a proteine target indirizzandole alla degradazione via proteasoma. L ubiquitina non viene degradata dal proteasoma perché esistono proteasi ubiquitina-specifiche (UBP) che tagliano l ubiquitina dalla proteina target, permettendone il riciclo.

16 Sistema split-ubiquitina Se il dominio N-terminale e il dominio C-terminale vengono espressi in lievito, le due porzioni dell ubiquitina si riassociano spontaneamente e sono riconosciute da UBP. Nel sistema split-ubiquitina si è modificato un residuo amminoacidico nel dominio N-terminale che determina una diminuzione dell affinità tra i due domini. Se i domini N-terminale e C-terminale vengono fusi rispettivamente a due proteine X e Y, solo se le due proteine interagiscono si avrà la ricostituzione dell ubiquitina e il taglio da parte dell UBP

17 Sistema split-ubiquitina

18 Screening di librerie di fusione Per individuare nuovi interattori di una proteina di interesse è possibile sfruttare i sistemi del doppio ibrido e dello split-ubiquitina per screenare una libreria a cdna.

19 Screening di librerie di fusione

20 Metodi biochimici: Co-Immunoprecipitazione Grazie alla Co-IP posso isolare una proteina d interesse che interagisce con la sua proteina target e analizzare ogni componente attraverso Western blot o spettrometria di massa. Se due o più proteine interagiscono tra di loro e una delle due lega una anticorpo con alta affinità, ne consegue che anche l altra può co-precipitare. Posso visualizzare l interazione tra due proteine in vivo

21 Co-Immunoprecipitazione Scelta della strategia da utilizzare per immunoprecipitare la proteina d interesse (ESCA): Immunoprecipitazione con ANTICORPI: è importante scegliere un anticorpo con alta specificità e affinità per la proteina Utilizzo di proteine taggate: devo produrre linee cellulari esprimenti proteine fuse con epitopi riconosciuti da anticorpi commerciali. Gli epitopi più usati sono: HA, MYC, HIS

22 Co-Immunoprecipitazione Scegliere con attenzione il tessuto da cui partire e preparare il lisato cellulare con oppurtuni buffer di estrazione Lasciare incubare il lisato cellulare con un anticorpo specifico contro la proteina d interesse, così che si formi il complesso anticorpo-antigene. Vengono utilizzate resine di agarosio coniugate con le proteine A o G di Stafilococco, che sono in grado di legare la porzione Fc degli anticorpi

23 Dopo diverse ore di incubazione la proteina, con gli eventuali interattori, saranno legati alla resina tramite l anticorpo Si prosegue con una serie di lavaggi per eliminare eventuali interazione aspecifiche e si risospende la resina con un buffer che permette la dissociazione del complesso proteico dalla resina Vantaggi: permette di identificare l interazione proteica in vivo Svantaggi: devo avere gli anticorpi specifici o linee cellulari che esprimano la proteina taggata. Se non conosco già l interattore devo procedere a spettrometria di massa per identificarlo, i.e. non isolo direttamente il gene che lo codifica

24 6. Western Blot per visualizzare l interazione IP INPUT - MOV10 Vantaggi: permette di identificare l interazione proteica in vivo Svantaggi: devo avere gli anticorpi specifici o linee cellulari che esprimano la proteina taggata. Se non conosco già l interattore devo procedere a spettrometria di massa per identificarlo, i.e. non isolo direttamente il gene che lo codifica

25 GST Pull-down E possibile far esprimere la proteina d interesse in sistemi eterologhi (es. E. Coli) fusa con un tag GST. Il sistema GST pull-down può essere utilizzato quando non si hanno anticorpi specifici contro la proteina oppure non si riescono ad ottenere linee cellulari che esprimano in modo adeguato la proteina taggata. L anticorpo viene sostituito con un sistema ad affinità costituito da una resina con glutanione che è in grado di trattenere proteine fuse al tag GST. Oppure resine di nichel in grado di trattenere proteine con tag ad His.

26 GST Pull-down 1. Espressione della proteina (esca) d interesse fusa all epitopo GST in un sistema eterologo (es. E. Coli) e purificazione 2. Preparazione del lisato cellulare 3. Legare la proteina fusa all epitopo GST alla resina a glutanione e incubare con il lisato cellulare

27 GST Pull-down 4. Analisi dell immunoprecipitato per Western blot Problemi dell espressione della proteina in sistemi eterologhi: - La proteina non si esprime; - la proteina non è purificabile, perché insolubile; - la proteina non è funzionale.

28 Un esempio di interazione proteina-proteina 1) DOPPIO IBRIDO 2)Co-IP (analisi in vivo) anti-rga anti-rga 3) Analisi della localizzazione subcellulare delle proteine interagenti tramite l utilizzo di fluorofori

29 Sistema TAP-tag Il TAP tag è un Sistema per l isolamento di complessi proteici nella loro forma native. Prevede che la proteina d interessa venga fusa ad un tag a doppia-affinità, così da permettere una purificazione a doppio step che garantisce l integrità del complesso. Rispetto ai sistemi a singola purificazione (Co-IP) il TAP tag riduce il segnale di background garantendo un alta puritàdel complesso Il TAP-tag è il sistema ideale per analizzare e caratterizzare complessi multiproteici tramite spettrometria di massa.

30 Sistema TAP-tag

31 TAP-tag System

32 Evoluzione del TAP-tag...

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34 Identificazione di interazioni Proteina-Proteina tramite Immunoprecipitazione combinata a Spettrometria di Massa

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36 Principali fluorofori utilizzati per FRET e BiFC

37 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

38 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) VANTAGGI: permette di studiare le interazioni-proteina-proteina in vivo e in tempo reale SVANTAGGI: è molto difficile da mettere a punto: è necessario acquisire immagini a due diversi tipi di lunghezza d onda. Inoltre è necessario che le due proteine siano strettamente associate (meno di 10nm).

39 Split YFP or BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation)

40 Split YFP or BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) INTERAZIONE NESSUNA INTERAZIONE

41 VANTAGGI: Il segnale emesso può essere visualizzato tramite microscopi a fluorescenza o analizzato tramite citometria a flusso. La BiFC può essere utilizzata anche per analizzare la localizzazione subcellulare, fornendo informazioni anche riguardo alla funzione dell interazione. Non sono necessari particolari trattamenti cellulari, permettendo di visualizzare la localizzazione dell interazione proteica nelle normali condizioni cellulari. Al contrario della FRET, un esperimento di BiFC può essere utilizzato anche per visualizzare interazione proteiche all interno di un complesso, anche se le due proteine sono sono strettamente associate. SVANTAGGI: La fusione della proteina con il frammento del cromoforo può produrre impedimenti stechiometrici o problemi del folding della proteina, impedendo l interazione proteinaproteina Per visualizzare il segnale luminoso sono necessarie diverse ore, impedendo così di visualizzare l interazione in «tempo reale». Sono necessari oppurtuni controlli positivi e negativi al fine di evitare i falsi positivi dovuti a segnali di background.

42 Posso utilizzare la BiFC anche per studiare quali residui di una proteina sono necessari per l interazione proteina-proteina Proteina B WT Proteina B mutata

43 Applicazione della BiFC su larga scala... Produzione di ceppi contenenti ORF di 5911 geni taggati con il dominio N- terminal di Venus (VN) La proteina esca è stata fusa al dominio C-terminale di Venus (CN) Produzione di diploidi Analisi della fluorescenza derivata dalla formazione del complesso (BiFC)

44 Protein Array

45 METODI in silico PER LA PREDIZIONE DI INTERAZIONI TRA PROTEINE Metodo predittivo basato sulla struttura proteica: si basa sul concetto che due proteine interagenti hanno una struttura (primaria, secondaria, terziaria) simile. Nel caso in cui non si conosca la struttura esistono software in grado di predire la struttura a partire dalla sequenza (Protein Data Bank) Metodo predittivo basato sulla sequenza: si predicono interazioni proteina-proteina basandosi sulle omologie di sequenza. Un interazione trovata in una specie può essere usata per dedurre interazioni in altre specie. Metodo «Rosetta stone»: si basa sul concetto di fusione genica, secondo il quale una proteina a singolo dominio in un organismo possa essersi fusa per formare una proteina multidominio in altri organismi.

46 INTERATTOMA: network di tutte le possibili interazioni proteina-proteina in una cellula

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