Biochimica e biochimica applicata Biologia molecolare CdL Farmacia

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1 Tecniche di biologia molecolare Introduzione alla biologia molecolare Struttura degli acidi nucleici Enzimi usati in biologia molecolare Gli enzimi di restrizione Ligasi Purificazione dell mrna e ottenimento del cdna PCR Produzione di DNA ricombinante Introduzione alla biologia molecolare I Le caratteristiche morfologiche e funzionali delle cellule sono determinate dalle proteine (strutturali, di membrana, enzimatiche ). La biologia molecolare è studio dei fenomeni biologici in termini di strutture e interazioni tra gli acidi nucleici e le proteine. Alla base della biologia molecolare è il concetto che il DNA e l RNA sono macromolecole informazionali: il DNA contiene tutte le informazioni necessarie a specificare le sequenze primarie di tutte le proteine di un organismo Nessuna cellula è in grado di produrre una proteina per la quale non ci sia un informazione precodificata nel DNA Introduzione alla biologia molecolare II Gene: porzione del DNA che contiene le informazioni necessarie perché venga prodotta una proteina. Nei batteri i geni sono organizzati in operoni: singole unità trascrizionali che definiscono un certo numero di enzimi associati in una via metabolica (regioni regolatrici + porzione codificante) Negli eucarioti i segmenti codificanti (esoni) sono interrotti da segmenti non codificanti (introni). Un gene eucariota, quindi contiene le regioni regolatrici + introni + esoni.

2 Introduzione alla biologia molecolare III Il DNA non prende parte direttamente alla sintesi proteica. Il DNA viene trascritto in diverse specie di RNA. L mrna serve a definire la sequenza aminoacidica primaria. Il flusso di informazioni DNA mrna proteina è quasi universale. Fanno eccezione, ad esempio, i virus: l RNA virale, infatti, fa da stampo per la produzione di DNA nella cellula infettata (il flusso di informazioni, quindi, è RNAvirale cdna mrnaospite proteina)

3 Struttura degli acidi nucleici: Il DNA è costituito da una doppia elica. Ogni catena è un polimero di β- deossinucleosidi uniti da legami fosfodiestere (tra i C 5 e 3 di due residui deossiribonucleici vicini). Al C 1 di ogni deossiribosio è legata una base purinica (A o G) o pirimidinica (T o C). Le basi azotate hanno funzione INFORMAZIONALE, gli zuccheri e il fosfato hanno funzione strutturale. Le due catene del DNA sono antiparellele (l estremità 5 di una catena è adiacente all estremità 3 dell altra) e complementari (una base purinica di una catena è adiacente ad una base pirimidinica dell altra).

4 Le catene sono tenute insieme da legami deboli: tra l adenina e la timina si formano due legami idrogeno, tra la guanina e la citosina tre. L RNA differisce dal DNA perché lo zucchero presente è il ribosio invece del desossiribosio; perché presenta l uracile invece della timina e perché è costituito da una singola elica (possono comunque formarsi dei loop tra zone complementari della singola elica). La biologia molecolare è nata negli anni 70 e si basa sulla disponibilità di enzimi capaci di tagliare, unire e replicare il DNA in maniera specifica e trascrivere l RNA in DNA.

5 Enzimi usati in biologia molecolare Enzimi di restrizione a) Ruolo naturale Le nucleasi sono enzimi capaci di degradare gli acidi nucleici. Le nucleasi sono metalloenzimi (la max parte è Mg 2+ dipendente, altre utilizzano Cu 2+, Co 2+, Mn 2+, Zn 2+ ). Le nucleasi aspecifiche (DNasi I e RNasi I) agiscono in maniera casuale sulle catene. Le endonucleasi di restrizione, invece, riconoscono siti specifici sul DNA a doppio filamento e lo tagliano in punti specifici. In genere il tratto riconosciuto ha una lunghezza di 4 8 bp. tagliano il DNA a doppia elica solo in corrispondenza di specifiche sequenze a. Ruolo naturale Proteggere i batteri da virus (tagliando il DNA virale) Il DNA batterico è protetto dall azione degli enzimi di modificazione b. Sequenze riconosciute zone del DNA dove avviene il taglio Sequenza riconosciuta da EcoRI GAATTC CTTAAG Sequenze Palindrome Sito di taglio

6 Dopo il taglio G CTTAA AATTC G sticky ends Possono sporgere estremità a singolo filamento TTTAAA AAATTT DraI TTT AAA AAA TTT Oppure estremità piatte (blunt ends) Gli enzimi di restrizione sono prodotti dai batteri (protezione contro DNA estraneo); la sigla che li indica trae origine dal ceppo batterico (prima lettera del genere e prime due lettere della specie) nel quale sono stati isolati (se in uno stesso organismo esistono più sistemi di restrizione, questi sono identificati con numeri romani).

7 In laboratorio: si lascia in incubazione il DNA da digerire con l enzima adeguato (in condizioni sperimentali adeguate: concentrazione enzima, tampone di incubazione, temperatura e tempo di digestione). La digestione viene poi bloccata degradando l enzima con la temperatura (se possibile) oppure caricando il prodotto di digestione su gel di agarosio e recuperando il DNA dal gel. Ligasi La DNA ligasi è un enzima che salda le discontinuità nei filamenti di DNA a doppia elica. Tali enzimi richiedono cofattori energetici per funzionare (ATP la T4 DNA ligasi e NAD + la DNA ligasi). Il cofattore viene scisso a formare un intermedio ad alta energia enzima-amp, che si lega al punto di rottura sul DNA e ripristina il legame covalente sulla catena del DNA in seguito ad attacco nucleofilo dell intermedio da parte del gruppo 3 OH adiacente.

8 La reazione catalizzata dalla DNA ligasi. La DNA ligasi usa una molecola di ATP per attivare il 5 end (step 1) prima di formare il nuovo legame (step 2). La ligazione ricostruisce il sito di taglio (se il frammento di DNA è stato ligato in un vettore, quindi, sarà poi recuperabile dal vettore tramite digestione con lo stesso enzima di restrizione). Purificazione dell mrna. Nei batteri ogni proteina corrisponde esattamente alla sequenza nucleotidica del DNA. I geni degli eucarioti, invece, sono interrotti : la parte codificante (esoni) è frammentata da porzioni non codificanti (introni).

9 Per ottenere una proteina ricombinante eucariotica, quindi, non si potrà partire dal DNA genomico e clonarlo nei batteri (questi non dispongono degli apparati necessari a processare il DNA complesso degli eucarioti). Si rende necessario partire da un informazione già processata: l mrna maturo (già passato attraverso lo splicing, rimozione introni). Particolare attenzione deve essere posta affinché l RNA non venga degradato dall RNasi. Le ribonucleasi sono enzimi molto stabili e attivi che non richiedono cofattori per funzionare. L operatore deve indossare guanti ed utilizzare esclusivamente materiale (puntali, microprovette, ) RNasi free. Il metodo ideale per estrarre RNA totale da tessuti e cellule prevede l uso di guanidina isotiocianato nella fase di lisi delle cellule o rottura del tessuto: il tessuto, prelevato in condizioni di sterilità, viene posto in azoto liquido ed utilizzato immediatamente oppure posto a 80 C. Un trattamento con DNasi viene impiegato per rimuovere il DNA e l RNA può essere precipitato con etanolo.

10 Protocollo sperimentale: 1) All uso il tessuto viene omogenato in presenza di guanidina isotiocianato (inattiva le RNasi) 2) Le proteine vengono allontanate con un estrazione fenolo/cloroformio/alcool isoamilico 3) Il DNA genomico viene distrutto con DNasi Poiché tutti gli mrna degli eucarioti contengono una coda di poli(a), la separazione degli mrna da una preparazione di RNA totale può essere fatta facendo passare l RNA totale attraverso una colonna costituita da materiale inerte (cellulosa o agarosio) alla quale sono stati legati degli oligonucleotidi costituiti interamente da residui di desossitimina (dt). Le code poli(a) si ibridano a questi oligo (dt): l mrna resta attaccato alla colonna mentre il rimanente RNA (rrna e trna) viene eliminato. Dopo un abbondante lavaggio si passa sulla colonna un tampone a bassa forza ionica: in queste condizioni gli ibridi poli(a)-oligo(dt) si dissociano e l mrna purificato viene eluito dalla colonna.

11 PCR DNA polimerasi: enzima capace di produrre una catena di DNA complementare ad una catena a singolo filamento. La PCR (reazione a catena della polimerasi) consente l amplificazione di un frammento di DNA specifico a partire da una minima quantità di DNA stampo. La reazione richiede: uno stampo di DNA, una miscela di nucleotidi e due inneschi (primers) con un 3 -OH libero che definiscono i punti di inizio della sintesi del DNA. Se si parte da DNA a doppio filamento è necessario separare le catene perché i primers possano poi legarsi alla zona a loro complementare. La PCR, quindi, consiste nel ripetersi di cicli in cui si fa variare la temperatura: a) denaturazione (94-95 C) rottura dei legami idrogeno e separazione dei filamenti b) appaiamento (T specifica) i primers legano la catena nella zona a loro complementare c) estensione (T ottimale per la polimerasi in uso) produzione dei frammenti Alla fine di x cicli di PCR, il prodotto viene controllato: tramite gel di agarosio oppure tramite sequenziamento ed utilizzato.

12 Polymerase chain reaction (PCR) Consente l amplificazione del DNA stampo. A. applicazioni B. Componenti della reazione C. procedura A. applicazioni Amplificazione del DNA per clonaggio di geni amplificazione di sequenze B. componenti della reazione Stampo di DNA DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi) 2 DNA primers 4 deossinucleotidi tampone

13 I 2 primers legano il DNA su filamenti opposti primers stampo 5' Riscaldamento: separa I filamenti Raffreddamento: appaiamento dei primers 5' Primer #1 Primer #2 C. procedura 1. denaturare il DNA stampo stampo primers DNA polimerasi Denaturaz. a 94 C 2 appaiamento dei primers appaiamento a ~ 50ºC primers legano la regione complementare

14 3. estensione utilizzando la DNA polimerasi estensione a 72ºC 4. ripetizione steps 1-3, ~ 35 volte (35 cicli) secondo ciclo denaturazione secondo ciclo appaiamento

15 secondo ciclo estensione 35 cicli stampo Prodotto finale I primers sono incorporati nel prodotto Prodotto ottenuto da I molecola di stampo = (quantità di stampo) x 2 (numero di cicli) = (1) x 2 35 = 3.4 x molecole 34,000,000,000

16 RT-PCR l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di moloney MuLV) in presenza di nucleotidi e di un singolo primer. Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Il risultato della reazione di retrotrascrizione produce degli ibridi RNA-DNA. Per clonare le molecole di cdna, le catene di RNA devono essere distrutte e sostituite da DNA. Un metodo per far ciò consiste nell uso di RNasi H, che taglia l RNA negli ibridi; oppure L RNA viene allontanato dal DNA per semplice denaturazione ottenuta con riscaldamento. Il cdna fa poi da stampo nella successiva reazione di riamplificazione (PCR classica) in cui si utilizzano primers gene specifici (oppure un primer specifico ed un primer aspecifico).

17 I Plasmidi Trasformazione tramite calcio cloruro Trasformazione tramite elettroporazione DNA ricombinante: un frammento di DNA di interesse di un organismo viene inserito in una molecola di DNA di un altro organismo più semplice. In genere il veicolo (vettore) in cui si inserisce il frammento è in grado di replicarsi selettivamente permettendo di amplificare il DNA di interesse. Gli ospiti per il mantenimento e l amplificazione sono, in genere, i batteri. Vettori per il clonaggio Plasmidi Mediante il clonaggio è possibile produrre quantità illimitate di un determinato frammento di DNA. Il DNA viene introdotto in un adatta cellula ospite ove viene replicato in accordo alla crescita e divisione della cellula. La replicazione del DNA esogeno all interno della cellula ospite è possibile solo se il DNA contiene una sequenza riconosciuta dall ospite come origine della replicazione.

18 La maggior parte del DNA non contiene tale sequenza, perciò è necessario che il DNA da clonare sia unito ad un trasportatore o vettore di DNA, che contenga l origine della replicazione. Molti batteri contengono questo tipo di DNA, detto Plasmide. Un plasmide è una molecola di DNA extracromosomico, relativamente piccola, circolare contenente geni che conferiscono proprietà particolari come la resistenza ad antibiotici. A partire da quelli naturali, mediante una serie di tagli e ligazioni, sono stati costruiti dei plasmidi artificiali. I requisiti di un plasmide ottimale sono i seguenti: a) essere piccolo e quindi facilmente maneggiabile e non creare problemi durante la trasformazione. b)possedere un origine della replicazione di tipo batterico c) Possedere geni che conferiscano resistenza ad antibiotici, così da permettere la selezione delle cellule trasformate d) Possedere un buon numero di siti unici di restrizione ( ricco polylinker)

19 vettori di clonaggio A. requisiti B. esempi Ap R restriction site ori A. requisiti 1. Origine di replicazione (ori) 2. Siti di restrizione unici (single cut) 3. Essere selezionabili Ap R restriction site Tc R Ap R = ampicillin resistance gene Tc R = tetracycline resistance gene ori Schema di clonaggio: 1)scelta del vettore da utilizzare per il clonaggio 2) analisi del polylinker 3) digestione del vettore e del DNA di interesse con gli stessi enzimi di restrizione, in modo da creare estremità compatibili 4) caricamento del vettore e del DNA digeriti su gel di agarosio

20 5) recupero dal gel 6) Ligazione 7) trasformazione di cellule competenti con i prodotti di ligazione 8) recupero delle colonie cresciute su terreno selettivo 9) purificazione del DNA plasmidico e valutazione dell avvenuto clonaggio plasmide (inserto fino a~10 kb) vettore Ap R pbr322 BamHI Tc R DNA di interesse BamHI sites ori Ap R = resistenza all ampicillina Tc R = resistenza alla tetraciclina ori = origine della replicazione BamHI = sito di restrizione unico digestione con Bam HI Tc R DNA di interesse ligazione DNA clonato Mix di [vettore con il DNA clonato], e vettore solo

21 DNA di interesse 1. Isolare DNA clonato (inserto) Vettore di clonaggio 2. Digerire il DNA e il vettore 3. Ligare vettore Uno o più cloni contengono il DNA di interesse 4. Introdurre il DNA in un ospite Cellula ospite 5. Identificare il clone di interesse Cellule competenti: cellule batteriche rese capaci di accettare l ingresso di plasmidi. La membrana diviene permeabile temporaneamente in seguito al trattamento, in condizioni adeguate, dei batteri con delle soluzioni contenenti ioni Ca 2+. Selezione: discriminazione delle cellule che hanno consentito l ingresso del plasmide (portante la resistenza ad un determinato antibiotico) rispetto a quelle che non l hanno fatto (incapaci di sopravvivere in presenza dell antibiotico). Marker di selezione È un gene il cui prodotto può essere usato per selezionare le cellule che portano il plasmide di interesse Marker di inattivazione genica E un gene che viene distrutto (inattivato) quando un gene di interesse viene clonato nel plasmide

22 Un marker di inattivazione genica è lacz (codifica per beta-galattosidasi) Ap R ori X-gal (intatto) BamH1 lacz beta-galactosidasi taglia X-gal e ciò si manifesta con una colorazione blu O Cl O Br HO Cl Br N beta-galactosidase N O OH prodotto BLU Le colonie che contengono il vettore SENZA un inserto sono blu. Ap R ori BamH1 lacz + ampicillina + X-gal Quelle che hanno il vettore +l inserto sono bianche Il DNA esogeno inattiva lacz La beta-galattosidasi non viene prodotta X-gal non viene tagliato le colonie con l inserto sono bianche,, NON blu insert X (LacZ-) X-gal X + ampicillina + X-gal

23 Vettore di espressione: consente l espressione dei geni in esso clonati P Siti di restrizione unici P = promotore ori marker di selezione gene di interesse Metodi di trasformazione La trasformazione batterica è definita come il cambiamento ereditabile delle proprietà dei batteri causato dall assunzione di DNA esogeno. Gli acidi nucleici non entrano nelle cellule spontaneamente ma richiedono assistenza per attraversare le barriere fisiche e raggiungere il sito all interno della cellula dove possano essere espressi o replicati. La competenza è la capacità di assumere DNA. In laboratorio si ricorre all uso di cellule di E. coli quali ospiti. Tali batteri non sono naturalmente competenti, ma vengono resi tali tramite pretrattamento a 0 C con soluzioni contenenti cloruro di calcio

24 DNA esogeno (plasmide) Cellula trasformata 1. Competenza Capacità delle cellule di acquisire DNA estraneo Alcune cellule possono divenire competenti a seguito a trattamenti chimici e fisici (soluzioni con cloruro di calcio). Molte cellule sono rese competenti tramite elettroporazione. La vitalità cellulare e la capacità competente diminuiscono con il tempo (solitamente sono utilizzabili per circa 6 mesi dalla data di preparazione). Il trattamento dei batteri con soluzioni contenti, oltre al CaCl 2, anche Mg 2+, Rb 2+ o K +, aumenta l efficienza di trasformazione.

25 I cationi divalenti possono avere 3 ruoli nell aiutare la trasformazione: 1) i cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (gruppi fosfato) e sulla superficie della cellula (fosfolipidi e lipopolisaccaridi di superficie) così che il DNA può entrare più facilmente in stretto contatto con la cellula 2) la combinazione di bassa temperatura e cationi divalenti può aiutare a cristallizzare regioni della membrana rendendo accessibili i canali di assunzione del DNA 3) i cationi divalenti possono aiutare a riorganizzare i lipopolisaccaridi lontano dai canali che normalmente sovrastano L ingresso effettivo dell acido nucleico esogeno è provocato dallo shock termico. Trasformazione tramite elettroporazione: L esposizione di cellule animali, vegetali e batteri ad impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizza la membrana cellulare ed induce la formazione transiente di pori che favorisce l ingresso delle molecole di DNA. Tale metodo è rapido, semplice e efficiente. In genere l efficienza di trasformazione è circa volte maggiore per cellule preparate tramite elettroporazione rispetto a quelle trattate chimicamente. Elettroporazione cellule + DNA Elettrodo - elettrodo + Un breve impulso elettrico favorisce la formazione di pori nella membrana cellulare e il DNA entra

26 Tramite elettroporazione, inoltre, è possibile introdurre, nelle cellule ospiti, anche molecole di DNA di notevoli dimensioni. I fattori che influenzano l efficienza dell elettroporazione sono la temperatura, i parametri elettrici (voltaggio, resistenza, ), il tipo di DNA utilizzato e le caratteristiche delle cellule riceventi (condizioni di crescita, trattamento postelettroporazione). Elettroforesi su gel L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce sulla particella. Nell elettroforesi su gel c è un mezzo di supporto che agisce impedendo disturbi meccanici e di convenzione durante la migrazione e che serve da setaccio molecolare per separare le molecole, provviste della stessa carica, in base alle dimensioni. La matrice può essere costituita da poliacrilammide, agarosio o una miscela di questi. I gel di agarosio sono largamente impiegati per separare molecole di DNA di dimensioni maggiori di 100 bp, si ricorre ai gel di acrilammide quando serve una risoluzione maggiore per frammenti di DNA di piccole dimensioni.

27 L agarosio è un polisaccaride lineare purificato dall agar-agar delle alghe rosse; è solubile in acqua bollente e quando la soluzione si raffredda si forma un gel a causa della formazione di legami idrogeno tra le catene polimeriche dell agarosio. Solitamente la preparazione di gel d agarosio richiede pochi minuti: a) si pesa l agarosio b) si aggiunge l adeguata quantità di tampone TAE (Tris-acido acetico-edta) c) si scioglie l agarosio d) si aggiunge bromuro d etidio (colorante che si lega al DNA intercalandosi tra le basi complementari e mostra una forte fluorescenza quando illuminato con luce UV) in concentrazione pari a 0.5-1mg/ml e) si lascia solidificare il gel f) il DNA viene addizionato di una soluzione tampone contenente il 30% di glicerolo e coloranti quali il blu di bromofenolo e lo xylene cianolo Il gel viene posto nella camera di corsa, si carica il campione e si attende che il DNA migri verso il polo positivo (i coloranti addizionati indicano l avanzamento del campione nel gel).

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29 In alcuni casi è necessario recuperare il DNA dopo la corsa elettroforetica: il frammento di DNA di interesse viene tagliato dal gel, posto su un transilluminatore, con un bisturi e posto in una microprovetta. La matrice di agarosio viene sciolta in un bagnetto termostatato, la soluzione ottenuta viene caricata su una resina. Solo il DNA resta legato alla resina mentre il resto (agarosio e sali) viene rimosso tramite tamponi di lavaggio contenenti Sali e etanolo Si lascia evaporare l etanolo e si eluisce il DNA con acqua. Attrezzature per elettroforesi orizzontale su gel di agarosio