Introduzione al programma grafico Pymol

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1 Utilizzeremo il programma grafico pymol (che potete installare ) per visualizzare la struttura tridimensionale della proteina C, mutare alcuni residui, salvare il modello dei mutanti nel formato pdb da utilizzare per lo studio elettrostatico. Introduzione al programma grafico Pymol Useremo la Protein C per introdurre il programma Pymol. L interfaccia grafica di Pymol è suddivisa in due parti : una finestra menu e una finestra principale

2 Caricare le coordinate della struttura della proteina C La struttura della proteina C può essere letta o direttamente dal file PDB o dalla banca dati PDB attraverso internet. Per leggere dal file PDB si usa: File menu: File>Open, aprite il file 1aut.pdb per leggerlo direttamente dalla banca dati usate Loader Service plugin: Plugin>PDB Loader Service plugin si apre una finestrella che vi chiede Please enter a 4-digit pdb code (1aut è il codice identificativo della proteina C). Utilizzate entrambi i metodi per caricare le coordinate della Proteina C. Utilizzo del mouse per ruotare, zoom e muovere la struttura Ruotare Schiacciare il bottone sinistro del mouse e muovete il mouse. Zoom Schiacciare il bottone destro del mouse e muovere il mouse. Muovere Schiacciare il bottone sinistro del mouse più il tasto Ctrl e muovere il mouse. Per ritornare nella visualizzazione iniziale schiacciare sul bottone Reset della finestra menu. Piani di taglio I piani di taglio consentono di focalizzare la vista su un particolare. Questi piani si muovono muovendo il mouse lungo la finestra e mantenendo schiacciati i il bottone destro del mouse più il tasto Shift. Una mappa di come vengono illustrati i piani di taglio è di seguito esposta: Il tasto Reset svolge una funzione di annulla

3 Objects and selections Il codice PDB che identifica la struttura della proteina C che avete caricato è visualizzato sul lato destro in alto della finestra principale (1aut). Si possono caricare contemporaneamente più strutture, ognuna avrà una linea separata e Pymol le considera come oggetti separati. Quando si selezionano delle parti delle strutture queste sono elencate su nuove linee. Per distinguere le selezioni dagli oggetti, le selezioni sono sempre rappresentate tra parentesi (N.B.: cancellando una selezione non vengono eliminati gli atomi o i residui). Appena caricate la struttura potete notare una selezione nominata (all): questa selezione rappresenta tutto gli oggetti caricati con PyMol. Schiacciando su un residuo della struttura presente nella finestra principale appare una nuova selezione. Notare due cose: Una nuova linea nomi chiamata (sel01) appare e corrisponde al residuo selezionato. L oggetto e la selezione può essere reso attivo o inattivo schiacciando la barra grigia che contiene il nome. Schiacciando sulla linea 1aut_pdb, potete notare che la struttura scompare, schiacciando ulteriormente la barra grigia la struttura ricompare nella finestra principale.

4 Menu della finestra principale Ogni oggetto o selezione ha un serie di menu associati che sono accessibili schiacciando le lettere situate sulla destra del nome. A Action S Show H Hide L Label C Colour Il menu action Esplorate il menu action. Vediamo come si possono visualizzare i legami a idrogeno all interno dell oggetto 1aut: Selezionate A (Action) >find>polar contact>involving side chains Se dovete rimuovere l oggetto o la selezione questo può essere fatto dal menu action. I menus show e hide I menus show e hide possono essere usati per scegliere le diverse rappresentazioni della struttura, ad esempio lines, sticks, ribbon, cartoon, spere(cpk) e superficie. Esplorate le diverse rappresentazioni selezionandole dal menu show, provate differenti combinazioni di rappresentazioni.

5 Se arrivate a una visualizzazione della struttura non consona al vostro fine, il menu hide ha il sottomenu everything che nasconde tutta la rappresentazione e vi consente di ripartire (H>everything). Il menu colour Provate a colorare la struttura in diversi modi, ( il tipo di colorazione dev essere combinata con la corretta rappresentazione molecolare). Es. la colorazione in base agli elementi può essere usata con la rappresentazione lines, sticks, spheres and surface, mentre la colorazione in base alla struttura secondaria (by ss) può essere utilizzata con la rappresentazione a cartoon dove si evidenziano gli elementi di struttura secondaria eliche, sheet e loop. Visualizzazione della sequenza e selezione dei residui Pymol permette di rappresentare la sequenza e di selezionare uno o più residui contemporaneamente Visualizzazione della sequenza: Display>Sequence sulla finestra menu. Quante catene osservate, sono presenti molecole di acqua di cristallizzazione e eteroatomi? Nascondete le molecole di acqua e il ligando. Provate a evidenziare alcuni residui sulla struttura premendo sulla sequenza Scegliete le diverse rappresentazioni e colorate i residui rappresentati.

6 Salvare la sessione La sessione può essere salvata per essere utilizzata sucessivamente: Dalla finestra menu: File>Save session. Manipolare la struttura utilizzando i comandi di Pymol Alcune cose sono difficili o impossibili da fare con il mouse e con il menus. Per esempio selezionare le catene, gli elementi di struttura secondaria o i residui aminoacidici con il nome o il numero. Il modo per fare questo è di usare sono i comandi di PyMol, utilizzando il prompt presente nella parte bassa del finestra principale. Con pymol è possibile listare i comandi in un file di script. selezionare le catene La struttura della Proteina C è caratterizzata dalla presenza di due catene la catena leggera L e la catena pesante C, inoltre la proteina è stata cristallizzata con il suo inibitore (DPN PRO MAI). Il comando per selezionare la catena C: select chain C rinominiamo la selezione sel01 con il nome chain C: set_name sel01, chain C Provate a rappresentare e colorare la catena C usando i menus della selezione chain C zoom della catena C: zoom chain C selezione degli elementi della struttura secondaria: i seguenti comandi nominano la selezione degli elementi delle strutture secondarie: select helix, ss h select sheet, ss s select loops, ss l Se analizzate la sequenza della catena cristallografica la numerazione della catena C presenta dei residui numerati con un numero e quello successivo con una lettera per semplificare le operazioni successive andate sulla finestra menu: File>Reinitialize Dalla finestra menu caricate il file pdb 1aut_chain_C.pdb

7 selezioniamo i residui con il nome e numero I residui possono essere selezionati con il codice a tre lettere. Per selezionare tutti i residui spartici (ASP): select resn ASP rinominiamo la selezione: set_name sel04, ASP Per selezionare un residuo particolare bisogna selezionare il residuo riferendosi al numero selezioniamo il residuo della triade catalitica H57 : select resi 57 rinominiamo la selezione: set_name sel05, H57 selezioniamo le varianti (G43E, D194N, G216D) vicino al sito attivo: select resi Rinomini la selezione sel11 con : set_name sel11, Dovreste avere l oggetto 1AUT e le seguenti selezioni. rappresentate i residui H57, G43E, D194N, G216D in stick e colorateli in base al tipo di atomi.

8 Misurare le distanze che ci sono tra gli atomi: Misurate le distanze che ci sono tra H57 e i residui G43E, D194N, G216D: andate nella finestra menu: Wizard>Measurement nella finestra principale sul lato destro in basso appare il menu measurement: selezionate mesaurment mode>distances selezionate gli atomi per misurare le distanze. Dovreste realizzare la seguente rappresentazione. D216 10,85 Å D194 D102 E43 10,77 Å H57 I residui G216 G43 D194 si localizzano a circa 12 A dalla H57 modificando la distribuzione di carica in prossimità del sito.

9 Mutagenesi Nascondete tutta la proteina (dalla selezione (all) selezionare H -> everything). Selezionare ed evidenziare i residui che cadono in un intorno di 4A dal residuo da mutagenizzare: select intorno, byres(resi 82 around 4) color yellow, intorno show lines, intorno Selezionare ed evidenziare il residuo da mutagenizzare (Asp82Asn): select asp82, resi 82 show lines, asp82 Applicare la mutazione usando il tool Wizard>mutagenesis Specificare il tipo di mutazione cliccando sul tasto No mutation -> ASN Cliccare sul residuo da mutare: la selezione che si viene a creare presenta una percentuale che indica la probabilità che quel residuo venga sostituito in quel rotamero conformazionale (per esplorare altri rotameri cliccare su tasti avanti o indietro). Scegliete il rotamero piu adatto e applicate la mutazione con il tasto Apply.

10 Utilizzando il Builder aggiungere gli idrogeni al residuo mutato Salvare il PDB del mutante con File > Save Molecule

11 Collegarsi al sito Risultato dei calcoli dei potenziali elettrostatici Wt ASP82 mutato ASN82