Tramite il software ImageJ è possibile effettuare la conta di cellule principalmente in due modi: a) Conta automatica b) Conta manuale

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1 CONTA DI CELLULE: Tramite il software ImageJ è possibile effettuare la conta di cellule principalmente in due modi: a) Conta automatica b) Conta manuale Caso a): CONTA AUTOMATICA Prima di utilizzare la conta automatica è necessario sogliare l immagine. (N.B. non è possibile sogliare direttamente immagini che sono di tipo RGB -> in questo caso bisogna cambiare loro tipo andando su Image -> Type -> 8 bit ). La soglia viene effettuata tramite il comando Threshold (Image -> Adjust -> Threshold): Una volta selezionato il comando compare questa finestra Da questa è possibile settare i valori minimo e massimo in pixel che si vogliono utilizzare per l immagine. Nelle opzioni è comodo lasciare impostato Black&White. Dopo essere stata sogliata l immagine che si presenta è di questo tipo: Un alternativa alla sogliatura consiste nella binarizzazione dell immagine tramite il comando Make Binary che si trova sotto Process -> Binary ->Make Binary; questo rende l immagine binaria tramite una soglia automatica, che in generale risulta appropriata per immagini ben contrastate. In caso contrario è preferibile procedere tramite sogliatura manuale. La presentazione dell immagine è simile alla figura precedente. POSSIBILE PROBLEMA: Alle volte la binarizzazione dell immagine porta ad una fusione tra cellule vicine -> per poter risolvere questo problema si utilizza il comando Watershed (Process -> Binary -> Watershed).

2 Vediamone un applicazione pratica: Presentazione dell immagine prima di utilizzare Watershed: Immagine ottenuta dopo l utilizzo di Watershed: Come si vede dall immagine alcune cellule, che dall immagine precedente risultavano fuse, ora sono state separate (messe in evidenza con cerchi rossi). Una volta che l immagine è stata sogliata è possibile utilizzare i seguenti comandi per la conta automatica, a scelta in base alle proprie esigenze: - Se si vuole ottenere una conta automatica di cellule che comprende anche il calcolo della loro area -> si utilizza il comando ANALYZE PARTICLES (Analyze-> Analyze Particles):

3 In questa finestra è possibile settare varie opzioni: - Size -> setta la dimensione minima e massima dell area che si vuole includere nella conta in pixel. (come minimo mettere pure 50 per eliminare gli artefatti). - Show -> sono le varie modalità di rappresentazione della conta: per comodità meglio selezione Outlines che traccia il contorno delle cellule. - Nelle caselline da spuntare l importante è lasciare selezionato Display Results, che mostra in una finestra i risultati della conta. Il risultato dovrebbe essere tipo: - Se invece è sufficiente contare le cellule oppure si vuole poter lavorare sull immagine dopo la conta, magari aggiungendo alcune cellule manualmente, si può utilizzare il comando FIND MAXIMA (Process -> Binary -> Find Maxima). Questo comando è utilizzabile sia per immagini binarizzate che per immagini originali. In entrambi i casi la finestra del comando Find Maxima è così presentata: Da qui è possibile selezionare: 1.La tolleranza al rumore (in pixel), vengono cioè selezionate solo le cellule che si trovano sopra quel valore -> rappresenta il valore minimo a partire dal quale viene considerato il segnale. 2.Il tipo di Output -> selezionare Point Selection. Selezionare Light Background se il background dell immagine è chiaro (utile soprattutto se l immagine è stata binarizzata). E utile utilizzare il comando Preview Point Selection per visualizzare i punti che vengono selezionati, in modo da poter verificare se può andare bene.

4 Caso 1 ) Se l immagine è stata prima binarizzata il risultato dovrebbe essere del tipo: Se si nota che mancano alcune cellule dalla conta è poi possibile inserire eventualmente altri punti a mano selezionando il comando Point Selection, ossia la crocetta con il quadratino giallo al centro, e tenendo premuto il tasto Alt per ogni inserimento -> il programma inserisce automaticamente un punto con il numero della cellula aggiornato. Caso 2) In alternativa, è possibile utilizzare l immagine originale non sogliata. Questo è possibile nei casi in cui il segnale proveniente da una cellula abbia un picco di intensità al centro. L immagine risultante sarà in questo caso del tipo: Anche in questo caso è possibile aggiungere manualmente delle cellule se si nota che non sono state incluse nella conta. Caso b): CONTA MANUALE È possibile utilizzare altrimenti l inserimento manuale che consente inoltre di contare più cellule differenti nella stessa immagine -> è quindi molto utile nel caso in cui sia necessario distinguere tra i tipi di cellule. Questo è possibile grazie al plug-in Cell counter (Plugin-> Analyze -> Cell Counter) Questo plugin consiste nell incremento del numero di cellule mano a mano che vengono selezionate dall utente. La finestra del Cell Counter è cosi fatta:

5 Sull immagine vengono poi selezionati punti di colore diverso per ogni tipo selezionato. Inizialmente viene chiesto di selezionare un tipo e di inizializzare la conta tramite il pulsante Initialize; dopodiché ogni volta che viene selezionata una cellula il contatore si aggiorna presentando sulla casellina a lato del tipo il numero delle cellule di quel tipo contate fino a quel momento.