Aspetti caratteristici dei diversi tipi di adesione cellula-matrice

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1 Aspetti caratteristici dei diversi tipi di adesione cellula-matrice Propietà/ struttura Localizzazione Complessi focali Adesioni focali Adesioni fibrillari Bordo dei lamellipodia Periferia della cellula Regioni interne alla cellula Morfologia Distribuzione puntiforme Ovale Fibrillare Misura (assiale) Costituenti tipici Paxillina Vinculina Proteine tyrfosforilate 1 µm 2-5 µm Variabile: 1-10 µm αv integrina Paxillina Vinculina α-actinina Talina Cinasi di Adesione Focale (FAK) Proteine tyr-fosforilate α5 integrina tensina Indotte da Rac Rho Rho (?)

2 Complessi focali Piccole strutture che contengono integrine e molecole associate, situate sul bordo di lamellipodi Possono essere transienti o evolvere in adesioni focali, in seguito a forze di tensione generate all interno della cellula o applicate dall esterno (perturbazioni meccaniche) Meccanosensori: trasformano una perturbazione meccanica in un segnale che promuove la formazione di adesioni focali e attiva il signalling delle integrine Adesioni focali

3 Adesioni fibrillari L adesione crea e organizza la ECM: Creazione di fibrille di fibronectina a partire da fibronectina solubile Domini I Fibrille di fibronectine extracellulari - integrine α5β1 - tensina Fibrillogenesi

4 Fibrillogenesi COO - RGD dip. DOC solubili RGD indip. DOC insolubili Adesioni focali

5 Adesioni focali integrine (α5β1, αvβ3) altre proteine di membrana: sindecani, lailina (lega ialuronani) proteine di membrana con funzione enzimatica proteine linker che legano le integrine all actina: talina, tensina, filamina, α-actinina altre proteine della placca citoplasmatica, spesso con funzione di signalling (tyr cinasi, ser/thr cinasi, fosfatasi) FAK cinasi di adesione focale

6 Famiglia FAK di proteine tirosina cinasi non recettoriali: N C N C FAK : 125 kda, espressa nella maggior parte dei tessuti, conservata nell evoluzione, principalmente localizzata a livello delle adesioni focali PYK2: espressa ad alti livelli nel cervello, molto meno nel fegato, nel rene, nella milza, nel polmone e nelle cellule di origine ematopoietica, principalmente localizzata a livello perinucleare Famiglia FAK N C N C protein 4.1-ezrin-radixin-moesin domain (legano glicoproteine di membrana al citoscheletro di actina) focal adhesion targeting FRNK FAK related non kinase

7 FAK cinasi di adesione focale NUCLEO SUMO Lys 152 Sumoilazione: modificazione post-traduzionale SUMO: small ubiquitin-like modifier -Regolazione della trascrizione -Struttura della cromatina -Mantenimento dell integrità genomica -Trasduzione del segnale

8 SUMO: 20 kda, legata covalentemente ad un residuo di Lys ad opera di una ligasi PIAS1 aa idrof. - K - X - E/D FAK sumoilata su Lys152: Aumenta la frazione di FAK nucleare, funzione? Favorisce l autofosforilazione di Tyr397 FAK cinasi di adesione focale Lys 152 ADESIONI FOCALI

9 Dominio FAT di FAK: 140 aa, fascio di 4 α eliche antiparallele, unite da corti segmenti (~ α catenina) Core idrofobico, altamente conservato Superficie esposta, meno conservata, ad eccezione di due zone idrofobiche : HP1 α2 α3 HP2 α1 α4 Legame con paxillina Dominio FAT di FAK Potenziale elettrostatico Residui conservati idrofobicità

10 Paxillina proteina adattatrice Può legare direttamente integrina α4 (reclutamento FAK?) Può essere fosforilata su Tyr (Src) C-term localizzazione N-term 5 domini LD Paxillina 5 motivi LD: Seq LDXLLXXL, separate da regioni Pro/Ser-rich Struttura α elica LD2 si inserisce nel fascio in corrispondenza di HP1 Fascio di 5 eliche LD4 interagisce con HP2? Siti di legame multipli: aumento avidità? Formazione di complessi di maggior dimensioni?

11 FAK cinasi di adesione focale Lys 152 Dominio cinasico di FAK clustering delle integrine autofosforilazione Tyr-397 di FAK reclutamento e attivazione di Src attraverso la formazione di un complesso cinasico Src fosforila Tyr 576 e Tyr 577 di FAK

12 N, dominio N-t K, dominio cinasico C, dominio C-t N C K N C K N K N C C K

13 Src fosforila p130cas (Pax) (Tyr) p130cas (Pax) interagisce con Crk (SH2) Viene attivata Rac Formazione di lamellipodi, aumento motilità Le tirosine cinasi della famiglia Src contengono domini SH2 e SH3 oltre al dominio cinasico

14 Le tirosine cinasi della famiglia Src possono essere attivate direttamente dalle integrine (β3) attraverso il dominio SH3 FAK cinasi di adesione focale Lys 152

15 Tyr-397 P Promuove inoltre il reclutamento di altre proteine con domini SH2: PI3K fosfolipasi C-γ fattore GRB7 (Growth Receptor Binding protein 7) Tyr-397 P Tyr-925 P fattore GRB2/SOS: attivazione cascata Ras/MAPK La fosforilazione è fondamentale per il riconoscimento indotto da modificazioni conformazionali per altre molecole che trasducono segnali

16 FAK cinasi di adesione focale Lys 152 Dominio C-terminale di FAK contiene domini Pro-rich = siti di riconoscimento per domini SH3 Sito I Sito II p130cas Proteina adattatrice multifunzionale Substrato di Src Attiva Rac sui lamellipodi (migrazione) GRAF (GAP di Rho) ASAP1 (GAP di Arf1) Riorganizzazione del citoscheletro: Turnover delle adesioni focali

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18 La capacità di FAK di promuovere sia la formazione che il turnover dei contatti focali è dovuta al suo duplice ruolo di cinasi e di adattatore turnover 1a 1b 2a 3a 4a 2b assemblaggio delle adesioni focali 5a mitosi FAK può regolare il turnover delle adesioni focali anche attraverso meccanismi di proteolisi (via Ras/ERK): Attivazione o rilascio di Metallo-Proteasi della Matrice (MMP): degradazione della ECM Attivazione della calpaina: degradazione di talina, FAK

19 Integrine e recettori per i fattori di crescita

20 Signalling collaborativo αvβ3 PDGFR IGF-1R VEGFR α6β1 Erb-B2 La formazione di complessi Integrine-GFR possono essere mediate da proteine bivalenti (FAK)

21 Attivazione GFR GF-indipendente α2β1 EGFR Aumento della concentrazione locale di GFR, transattivazione Pattern di fosforilazione del recettore anomalo FAK indipendente Attivazione integrine ECM-indipendente EGFR α6β4 Met α6β4 Fosforilazione di tyr nella porzione citoplasmatica di β4 Attivazione delle vie PI3K/Grb2 (FAK indipendente)

22 proliferazione morte differenziamento Adesione e cancro sopravvivenza migrazione Le molecole dell adesione: possibili target antitumorali

23 Caderine: Downregolazione Perdita invasività Integrine: Cooperazione con GFR Proliferazione sopravvivenza FAK: Overespressione di FAK (amplificazione genica) Ras, Src, Rho : oncogeni Sopravvivenza Migrazione invasività Proliferazione differenziamento