Scientific investigation and Veterinary information

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1 Scientific investigation and Veterinary information Results Zincoseb shampoo Attività antimicrobica in vitro di Zincoseb shampoo nei confronti degli organismi patogeni associate a infezioni cutanee canine In vitro antimicrobial activity of Zincoseb shampoo against pathogenic organisms associated with dog skin infections Text edited by L. Guardabassi Associate Professor of Clinical Microbiology, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen (Denmark) Riservato ai Medici Veterinari e ai Farmacisti Reserved for Veterinarians and Pharmacists

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3 Scientific investigation and Veterinary information Results Attività antimicrobica in vitro di Zincoseb shampoo nei confronti degli organismi patogeni associate a infezioni cutanee canine Testo e tabelle di Luca Guardabassi Professore Associato di Microbiologia Clinica, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen (Denmark) In vitro antimicrobial activity of Zincoseb shampoo against pathogenic organisms associated with dog skin infections Text edited by Luca Guardabassi Associate Professor of Clinical Microbiology, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen (Denmark) Zincoseb è uno shampoo detergente contenente 0,25% di zolfo colloidale, 0,3% di clorexidina digluconato, 2% di acido salicilico, 2% di lanolina e 2% di zinco gluconato. Seguendo le indicazioni del produttore (ICF srl), questo shampoo è particolarmente indicato nel trattamento di condizioni seborroiche associate a cute secca e con la formazione di scaglie (forfora), che sono spesso osservate nei casi di dermatite causati dal lievito Malassezia pachydermatis. L'azione sinergica dello zolfo associato all'acido salicilico, oltre alle funzioni cheratolitiche (rimozione delle scaglie in eccesso sulla superficie cutanea) e cheratoplastiche (normalizzazione del ricambio cellulare nello strato basale dell epidermide), esplica un attività antibatterica, antifungina e antiparassitaria [1]. Tale azione antimicrobica è principalmente attribuita alla conversione in situ dello zolfo in acido solfidrico e acido pentatonico. Comunque, dati sull attività antimicrobica dello zolfo associata all acido salicilico sono scarsi nella letteratura scientifica e nessun dato è disponibile circa le concentrazioni necessarie al raggiungimento dell effetto nei confronti degli organismi patogeni associati alle infezioni cutanee canine. In questo studio, le proprietà antimicrobiche in vitro su Zincoseb sono state valutate usando una collezione di lieviti di M. pachydermatis (n=16) isolati da casi clinici canini, essendo i lieviti il target principale di questo shampoo commerciale. Zincoseb is a detergent shampoo containing 0.25% colloidal sulphur, 0.3% chlorhexidine digluconate, 2% salicylic acid, 2% lanolin and 2% zinc gluconate. According to the manufacturer s indications, the shampoo is particularly indicated for treatment of seborrheic conditions associated with dry and scaling skin (dandruff), which are often observed in cases of dermatitis caused by the yeast Malassezia pachydermatis. In addition to keratolytic (removal of excess scale on the surface) and keratoplastic (normalization of the cell turnover in the cell basal layer) functions, the synergistic combination of sulphur and salicylic acid is known to have antibacterial, antifungal and antiparasitic action [1]. Such antimicrobial action is mainly attributed to in situ conversion of sulphur to hydrogen sulphide and pentathionic acid. However, quantitative data on the antimicrobial activity of sulphur combined with acid salicylic are scarce in the scientific literature and no data are available about the concentrations necessary to achieve a bactericidal effect in pathogenic organisms associated with dog skin infections. In this study, the in vitro antimicrobial properties of Zincoseb shampoo were assessed using a collection of canine clinical isolates of M. pachydermatis (n=16), which is the main pathogen target by this commercial shampoo.

4 Sono stati inclusi nello studio anche ceppi di Staphylococcus pseudintermedius (n=10), Escherichia coli (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=3) e Proteus mirabilis (n=1) per valutare l efficacia del prodotto nei confronti delle infezioni batteriche o miste (Malassezie e batteri). 5 ceppi su i 10 di S. pseudintermedius testati erano multi-farmaco resistenti mostrando un livello elevato di resistenza agli antibiotici comunemente usati per la terapia sistemica delle infezioni nei cani, incluse cefalosporine, lincosamidi e fluorchinoloni. Materiali e metodi Diluizioni di Zincoseb risultanti uccidere completamente i microrganismi sono state determinate attraverso il metodo di microdiluizione [2-3]. Materiale della colonia prelevato da ogni isolato è stato sospeso in soluzione salina fosfato tamponata (phosphate buffered saline-pbs, a ph 7.2) e la miscela è stata regolata ad una torbidità di 0.5 McFarland, la quale corrisponde a circa 108 e 106 UFC (Unità Formanti Colonia)/ml per batteri e Malassezia rispettivamente. Ogni ceppo è stato inoculato in diluizioni duplici seriali di Zincoseb in PBS. Dopo incubazione per 5 min. a 37ºC, il ceppo sopravvissuto è stato valutato trasferendo 10 μl di ogni diluizione in un terreno agar idoneo alla crescita di Malassezia (Sabouraud agar) o batteri (agar sangue). Un esposizione a PBS senza Zincoseb è stata usata come controllo positivo per escludere possibili effetti di PBS sulla sopravvivenza dei microrganismi. E stata definita minima concentrazione battericida (minimum bactericidal concentration - MBC) la più bassa concentrazione risultante avere l assenza di crescita visibile su piastra in agar. Strains of Staphylococcus pseudintermedius (n=10), Escherichia coli (n=4), Pseudomonas aeruginosa (n=3) and Proteus mirabilis (n=1) were included in the study to evaluate the efficacy of the product for bacterial infections or mixed infections involving both Malassezia and bacteria. Five of the ten S. pseudintermedius tested were multidrugresistant strains displaying high-level resistance to antibiotics commonly used for systemic treatment of skin infections in dogs, including cephalosporins, lincosamides and fluoroquinolones. Materials and methods Zincoseb shampoo dilutions resulting in complete killing of the microorganisms were determined by the microdilution method as described previously [2-3]. Colony material from each isolate was suspended in phosphate buffered saline (PBS, ph 7.2) and the mixture was adjusted to a turbidity of 0.5 McFarland, which corresponds to approximately 108 and 106 CFU/ml for bacteria and Malassezia, respectively. Each strain was inoculated into serial two-fold dilutions of Zincoseb shampoo in PBS. Following incubation for 5 min at 37ºC, strain survival was evaluated by transferring 10 μl of each dilution onto appropriate agar medium enabling growth of Malassezia (Sabouraud agar) or bacteria (blood agar). Exposure to PBS without Zincoseb was used as a positive control to rule out possible effects of PBS on survival of the microorganisms. The minimum bactericidal inhibitory concentration (MBIC) was defined as the lowest concentration resulting in the absence of visible growth on the agar plate.

5 Results E stata registrata una crescita confluente quando il numero di colonie era superiore a 100 e non si è potuto contarle singolarmente. Gli MBC combinati di zolfo e acido salicilico sono stati calcolati in base alla concentrazione dei due ingredienti in Zincoseb shampoo (20 mg/l). Risultati MBC sono differenti in base al tipo di microrganismo (vedi Tabella). Per Malassezia, la diluizione 1:128 del prodotto è stata sufficiente ad uccidere ogni ceppo sotto condizioni in vitro. Questa diluizione corrisponde ad una concentrazione di 0,156 mg/l di zolfo e acido salicilico. La stessa concentrazione o anche concentrazioni più basse sono state in grado di uccidere completamente S. pseudintermedius antibiotico-sensibile, che è il batterio patogeno più comune associato alle infezioni batteriche cutanee (piodermiti) del cane. Comunque, 3 di 5 ceppi multi-farmaco resistenti sono stati in grado di sopravvivere a diluizione 1:128 del prodotto e sono state necessarie concentrazioni fino a o mg/l di zolfo e acido salicilico per uccidere questi ceppi. Alte diluizioni del prodotto (1:128 to 1:512) sono state in grado di uccidere completamente alcune specie Gramnegative come E. coli e P. mirabilis, che sono solo sporadicamente coinvolte nelle infezioni cutanee nei cani. Lo shampoo è risultato essere meno efficace nei confronti di P. aeruginosa come è evidenziato dal fatto che due isolati appartenenti a questa specie sono state uccisi a diluizione 1:32 (MBC=0.625 mg/l) e il terzo isolato è stato in grado di sopravvivere anche dopo 10 minuti di esposizione al prodotto non diluito (MBC>20 mg/l). Confluent growth was recorded when the number of colonies exceeded 50 and could not be counted. The combined MBCs of sulphur and salicylic acid were calculated based on the concentration of the two ingredients in Zincoseb shampoo (20 mg/l). Results MBCs differed depending on the type of microorganism (see Table). For Malassezia, 1:128 dilution of the product was sufficient to kill any strains under in vitro conditions. This dilution corresponds to a concentration of 0,156 mg/l of sulphur and salicylic acid. The same or even lower concentrations enabled complete killing of antibiotic susceptible S. pseudintermedius, which is the most common bacterial pathogen associated with dog skin infections. However, three of the five multidrug resistant strains were able to survive at 1:128 dilution of the product and concentrations up to or mg/l of sulphur and salicylic acid were required to kill these strains. High product dilutions (1:128 to 1:512) resulted in complete killing of certain Gram-negative species such as E. coli and P. mirabilis, which are only sporadically involved in skin infections in dogs. The shampoo was less effective against P. aeruginosa as evidenced by the fact that two isolates belonging two this species were killed at 1:32 dilution (MBC=0.625 mg/l) and the third isolate was able to survive even after 10 minutes of exposure to the undiluted product (MBC>20 mg/l).

6 Osservazioni conclusive Zincoseb ha mostrato un eccellente attività in vitro nei confronti del patogeno target Malassezia e dei principali patogeni batterici associate alle infezioni cutanee canine, con la sola eccezione per P. aeruginosa. Sulla base dei dati prodotti da questo studio, Zincoseb shampoo può essere utilizzato con successo nei casi di dermatite in cui Malassezia è associata a batteri, una situazione frequentemente osservata in dermatologia veterinaria. In particolare, il batterio più frequentemente patogeno S. pseudintermedius sembra essere altamente sensibile alla formulazione di Zincoseb. La ridotta sensibilità osservata in alcuni ceppi multi-farmaco resistenti, sebbene scientificamente interessante, non è clinicamente rilevante in base alle condizioni di utilizzo raccomandate dal produttore (1:1 diluizione in acqua e almeno 5 minuti come tempo di contatto). E importante ricordare che l efficacia clinica della shampoo-terapia è fortemente associata alla capacità dei proprietari di cane di seguire le indicazioni del foglietto illustrativo e alla spiegazione specifica dei veterinari circa tempo di contatto, protocollo e frequenza del trattamento e al mantenimento di una cura appropriata tra i trattamenti. Quindi un ruolo essenziale da parte dei Veterinari è di rimarcare l attenzione dei loro clienti circa l importanza della compliance nella shampoo-terapia. L utilizzo di Zincoseb non è indicato per il trattamento di infezioni cutanee sostenute da P. aeruginosa. Alti livelli di resistenza allo zolfo sono stati precedentemente riportati da altri autori per questo gruppo di batteri [4]. Concluding remarks Zincoseb shampoo showed excellent in vitro activity against the target pathogen Malassezia and all major bacterial pathogens associated with dog skin infections, with the only exception of P. aeruginosa. Based on the data generated by this study, the shampoo can be successfully used in cases of dermatitis where Malassezia is accompanied by bacteria, a situation frequently observed in veterinary dermatology. In particular, the most common skin bacterial pathogen S. pseudintermedius appears to be highly susceptible to the formulation of Zincoseb shampoo. The reduced susceptibility observed in some multidrug-resistant strains, although scientifically interesting, is not clinically relevant according to the conditions of use recommended by the manufacturer (1:1 dilution in water and at least 5 min of contact time). It is important to remember that the clinical efficacy of shampoo therapy is strongly associated with the capacity of dog owners to follow manufacturers label directions and veterinarians specific advice concerning contact time, protocol and frequency of treatment, and maintenance of proper grooming between treatments. Accordingly, an essential role by Veterinarians is to draw the attention of their clients to the importance of compliance in shampoo therapy. The use of Zincoseb shampoo is not indicated for treatment of skin infections involving P. aeruginosa. High levels of resistance to sulphur have previously been reported by other authors for this bacterial group [4].

7 Results Questo lavoro e i precedenti studi che hanno valutato l attività antimicrobica di altri shampoo [5] e detergenti auricolari [2-3,6] indicano che i prodotti antisettici topici usati in dermatologia veterinaria sono agenti antimicrobici molti potenti. In accordo sia con studi in vitro [3] e in vivo [7], tali prodotti possono essere utilizzati come preziosi strumenti terapeutici per la cura di infezioni sostenute da batteri multi-farmaco resistenti come S. pseudintermedius meticillina-resistente che si sono rapidamente diffusi universalmente e rappresentano un serio problema terapeutico in medicina veterinaria [7-8]. Sebbene shampoo veterinari sono spesso utilizzati come terapia adiuvante a quella sistemica con antibiotici e antifungini, a mio parere essi potrebbero essere usati come alternative in molte circostanze. Sono convinto che l utilizzo razionale di shampoo e altri prodotti antisettici potrebbe avere effetti positivi sulla prevenzione della resistenza antimicrobica riducendo l uso di antibiotici a largo spettro in dermatologia veterinaria e di conseguenza riducendo la pressione selettiva antibiotica. Tuttavia, sono necessari più studi clinici per supportare questa teoria. This study and previous studies evaluating the antimicrobial activity of other shampoos [5] and ear cleansers [2-3, 6] indicate that topical antiseptic products used in veterinary dermatology are very powerful antimicrobial agents. According to both in vitro [3] and in vivo [7] studies, such products can be used as valuable therapeutic tools to treat infections caused by multidrug-resistant bacteria such as methicillin-resistant S. pseudintermedius, which are rapidly spreading worldwide and represent a serious therapeutic problem in veterinary dermatology [7-8]. Although veterinary shampoos are often used as an adjunct treatment to systemic therapy with antibiotics and antifungals, in my opinion they could be used as alternatives in many circumstances. I am convinced that rational use of shampoos and other antiseptic products could have positive effects on prevention of antimicrobial resistance by reducing the use of broad-spectrum antibiotics in veterinary dermatology and consequently by reducing antibiotic selective pressure. However, more clinical studies are needed to support this theory. G.GHIBAUDO Coltura di lieviti (colorazione Diff Quick) Yeast culture (Diff quick stain) Coltura batterica su Agar-sangue Bacterial culture (blood agar)

8 Tabella. Diluizioni di Zincoseb risultanti nella completa uccisione di organismi patogeni associati alle infezioni cutanee canine. Table. Zincoseb shampoo dilutions resulting in complete killing of pathogenic organisms associated with dog skin infections. Specie e ceppi testati 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis Staphylococcus pseudintermedius MRSP Staphylococcus pseudintermedius MRSP Staphylococcus pseudintermedius MRSP Staphylococcus pseudintermedius MRSP Staphylococcus pseudintermedius MRSP Staphylococcus pseudintermedius MSSP Staphylococcus pseudintermedius MSSP Staphylococcus pseudintermedius MSSP Staphylococcus pseudintermedius MSSP Staphylococcus pseudintermedius MSSP Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Proteus mirabilis uccisione completa (no crescita) - complete killing (no growth) + parziale inibizione (1-100 colonie) + partial inhibition (1-100 colonies) ++ nessun effetto (crescita confluente) ++ no effect (confluent growth)

9 Bibliografia/References 1. Maddison JE, Page SW, Church DB. Topical dermatological therapy. In: Small animal clinical pharmacology, 2nd edition Saunders Ltd. 2. Swinney A, Fazakerley J, McEwan N, Nuttall T. Comparative in vitro antimicrobial efficacy of commercial ear cleaners. Journal of Veterinary Dermatology 2008; 19: Guardabassi L, Ghibaudo G, Damborg P In vitro antimicrobial activity of a commercial ear antiseptic containing chlohexidine and Tris- EDTA. Veterinary Dermatology (in press). 4. Taj A, Baqai R. Antimicrobial effects of alum and sulphur on bacteria isolated from mineral and hospital water. Infectious Disease Journal 2007;16: Lloyd DH, Lamport AI. Activity of chlorhexidine shampoos in vitro against Staphylococcus intermedius, Pseudomonas aeruginosa and Malassezia pachydermatis. Veterinary Records 1999; 144: Lloyd DH, Lamport AI. Evaluation in vitro of the antimicrobial activity of two topical preparations used in the management of ear infections in the dog. Veterinary Therapeutics 2000; 1: Loeffler A, Linek M, Moodley A, Guardabassi L, Sung JML, Winkler M, Weiss R, Lloyd DH. First report of multiresistant, meca-positive Staphylococcus intermedius in Europe: 12 cases from a veterinary dermatology referral clinic in Germany. Veterinary Dermatology 2007; 18: Moodley A, Stegger M, Zakour NLB, Fitzgerald JR, Guardabassi L. Tandem repeat sequence analysis of staphylococcal protein A (spa) gene in methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. Veterinary Microbiology 1009; 135:

10 Shampoo terapia Materiale fotografico G.Ghibaudo

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12 mentalism m sas