REPORT CHALLENGE TEST METODO ISO 11930:2012
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- Alberta Paoletti
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1 REPORT CHALLENGE TEST METODO ISO 11930:2012 Valutazione in vitro della stabilità microbiologica di un prodotto cosmetico in base al metodo ISO 11930:2012, secondo il Regolamento 1223/2009 According the European Regulation 1223/2009 the evaluation of antimicrobial preservation in cosmetic products by the method ISO 11930:2012. PRODOTTO / PRODUCT: ANTIOX CREMA COMMITTENTE / CUSTOMER: AMBROSIALAB S.R.L. via Mortara Ferrara Data report: 25/07/2013 / Date: July 25 th 2013 Pag. 1 di 9 / Page 1 out of 9
2 CHALLENGE TEST: METODO DELL EFFICACIA PRESERVANTE PRESERVATIVE EFFICACY METHOD ISO 11930: REG. 1223/2009 PREMESSA In base al Regolamento Europeo 1223/2009 la valutazione in vitro della stabilità microbiologica di un prodotto cosmetico è effettuato secondo la norma ISO (International Organization for Standardization), applicando il metodo ISO 11930:2012. Questa norma ISO (International Organization for Standardization) è utilizzata per la valutazione complessiva della protezione antimicrobica di un cosmetico, che comprende: -le caratteristiche chimiche del sistema conservante; -le caratteristiche della formulazione: -il design del packaging; - il processo di fabbricazione (norme GMP). 1-SCOPO DEL TEST Verificare nel tempo la stabilità microbiologica di un cosmetico lo stoccaggio e l uso. Il test prevede la contaminazione del prodotto con microrganismi di diversa specie e la successiva valutazione della variazione di carica microbica mediante il conteggio in piastra del numero dei germi vivi ad intervalli di tempo regolari per un periodo di 28 giorni. La capacità di difesa del prodotto cosmetico dall aggressione microbica viene verificata in base all osservazione della riduzione di carica microbica (per ciascun ceppo microbico in esame) entro un certo intervallo di tempo, secondo i criteri di accettabilità della norma ISO 11930: FASI DEL CHALLENGE TEST Le fasi procedurali consistono in: Conta microbica preliminare sui campioni da esaminare. Preparazione dei microrganismi per l inoculo. Inoculo dei campioni. Controlli ad intervalli prestabiliti della sopravvivenza dei microrganismi. Valutazione dei risultati. FOREWORD According to the European Regulation 1223/2009 evaluation "in vitro" microbiological stability of a cosmetic is carried out in accordance with ISO (International Organization for Standardization) by the method ISO 11930:2012. This ISO (International Organization for Standardization) is to be used in the overall evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product, which comprises: -chemical preservation; -Inherent characteristics of the formulation: -package design; -manufacturing process (GMP). 1-PURPOSE OF THE TEST Checking the microbiological stability of the cosmetic product (storage and use) over time. The test is carried out by contaminating the product with microorganisms from several species, and by subsequently assessing the change in the microbial load by plate counting the number of live germs after pre-determined time spans. The cosmetic formulation s capacity of defending against microbial attack is verified based on the observation of the reduction of the count viable total (for each test microbial strain) within a given time span, according to the criteria of acceptability emanated by ISO 11930: CHALLENGE TEST STEPS Challenge test can be carried out by following different methodological procedures, however its procedure could be summarized in: Preliminary microbial count on test samples. Preparation of microorganisms for the inoculum. Inoculation of samples. Check of microorganism survival at pre-determined intervals. Evaluation of the results. Pag. 2 di 9 / Page 2 out of 9
3 3-METODO ISO 11930:2012 TEST DI EFFICACIA DEL PRESERVANTE La norma ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012, descrive come eseguire le analisi microbiologiche per la valutazione dell efficacia microbicida del sistema conservante di un cosmetico, sottoposto ad una contaminazione microbica in vitro. 3.1-MATERIALI E METODI. 3-METHOD ISO 11930:2012 PRESERVATION EFFICACY TEST Cosmetics Microbiology. Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product (ISO 11930:2012) 3.1-MATERIALS AND METHODS Microrganismi utilizzati ATCC / ATCC microorganisms for antibacterial testing: Staphylococcus aureus (Gram+/ Bacteria Gram positive) ATCC* 6538 Pseudomonas aeruginosa (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 9027 Escherichia coli (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 8739 Candida albicans (Lievito / Yeast) ATCC* Aspergillus brasiliensis (Muffa / Molds) ATCC* *ATCC (American Type Collection Control) Entità dell inoculo microbico: La concentrazione dell inoculo (tempo zero : T0) deve essere compresa tra 10 5 e 10 6 Unità Formante Colonia [UFC (microrganismi vitali)] / gr di prodotto. Batteri: 10 6 ufc/gr. Miceti: 10 5 ufc/gr. Diluente: soluzione Ringer (soluzione fisiologica) Neutralizzante appropriato al test antimicrobico: Eugon LT 100 liquid broth. Terreni di coltura Tryptic Soy Broth (TSB) per la preparazione delle sospensioni microbiche dei ceppi standard utilizzati Tryptic Soy Agar (TSA) per i batteri. Sabouraud Dextrose Agar Candida albicans. (SDA) + CFL per Potato Dextose Agar per Aspergillus brasiliensis Inoculum concentration at T 0 : The inoculum concentration (Time 0: T 0 ) should be between 10 5 and 10 6 Colony-forming units [CFU (count viable total) ]/ gr. of the product. For bacteria : the bacterial inoculum of 10 6 ufc/gr. For fungi (Yeasts and Molds) : the fungal inoculum of 10 5 ufc/gr.. Diluent: Ringer solution Neutralizer: Eugon LT 100 liquid broth Neutralizing Broth should inactive the preservative and allow for unrestrained microbial growth. Medium: Tryptic Soy Broth (TSB) for the vitality of the microbial suspensions ATCC. Tryptic Soy Agar (TSA) for bacteria Sabouraud Dextrose Agar (SDA) + CFL for Candida albicans. Potato Dextose Agar for Aspergillus brasiliensis Pag. 3 di 9 / Page 3 out of 9
4 Tecnica analitica: Si utilizza per il metodo di semina in superficie in piastra Petri. Il prodotto di prova inoculato viene conservato a temperatura ambiente. Analytical Technique Plate-count method: spreading plate in duplicate using medium agar. A neutralizer is incorporated the plated agar when recovering bacteria by streaking plates. The inoculated samples are incubated at room temperature. Tempo di verifica del Challenge test Il tempo di verifica per ogni campione e per ogni ceppo standard corrisponde al momento dell inoculazione del microrganismo (tempo 0=T 0 ) e dopo 7, 14 e 28 giorni, per verificare l abbattimento totale dell inoculo iniziale. Espressione dei risultati Nel certificato di analisi i risultati sono espressi in ufc (unità formanti colonia) / gr per ogni microrganismo in funzione degi intervalli di tempo prestabiliti. 4-CRITERI DI ACCETTABILITÀ: CRITERIO A - B Il prodotto in esame deve presentare attività inibente nei confronti dei microrganismi utilizzati secondo i criteri di accettabilità del metodo ISO 11930:2012. Evaluation of test time The total incubation time of the sample is 28 days and the controls for the verification of the possible reduction of microorganisms by the preserving system are performed after 7, 14 and 28 days from the inoculation. Expression of the results. In the certificate of analysis shows the values cfu (colony forming units) / g for each micro-organism as a function of the predetermined time intervals. 4-ACCEPTANCE CRITERIA: CRITERION A and B The product was tested for the preservative efficacy testing against the microorganisms used according to the criteria of acceptability method ISO 11930:2012. The method provides the following criteria for the Il metodo prevede i seguenti criteri per la valutazione evaluation of the efficacy of the preserving system: dell'efficacia del sistema di conservazione: TABLE 1: Log reduction value (R x = log N 0 -Log N x ) required a Microorganisms: After 7 days Sampling Time After 14 days After 28 days Limit of acceptability METHOD ISO BACTERIA (A Criteria) 3 3 and NI b 3 and NI b ACCEPTABLE YEASTS: Candida albicans (A Criteria) 1 1 and NI b 1 and NI b ACCEPTABLE MOLDS : Aspergillus brasiliensis (A Criteria) - 0 c 1and NI b ACCEPTABLE BACTERIA (B Criteria) Not performed >3 3 and NI b ACCEPTABLE YEASTS: Candida albicans (B Criteria) Not performed 1 1 and NI b ACCEPTABLE MOLDS : Aspergillus brasiliensis (B Criteria) - 0 c 1and NI b ACCEPTABLE a: in this test, on acceptable range of deviation of 0 6 log is accepted b: NI no increase in the count from the previous contact time c: R x - 0 when lg N 0 -lg N x (no increase from the initial count) R:Reduction / Riduzione N 0 = number of microorganisms inoculated at time T 0 N x = number of surviving microorganisms at each sampling time T x Pag. 4 di 9 / Page 4 out of 9
5 I criteri di interpretazione sono: Criterio A : dopo 7 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri e almeno 1 logaritmo di Candida albicans; dopo 14 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans (senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e nessun incremento rispetto tempo zero per Aspergillus brasiliensis; dopo 28 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans (senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e almeno 1 logaritmo Aspergillus brasiliensis. Criterio B: dopo 14 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri, almeno 1 logaritmo per Candida albicans e nessun aumento rispetto al tempo zero per Aspergillus brasiliensis; dopo 28 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i batteri (senza alcun aumento rispetto a quello precedente), di almeno 1 logaritmo per Candida albicans (un aumento rispetto a quello precedente) e nessun aumento per Aspergillus brasiliensis; Conformità al criterio A: il rischio microbiologico è accettabile: il prodotto cosmetico è considerato protetto contro la proliferazione microbica e non è necessario considerare altri fattori che sono indipendenti dal la formulazione. Conformità al criterio B: il rischio microbiologico è accettabile, ma la valutazione del rischio microbiologico dovrà prendere in considerazione anche i fattori di controllo indipendenti dalla formulazione, quali le caratteristiche del packaging, per ridurre il rischio microbiologico. The criteria for interpretation are: Criterion A is assigned if obtained results satisfy at the same time all the conditions reported below: after 7 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria and at least 1 logarithm for Candida albicans; after 14 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), at least 1 logarithm for Candida albicans (without any increase with respect to the previous time) and no increase with respect to time zero for Aspergillus brasiliensis; after 28 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), at least 1 logarithm for Candida albicans (without any increase with respect to the previous time) and at least 1 logarithm for Aspergillus brasiliensis Criterion B is assigned if the obtained results satisfy at the same time all the conditions reported below: after 14 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria, at least 1 logarithm for Candida albicans and no increase with respect to time zero for Aspergillus brasiliensis after 28 days: reduction of at least 3 logarithms for the bacteria (without any increase with respect to the previous time), of at least 1 logarithm for Candida albicans (any increase with respect to the previous time) and no increase for Aspergillus brasiliensis If at the end of the challenge test the sample is in accordance with the A criterio: the microbiological risk is acceptable: the cosmetic product is considered protected against the microbial proliferation and it is not necessary to consider other factors that are independent from the formulation. If at the end of the challenge test the sample is in accordance with the B criterion: the microbiological risk is acceptable, whereby the level of protection is acceptable if the risk analysis demonstrates the existence of control factors not related to the formulation, such as the characteristics of the packaging, to reduce the microbiological risk. Pag. 5 di 9 / Page 5 out of 9
6 Se al termine del test sfida il campione non soddisfa né l'una né i criteri B (criterio no A no B), la valutazione antimicrobica del prodotto dovrà essere valutato considerando esclusivamente la stima del rischio microbiologico (prodotto confezionato in mono-dose, nel rispetto delle norme di buona prassi di produzione (GMP), per garantire la qualità microbiologica del prodotto finito. La sicurezza microbiologica di un prodotto cosmetico è basata sulla combinazione di diversi fattori, non solo basati ai risultati del Challenge test, ma anche alla formulazione dei prodotti, alle condizioni di utilizzo e al tipo di confezione che li contiene, alla modalità di produzione e di confezionamento in conformità alle norme di buona fabbricazione (GMP). 5-BIBLIOGRAFIA û Regolamento (CE) 1223/2009: regolamento sui cosmetici, approvato dal Parlamento europeo e dal Consiglio, allo scopo di armonizzare le disposizioni già esistenti in materia (Direttiva Europea 76/768/CEE e succ. mod.); Gazzetta Ufficiale dell Unione europea: 22 dicembre û Linee guida COLIPA sui requisiti del documento informativo Product Information File (PIF) 15 dicembre û Norma ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012. If at the end of the challenge test the sample does not satisfy neither the A nor the B criteria: the antimicrobial evaluation of the product will have to be evaluated considering exclusively the estimation of the microbiological risk ( a single-dose product and on condition that the microbiological quality of this product is guaranteed at the moment of the production (GMP). The microbiological safety of a cosmetic product is based on a combination of several factors, not only based on the results of the Challenge test, but also to the formulation of the products under the conditions of use and the type of packaging that contains them, the mode of production and packaging in accordance with good manufacturing practice (GMP). 5-BIBLIOGRAPHY: û Regulation (EC) No 1223/2009 (the Cosmetic Products Regulation ), replaced the European Union (EU) Cosmetics Directive 76/768/EEC, which harmonizes and simplifies the cosmetics regulations across the EU member states by Product Information File (PIF). û COLIPA Guidelines Product Information File (PIF) - December 15 th û ISO (International Organization for Standardization) 11930:2012. Pag. 6 di 9 / Page 6 out of 9
7 CERTIFICATO DI ANALISI: Certificate of analysis: Challenge test ISO 11930:2012 COMMITTENTE / CUSTOMER: AMBROSIALAB S.R.L. via Mortara Ferrara Data ricevimento campione: 21/06/2013 Periodo di Analisi: Data inizio del test: 24/06/2013 Data fine test 19/07/2013. Date of testing: End date test: PRODOTTO / PRODUCT: ANTIOX CREMA Microrganismi/ Microorganisms test T 0 inoculum T 2 gg. T 7 gg. T 14 gg. T 28 gg. Stafilococcus aureus ATCC ,9x10 6 <10 <10 <10 <10 Pseudomonas aeruginosa ATCC ,5x10 6 1,0x10 3 <10 <10 <10 Escherichia coli ATCC ,3x10 6 <10 <10 <10 <10 Candida albicans ATCC ,6x10 5 1,0x10 4 <10 <10 <10 Aspergillus brasiliensis ATCC ,8x10 5 <10 <10 <10 <10 I dati esprimono le unità formanti colonia (ufc) relative ad 1 gr di prodotto; / The data express the colony forming units [cfu] relative to 1 g of product; T= intervallo di tempo di analisi. / T= time of analysis. TVC= Total Vital Count prima dell esecuzione del Challenge test= <10 cfu/gr. / TVC [Total Vital Count] before the execution of the test.=<10 cfu/g. TABELLA RIDUZIONE LOG MICROBICA / LOG REDUCTION OF BACTERIA AND MOLDS TABLE: Microrganismi test/ Microorganisms test RIDUZIONE LOG / LOG REDUCTION T 2gg. T 7gg. T 14gg. T 28gg. Criterio A di Accettabilità Stafilococcus aureus ATCC Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Pseudomonas aeruginosa ATCC Log 6 Log NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Escherichia coli ATCC Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Candida albicans ATCC Log 5 Log NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE Aspergillus brasiliensis ATCC Log NI NI NI ACCETTABILE / ACCEPTABLE I dati esprimono la riduzione microbica in LOG in funzione del tempo. (NI=nessun incremento) / The data express the LOG reduction of inoculated germs relative to established control intervals. (NI: No Increase). Data report: 25/07/2013 / Date: July 25 th 2013 Pag. 7 di 9 / Page 7 out of 9
8 GRAFICO/GRAFIC PRODOTTO / PRODUCT: ANTIOX CREMA 7,00E+00 LOG: cfu/gr (E=valore esponenziale) 6,00E+00 5,00E+00 4,00E+00 3,00E+00 2,00E+00 1,00E+00 ST PS EC CA ASP 0,00E+00 T0 T 2 gg T 7 gg T 14 gg T 28 gg Tempo (giorni) / Time (days) Variazione logaritmica della carica microbica rispetto alla carica inoculata. / Logarithmic variation of microbial load in the inoculated sample. LEGENDA: LOG cfu/gr: unità formanti colonia relative ad 1 gr o ml di prodotto espresse in valore logaritmico (numero scientifico E = esponenziale) / colony forming units relative to a gram (g) of product. Tempo di esecuzione / T= time of analysis.: T 0.= tempo subito dopo l inoculo del campione / microbial titer in the inoculated sample T 2 g.= tempo dopo 2 giorni dall inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 2 days; T 7 g.= tempo dopo 7 giorni dall inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 7 days; T 14 g.= tempo dopo 14 giorni dall inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 14 days; T 28 g.= tempo dopo 28 giorni dall inoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 28 days. Data report: 25/07/2013 / Date: July 25 th 2013 Pag. 8 di 9 / Page 8 out of 9
9 CONCLUSIONI / CONCLUSIONS In base ai risultati ottenuti il prodotto cosmetico è conforme al criterio A: il rischio microbiologico è accettabile, ed in generale, si riscontra il seguente comportamento: / According to the obtained results the cosmetic product complies with the criterion A: the microbiological risk is acceptable, and in general, we find the following behavior: Riduzione batterica / Bacterial reduction: Gram + : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days Staphylococcus aureus Gram - : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa : Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days Riduzione micetica / Fungal Reduction: Candida albicans : Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days Aspergillus brasiliensis : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days Il sistema preservante, secondo i criteri di valutazione raccomandati dal metodo ISO 11930:2012 (REG. 1223/2009), del cosmetico esaminato denominato: / According to the assessment criteria recommended by the ISO 11930:2012 (European Regulation 1223/2009), the preservative system of the test cosmetic product called: AMBROSIALAB SRL ANTIOX CREMA è conforme al criterio A e risulta ACCETTABILE, in quanto il sistema conservante si dimostra efficace nei confronti dei microrganismi di prova, / in conforming to the criterion A and is ACCEPTABLE, and the preservative system shows efficacy against test microorganisms. Data report: 25/07/2013 / Date: July 25 th 2013 Pag. 9 di 9 / Page 9 out of 9
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