Riproduzione. tipica di piante e animali (eucarioti pluricellulari) ma anche di alcuni eucarioti unicellulari

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1 Riproduzione ASESSUATA o AGAMICA: Si ottiene una progenie geneticamente identica (CLONE) a meno di fenomeni di mutazione o cambiamenti occasionali del materiale genetico tipica dei procarioti ed eucarioti unicellulari SESSUATA o GAMICA: richiede la partecipazione di due individui in quanto è affidata all incontro di due cellule speciali i gameti prodotti nelle gonadi da un individuo di sesso maschile e da uno di sesso femminile tipica di piante e animali (eucarioti pluricellulari) ma anche di alcuni eucarioti unicellulari La diversità genetica associata ai meccanismi di riproduzione sessuata offre un enorme opportunità a livello evolutivo

2 Divisione cellulare nei procarioti SCISSIONE BINARIA ~ 20/30 min in condizioni ambientali favorevoli (temperatura, mezzo nutritivo, assenza di specie in competizione ) SETTO l informazione genetica è stata equamente ripartita fra le due cellule figlie Ambiente svolge un importante funzione di regolazione della crescita delle popolazioni batteriche CLONE = discendenza di cellule tutte uguali

3 Riproduzione delle cellule eucariotiche CELLULE SOMATICHE si riproducono AGAMICAMENTE DIVISIONE CELLULARE o MITOSI, previa duplicazione del DNA, ripartisce l informazione genetica in due cellule che sono identiche fra di loro e uguali a quella che le ha generate (2n) CELLULE GERMINALI si dividono per MEIOSI Un evento duplicativo del DNA seguito da due divisioni 4 cellule con corredo cromosomico APLOIDE (n) GAMETI cellule tipiche di individui con RIPRODUZIONE SESSUATA

4 CICLO CELLULARE in cellule eucariotiche INTERFASE periodo fra 2 mitosi consecutive FASE G1 (gap 1) non c è duplicazione del DNA, trascrizione e traduzione attive ore FASE S sintesi di DNA 6-7 ore FASE G2 trascrizione e traduzione attive, in preparazione alla mitosi centrosoma si duplica aster fuso primario FASE M MITOSI o DIVISIONE CELLULARE G0 è una G1 prolungata tipica delle cellule che non si dividono G1 e G2 non sono distinguibili morfologicamente

5 Rappresentazione del ciclo cellulare negli eucarioti

6 Natura dei meccanismi di controllo del ciclo cellulare: Fattori fisici (disponibilità di un ancoraggio, affollamento della coltura) Fattori chimici (presenza-assenza di fattori di crescita, la densità cellulare) a meno che non intervenga la trasformazione cellule tumorali Cellule cancerose ad es. perdono l inibizione da contatto e continuano a crescere in multistrato, in vitro

7 Checkpoints del ciclo cellulare es. danno al DNA, non corretto assemblaggio delle fibre del fuso PUNTO DI RESTRIZIONE

8 Il fuso mitotico è una struttura del citoscheletro degli eucarioti coinvolto nella mitosi e nella meiosi. La sua funzione è di separare i cromosomi e tutto il materiale della cellula madre durante la divisione cellulare (sia mitosi che meiosi) per dar origine alle cellule figlie. Consiste in un fascio di microtubuli uniti alla fine ma separati a metà, di forma vagamente ellittica. Il centriolo è un organello a struttura cilindrica cava (lunga circa 0,5 micron e larga 0,2) la cui parete è formata da nove triplette di microtubuli ed è dotato di appendici all'estremità distale. I centrioli si trovano in coppia e solitamente sono disposti tra di loro a formare un angolo retto. Assieme ad un materiale elettrondenso che li circonda, chiamato "materiale pericentriolare" (centrosoma), il più importante "centro organizzatore dei microtubuli" (MTOC) della cellula. Svolgono una funzione essenziale durante la mitosi, in quanto sono coinvolti nell'assemblaggio del fuso mitotico. Le coppie di centrioli si differenziano in un centriolo più anziano (madre), vecchio di almeno due cicli cellulari, e un figlio, che risale almeno al ciclo cellulare precedente. Durante la fase S i centrioli si duplicano, ma restano uniti in un unico centrosoma. All'inizio della profase le due coppie si separano migrando ai poli opposti della cellula e dando origine a due centrosomi distinti. Aster L aster è composto da microtubuli che si irradiano dal centrosoma. Questa struttura compare nella profase e scompare nella telofase, ingrandendosi soprattutto nella metafase. Fibre del fuso Le fibre del fuso compaiono, come l aster, nella profase e scompaiono nella telofase. Queste fibre si propagano dai due poli della cellula e possono essere distinte in base alla loro posizione e al loro rapporto con cromosomi e poli cellulari. Le fibre dette continue si irradiano da un polo ad un altro, mentre le fibre interzonali presenti solo in anafase tra i due gruppi di cromosomi. Le fibre del fuso sono composte da microtubuli ed hanno per questo polarità e capacità di polimerizzare e depolimerizzare, per permettere l allungamento della cellula e la divisione dei cromatidi fratelli. Più nello specifico, l accorciamento delle fibre cromosomiche permette la divisione dei cromatidi, mentre l allungamento di quelle continue l allungamento della cellula.

9 Formazione del fuso mitotico centrosoma fibre dell Aster centrioli a) Duplicazione della coppia di centrioli b) L aster si divide in due, tra di essi si allungano i microtubuli c) La separazione continua e i microtubuli che si estendono fra gli aster formano il fuso

10 Fibre del fuso mitotico in metafase piastra metafasica microtubuli del cinetocore (fibre del fuso acrosomiche) centrioli microtubuli dell aster materiale pericentriolare microtubuli polari immagine al microscopio a fluorescenza

11 Mitosi: PROFASE METAFASE ANAFASE TELOFASE

12 fotografia al SEM Cromatidi fratelli e centromero

13 Cellule animali. Solco di divisione: microfilamenti di actina Cellule vegetali. Piastra cellulare: deposizione di vescicole contenenti polisaccaridi della parete vegetale

14 Meiosi permette mantenimento del numero costante dei cromosomi in organismi a riproduzione sessuata Negli organismi superiori viene operata esclusivamente dalle cellule germinali per dimezzare il contenuto di DNA; 2n n 2 divisioni precedute da 1 duplicazione del DNA: MEIOSI I MEIOSI II RIDUZIONALE EQUAZIONALE Avvengono due successive divisioni, a partire da una cellula diploide si ottengono 4 cellule aploidi Le 4 cellule aploidi contengono un solo cromosoma di ogni coppia di omologhi Durante la meiosi si verifica la ricombinazione dell informazione genetica dei cromosomi parentali, tanto che ogni cellula aploide prodotta ha una combinazione di geni potenzialmente unica

15 PROFASE I Si suddivide in 5 stadi: leptotene, in cui il materiale genetico si condensa a formare strutture bastoncellari in forma di filamenti sottili, allungati, non scissi longitudinalmente; zigotene, durante il quale avviene la sinapsi dei cromosomi omologhi a formare una struttura denominata tetrade. L'appaiamento dei cromosomi omologhi avviene grazie ad una struttura submicroscopica proteica, il complesso sinaptinemale; pachitene: precoce, in cui si completa l'appaiamento degli omologhi, avanzato, in cui i cromosomi si accorciano, si inspessiscono e avviene il crossing-over, che però ancora non si nota; diplotene: in questo stadio i cromosomi omologhi di ciascun bivalente cominciano a separarsi (desinapsi), soprattutto a livello del centromero, per la progressiva scomparsa del complesso sinaptinemale. Tuttavia i due cromatidi di ciascuna coppia di omologhi restano in contatto grazie a connessioni chiamate chiasmi, segni visibili dell'avvenuto crossing-over; diacinesi, nel corso del quale i cromosomi completano la loro condensazione e sono chiaramente visibili. Ormai è ben formata la tetrade o bivalente e avviene la dissoluzione della membrana nucleare e del nucleolo. Durante la profase I, inoltre, si sviluppa il fuso, costituito da due coppie di centrioli, situate ai poli opposti della cellula, da cui fuoriescono fibre di microtubuli. Tali fibre agganciano i cromosomi mediante il cinetocore, una piastra proteica situata a livello del centromero. La profase I può durare per giorni o anche più a lungo e occupa il 90% del tempo richiesto per quasi tutta la divisione meiotica.

16 PROFASE I sinapsi: appaiamento dei cromosomi omologhi crossing over: scambio di materiale genetico chiasmi: siti dove è avvenuto il crossing over dove i cromosomi omologhi rimangono uniti

17 Comparsa dei chiasmi nella profase 1 è la conseguenza visibile dell avvenuto crossing over cromatidi ricombinanti cromatidi ricombinanti sono geneticamente diversi da quelli di origine

18 Schema relativo al crossing-over

19 Nella profase I si forma il complesso sinaptinemale o SINAPSI coinvolge 2 cromosomi omologhi che si appaiano TETRADE (4 cromatidi appaiati) Tramite crossing over si ottiene scambio di materiale genetico fra cromatidi omologhi non fratelli aumento variabilità genetica CHIASMI sono i punti di attacco dei cromosomi dove si è già verificato il crossing over Nella Metafase I un solo cinetocore per cromosoma prende contatto con le fibre del fuso Nell Anafase I si separano i cromosomi omologhi Telofase I: si formano due cellule con corredo già aploide (n)

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21 Assortimento indipendente dei cromosomi omologhi Nell anafase I è soltanto il caso ad attribuire un omologo della coppia ad una cellula piuttosto che ad un altra Più elevato è il numero cromosomico del corredo genetico, minore è la probabilità che si ristabiliscano le combinazioni parentali originali 2 n = Possibili combinazioni gametiche derivanti dall assortimento casuale dei cromosomi paterni e materni alla meiosi n = numero aploide del corredo 2 23 possibili combinazioni cromosomiche diverse fra cromosomi materni e paterni nell uomo!

22 Confronto fra mitosi e meiosi MITOSI costanza del materiale genetico MEIOSI il DNA viene duplicato prima di ogni divisione mitotica, ciò non accade nell intervallo che precede la Meiosi II Nella Mitosi i due cromatidi nel cromosoma sono identici, nella Meiosi II sono diversi a causa del crossing over Nell Anafase I si separano i cromosomi omologhi non i cromatidi come nella Mitosi Il numero di cromosomi che si allinea in metafase II è dimezzato rispetto a quello della metafase mitotica

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24 Informazioni relative al numero, forma, dimensioni dei cromosomi di una cellula: CARIOTIPO assetto cromosomico di un individuo cromosomi metafasici ben separati classificazione cromosomi in base alla posizione del centromero Cellule umane diploidi hanno un cariotipo costituito da 23 coppie di cromosomi 46

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27 Non-disgiunzione alla Meiosi porta ad ANEUPLOIDIA: condizione anomala in cui uno o più cromosomi mancano o sono in eccesso

28 TRISOMIA DEL 21 o Sindrome di Down

29 Non disgiunzione dei cromosomi sessuali alla Meiosi

30 La sindrome di Klinefelter è causata dalla presenza di una o più copie extra del cromosoma X nelle cellule di un maschio. Extra materiale genetico dal cromosoma X maschile interferisce con lo sviluppo sessuale, impedendo i testicoli di funzionare normalmente e riducendo i livelli di testosterone. I maschi con la sindrome di Klinefelter hanno tipicamente una copia extra del cromosoma X in ogni cellula, per un totale di due cromosomi X e un cromosoma Y (47, XXY). Triple X sindrome (chiamata anche 47, XXX o trisomia X): Questa sindrome risultati di una copia extra del cromosoma X in ciascuna delle cellule di una femmina. Femmine con trisomia X hanno tre cromosomi X, per un totale di 47 cromosomi per cellula. Il QI medio delle donne con questa sindrome è di 90, mentre il QI medio dei loro fratelli normale è di 100 loro statura in media è più alto per le femmine normali. Sono fertili ei loro figli non ereditano la condizione. Sindrome di Turner: Ciò si traduce in cui ognuno di cellule della femmina ha un cromosoma X normale ed il cromosoma sesso è mancante o alterata. Il materiale mancante genetico influenzi lo sviluppo e provoca i tratti caratteristici della condizione, tra cui bassa statura e sterilità. Circa la metà degli individui con sindrome di Turner hanno monosomia X (45, X).

31 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di ISOLARE AMPLIFICARE frammenti di DNA SEQUENZIARE Perché manipolare i geni? 1) Per facilitare lo studio dell espressione genica e della regolazione fisiologica; 2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione; 3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine; 4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici

32 CLONAGGIO-PROCEDURA ISOLAMENTO del gene INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell unione di sequenze di DNA in modo preciso...tutto ciò si ottiene con l ausilio di ENZIMI

33 Cromosoma batterico CLONAZIONE GENICA Batterio 1 Si isola un plasmide 2 Si inserisce 3 un gene nel plasmide Plasmide DNA ricombinante (plasmide) Batterio ricombinante Copie di geni Si isola il DNA Gene prescelto Si introduce il plasmide nella cellula prescelta Copie di proteine Cellula contenente il gene prescelto DNA Si clona la cellula che possiede il gene prescelto Il gene per la resistenza alle malattie è inserito nelle piante Clone della cellula Il gene modifica i batteri e li rende in grado di eliminare i rifiuti tossici La proteina consente alla neve di formarsi anche a temperature maggiori La proteina viene usata per sciogliere i coaguli nella terapia contro gli infarti

34 Cosa serve per un clonaggio

35 Tappe caratteristiche:

36 VETTORI DI CLONAGGIO Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi, ma tutti presentano alcune caratteristiche comuni: sono generalmente di piccole dimensioni, sono facilmente estraibili dalle cellule e quindi purificabili, possiedono un cosiddetto marcatore selettivo, ossia una proprietà che può essere utilizzata per selezionare i batteri che hanno incorporato il vettore di clonaggio (es. gene resistenza antibiotici), sono capaci di replicarsi autonomamente, ossia in modo indipendente dalla replicazione del cromosoma della cellula ospite, posseggono una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno (questa zona è detta polylinker).

37 VETTORI DI CLONAGGIO I vettori di clonaggio più comunemente utilizzati per clonare geni sono i: Plasmidi Batteriofagi (virus che infettano cellule batteriche) Cosmidi (cosmidi sono degli elementi genetici che, pur comportandosi come dei plasmidi, contengono sequenze di DNA specifiche di un batteriofago che sono utili per alcuni esperimenti di clonaggio) Cromosomi artificiali (vettori più specializzati e complessi, chiamati che si comportano come dei veri e propri cromosomi (anche se sono stati costruiti in laboratorio) o in cellule di E. coli (BAC = Bacterial Artificial Chromosome) o in cellule di lievito (YAC = Yeast Artificial Chromosome).

38 Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati per ottenere prodotti genici su larga scala Le applicazioni della clonazione genica includono la produzione di prodotti genici su larga scala per usi medici e altri usi. I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico. Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.

39 La tecnologia del DNA sta cambiando l industria farmaceutica e la ricerca biomedica La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impatto sull industria farmaceutica e sulla medicina umana. Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per produrre farmaci e per la diagnosi delle malattie. Terapie ormonali L insulina e l ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l uso della tecnologia del DNA ricombinante. Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.

40 Diagnosi e cura delle malattie In campo medico la tecnologia del DNA sarà, probabilmente, sempre più usata per diagnosticare le malattie. Oltre alla sua evidente importanza nell identificazione degli alleli associati alle malattie genetiche, si rivela infatti utile nel localizzare le infezioni. Vaccini Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado si sintetizzare anche nuovi vaccini. Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva.

41 PCR Per ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA si utilizza comunemente la tecnica PCR Quando il campione di DNA è scarso o impuro, la reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, o PCR) è un metodo più appropriato per ottenere un grande quantitativo di un particolare gene. Molecola iniziale di DNA Numero di molecole di DNA

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