BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

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1 ISTRUZIONI PER L'USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI ALL'USO PA Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) USO PREVISTO BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) è usato in test di sensibilità agli antibiotici mediante diffusione su dischetti per isolati clinici di Haemophilus spp. come descritto nella norma Approved Standard M2, pubblicata dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. In precedenza, il terreno raccomandato per Haemophilus influenzae era l'agar Mueller Hinton integrato con 1% di emoglobina e 1% di supplemento IsoVitaleX (agar cioccolato Mueller Hinton). 2 Studi approfonditi condotti da Jorgensen e colleghi hanno portato all'allestimento della base agar Haemophilus Test Medium (HTM). 3,4 Questo terreno è costituito da agar Mueller Hinton con aggiunta di fattore X (emina o ematina), fattore V (nicotinamide adenina dinucleotide, NAD) ed estratto di lievito. Un importante vantaggio dell'agar HTM rispetto all'agar cioccolato Mueller Hinton è la trasparenza all'esame visivo, perché consente di misurare il diametro delle zone dal fondo del disco, come avviene comunemente per i batteri non esigenti su agar Mueller Hinton. L'agar HTM, inoltre, contiene bassi livelli di timidina ed è quindi adatto per i test con trimethoprim/sulfametoxazolo. I criteri interpretativi per i test di sensibilità antimicrobica sono delineati nel documento M100 (M2) CLSI, incluso nel documento M2 CLSI. 1 Per informazioni dettagliate, consultare il documento. BD Haemophilus Test Medium Agar è costituito da agar Mueller Hinton con aggiunta di fattore X (emina o ematina), fattore V (nicotinamide adenina dinucleotide, NAD) ed estratto di lievito. REAGENTI BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) Formula* per litro di acqua purificata Estratto di carne bovina 2,0 g Idrolizzato acido di caseina 17.5 Amido 1,5 Agar 17,0 Estratto di lievito 5,0 Ematina 0,015 Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento. PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni di colore, essiccamento, incrinature o altri segni di deterioramento. Un eccessivo restringimento del terreno dovuto ad essiccamento può dare risultati di falsa sensibilità. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono PA

2 essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Per il controllo di qualità a cura dell'utente, consultare lo standard CLSI 1 o, all'occorrenza, gli standard nazionali. In pratica, usare le tecniche descritte più avanti nella Procedura del test, inclusi i ceppi di riferimento menzionati nella sezione Materiali non forniti. Almeno due volte a settimana sottoporre a test le piastre di BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) e i dischi antimicrobici in uso per valutarne lo stato di efficienza. Aspetto del terreno inoculato: ambra chiaro. PROCEDURA Materiali forniti BD Haemophilus Test Medium Agar (piastre impilate Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate. Materiali non forniti 1. Brodo di inoculo in provetta, come BD Trypticase Soy Broth (brodo di estratto di caseina di soia) o brodo Mueller Hinton II (con compensazione dei cationi), in volumi da 5 ml per la preparazione di un inoculo standard, e brodo sterile o soluzione fisiologica per la diluizione dell'inoculo. 2. Standard di raffronto al solfato di bario (0,5 ml di 0,048 M BaCl 2 [1,175% peso/vol. BaCl 2 2H 2 O] aggiunti a 99,5 ml di 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% vol/vol]). 3. Dispositivo fotometrico per regolare la torbidità della sospensione di inoculo in modo che sia equivalente allo standard McFarland 0,5. 4. In alternativa ai suddetti materiali (1-3), si può usare il BD Prompt Inoculation System (dispositivo graduato per la preparazione dell'inoculo). 5,6 5. Colture di controllo: Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC e ATCC Dischi di carta imbevuti di quantità specifiche di agenti antimicrobici, come i dischi per prove di sensibilità BD Sensi-Disc. 7. Erogatore di dischi, come il dispenser Sensi-Disc da 6 posti. 8. Riga o altro dispositivo per misurare in millimetri le dimensioni delle zone. 9. Incubatore in grado di produrre un'atmosfera con 5% di CO 2, o altra apparecchiatura che crei una atmosfera aerobica arricchita con CO Reagente per eseguire il test rapido della beta-lattamasi, come i dischi BD Cefinase. 11. Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio indispensabili. Tipi di campioni Il prodotto viene usato solo per i test di sensibilità delle colture pure di Haemophilus isolate da campioni clinici (v. anche CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). Procedura del test 1. Prima di iniziare il test di sensibilità, preparare una colorazione di Gram per confermare la purezza della coltura e l'identificazione presuntiva dell'haemophilus. 2. Come fonte dell'inoculo, usare parecchie colonie ben isolate prese direttamente da una piastra di agar cioccolato conservata durante la notte (preferibilmente per h) 3. Utilizzare il test rapido della beta-lattamasi per evidenziare rapidamente i ceppi resistenti a penicillina, ampicillina o amoxicillina. 4. Preparare una sospensione del microrganismo in brodo Mueller Hinton, brodo Mueller Hinton II o soluzione fisiologica 0,9%. Usare un dispositivo fotometrico per regolare la torbidità della sospensione su quella dello standard McFarland 0,5. La sospensione contiene circa 1 4 x 10 8 UFC/mL. Preparare con cura la sospensione perché concentrazioni più elevate di inoculo possono dare falsi risultati di resistenza con alcuni PA

3 antibiotici beta-lattamici, in particolare quando vengono testati i ceppi di H. influenzae che producono beta-lattamasi Per eseguire i test abituali, incluso il test per H. influenzae, si sono dimostrati utili i metodi alternativi di preparazione con dispositivi che permettono la standardizzazione diretta degli inoculi senza regolazione della torbidità, come BD Prompt Inoculation System. 6. Entro 15 min dalla regolazione della torbidità dell'inoculo, immergere un tampone sterile nell inoculo correttamente diluito e premendo sulla parte interna superiore della provetta ruotare il tampone più volte fino ad eliminare il liquido in eccesso. 7. Inoculare tre volte l'intera superficie del BD Haemophilus Test Medium Agar, ruotando ogni volta la piastra di 60 per ottenere un inoculo uniforme. 8. Prima di applicare i dischi imbevuti di antibiotico, scostare il coperchio per 3 5 min e lasciare la piastra a temperatura ambiente per non più di 15 min per far assorbire l'umidità eventualmente presente sulla superficie. 9. Applicare i dischi mediante un erogatore di dischi antimicrobici, adottando le opportune tecniche asettiche. Gran parte degli antibiotici produce zone di inibizione più grandi nei test con Haemophilus rispetto ad altri microrganismi. Pertanto, disporre non più di quattro dischi antimicrobici su una sola piastra da 100 mm, inclusi non più di sei tra i seguenti dischi: cefalosporine di terza generazione (ad es., cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ceftizoxime), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. Dopo aver depositato i dischi sull agar, applicarli con ago o pinze sterili in modo da porli a contatto con la superficie del terreno. 10. Entro 15 min dall'applicazione dei dischi, capovolgere le piastre e incubarle a 35 C per h in atmosfera aerobica arricchita con 5% di anidride carbonica. 11. Strisciare una piastra di BD Haemophilus Test Medium Agar con H. influenzae ATCC e incubare con le piastre del test di sensibilità per stabilire se il terreno consente una crescita adeguata. Risultati 1. Esaminare le piastre dopo h di incubazione. Si deve osservare una crescita "erbosa" convergente. Se si sviluppano solo colonie isolate, ripetere il test perché l inoculo è scarsamente concentrato. 2. Misurare (a vista) il diametro delle zone di totale inibizione, incluso il diametro del disco, e arrotondare al millimetro, utilizzando un calibro a corsoio, una riga o un calibro sagomato predisposto a tal fine. Il dispositivo di misura è collocato dietro la piastra, che è sistemata su un fondo nero non riflettente con illuminazione dall'alto. 3. Il margine è delimitato dall area priva di segni evidenti di crescita rilevabili a occhio nudo. Ignorare la crescita indistinta delle colonie più piccole, che sono appena rilevabili in prossimità del margine della zona di evidente inibizione. Con trimethoprim e sulfonamidi, gli antagonisti presenti in tracce sul terreno possono indurre un lieve sviluppo; ignorare quindi la crescita di minore entità (20% o meno della crescita erbosa) e delimitare il diametro della zona misurando i margini più evidenti. Calcolo e interpretazione dei risultati Consultare il documento M100 (M2) CLSI per interpretare i risultati ottenuti con gli isolati clinici di Haemophilus. 1 I risultati possono essere registrati come "resistente", "sensibile" o "intermedio" in base ai diametri di zona ottenuti. I microrganismi risultati positivi per la produzione di beta-lattamasi devono essere considerati resistenti all'ampicillina indipendentemente dal diametro delle zone. Sono stati descritti ceppi di H. influenzae resistenti all'ampicillina che non mostrano attività beta-lattamica. 7 Pertanto, se il diametro delle zone indica resistenza all'ampicillina, l'isolato deve essere considerato resistente all'antibiotico anche se il test della beta-lattamasi è negativo. Aggiungere le colture di controllo ogni volta che viene eseguito un test di sensibilità, o a scadenza settimanale se si possono documentare performance soddisfacenti conformi allo standard M2 CLSI, incluse le tabelle (M100) con i corretti diametri delle zone. 1 N.B. Periodicamente, vengono pubblicati i supplementi informativi del Documento M2 CLSI o le versioni rivedute, contenenti le tabelle aggiornate dei dischi antimicrobici e gli standard interpretativi. Per le raccomandazioni vigenti, consultare le tabelle più recenti. Tutti gli standard e i supplementi PA

4 informativi possono essere richiesti al Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA. Telefono: PERFORMANCE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA A. Studio di riproducibilità 8 Sono stati valutati tre lotti di BD Haemophilus Test Medium Agar usando il test di sensibilità antimicrobica su dischi (M2-A4) raccomandato dal NCCLS. 9 Per lo studio sono stati utilizzati in tutto 12 agenti antimicrobici (amoxicillina/clavulanato, ampicillina, ampicillina/sulbactam, cefaclor, cefonicid, ceftriaxone, cefuroxime, cloramfenicolo, ciprofloxacina, rifampicina, tetraciclina, trimethoprim/sulfametoxazolo) e 14 ceppi di H. influenzae. Sette su 14 erano ceppi American Type Culture Collection (ATCC), mentre i restanti sette erano stock-colture, comprendenti sei isolati clinici e una coltura per il controllo di qualità. I diametri delle zone ottenuti con i tre lotti di terreno sono stati esaminati alla luce dei criteri interpretativi (tabella 2A) del M2-A4. 9 Solo in sei casi le zone ottenute con un lotto hanno dato luogo a una categoria interpretativa differente rispetto agli altri due lotti. Di queste sei discrepanze, quattro erano con tetraciclina, una con defaclor e una con cefuroxime. Nel caso della tetraciclina, il risultato darebbe una categoria interpretativa classificata "sensibile" o "intermedia" (errore secondario). Con cefaclor e cefuroxime, il riscontro di una differenza di 1 mm darebbe una categoria "intermedia" o "resistente" (errore secondario). In questo studio erano presenti cinque ceppi di H. influenzae che hanno prodotto betalattamasi. Con ciascuno di questi ceppi, i diametri delle zone con ampicillina prodotti dai singoli lotti di HTM sarebbero interpretabili come "resistenti". Due dei cinque ceppi hanno prodotto anche cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). Le zone di cloramfenicolo ottenute con i due ceppi confermerebbero la resistenza al cloramfenicolo. 10,11 B. Confronto con agar cioccolato Mueller Hinton 8 La procedura NCCLS relativa ai dischi è stata eseguita con 213 isolati clinici di H. influenzae su agar HTM e agar cioccolato Mueller Hinton. 9,12 Gli agenti antimicrobici testati erano ampicillina, ampicillina/sulbactam, amoxicillina/clavulanato e cloramfenicolo. Si tratta, infatti, degli unici agenti antimicrobici per cui esistono criteri di interpretazione dei diametri delle zone su agar cioccolato Mueller Hinton. 13,14 Sono stati ottenuti i seguenti risultati. BD Haemophilus Test Medium Agar S I R Agar cioccolato S Mueller Hinton I R Concordanza: 99,6% S = Sensibile I = Intermedio R = Resistente Con l'ampicillina vi sono stati due errori primari e un errore secondario. Per entrambi gli errori primari, BD Haemophilus Test Medium Agar ha dato come risultato "resistente", mentre l'agar cioccolato Mueller Hinton ha dato come risultato "sensibile". Entrambi gli isolati erano positivi per la beta-lattamasi. Il risultato "resistente", quindi, era corretto. L'errore secondario era con un isolato che ha dato esito "intermedio" su agar HTM e "sensibile" su agar cioccolato Mueller Hinton. C. Limitazioni della procedura In alcune combinazioni organismo-agente antimicrobico, la zona di inibizione può mostrare margini indistinti che potrebbero indurre a errori di interpretazione. Se la concentrazione dell'inoculo è inadeguata, i risultati possono essere errati. Le zone di inibizione possono apparire esigue se l'inoculo è troppo pesante, o vaste e difficilmente misurabili se l'inoculo è troppo leggero. Una errata conservazione dei dischetti antimicrobici può causare perdita di attività e falsi risultati di resistenza. La sensibilità in vitro di un organismo a un dato agente antimicrobico non implica necessariamente che l'antibiotico sia efficace anche in vivo. Per una corretta interpretazione dei risultati, consultare le relative voci della bibliografia. 2,15 PA

5 BIBLIOGRAFIA 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BD Haemophilus Test Medium N. di cat Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection PA

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