Rapporto sugli studi di monitoraggio biologico effettuati nella popolazione della ASL 8 Arezzo anni

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1 Rapporto sugli studi di monitoraggio biologico effettuati nella popolazione della ASL 8 Arezzo anni A cura di : 26 luglio 2013 Azienda USL 8 Arezzo Lab.Sanità Pubblica Az.USL 8 Siena Istituto per lo Studio e la prevenzione Oncologica (ISPO) Hanno contribuito nello specifico: - alla ideazione e predisposizione del protocollo: Cristina Aprea (ASL7 Siena) Elisabetta Chellini (ISPO) Maria Cristina Fondelli (ISPO) Maria Teresa Maurello (ASL 8 Arezzo) Gianfranco Sciarra (ASL 7 Siena) - al reclutamento dei soggetti e alla raccolta dei campioni biologici: Maria Teresa Maurello (ASL 8 Arezzo) i medici di medicina generale delle aree in studio gli operatori della Struttura Igiene Pubblica della ASL 8 Arezzo - all analisi di laboratorio: Cristina Aprea (ASL7 Siena) Gianfranco Sciarra (ASL 7 Siena) - all analisi statistica dei dati: Barbara Cortini (ISPO) Elisabetta Chellini (ISPO) - alla stesura del presente rapporto: Elisabetta Chellini (ISPO) Barbara Cortini (ISPO) Cristina Aprea (ASL7 Siena) Gianfranco Sciarra (ASL 7 Siena) Maria Teresa Maurello (ASL 8 Arezzo) Nessuno degli autori del presente rapporto e nessuno di coloro che ha predisposto il protocollo, condotto lo studio ed effettuato le analisi di laboratorio e statistiche ha conflitti di interesse da dichiarare. Lo studio si inserisce nell ambito del Piano Mirato riguardante lo studio di popolazione nei Comuni di Civitella della Chiana ed Arezzo in relazione all'esposizione a fattori di inquinamento ambientale presentato dalla ASL 8 di Arezzo finanziato dalla Regione Toscana, con Delibera n. 154 del , ed il cui coordinatore è Domenico Sallese (ASL 8 Arezzo) Il presente documento è stato sottoposto alla valutazione dei revisori scientifici individuati presso l Istituto Superiore di Sanità di Roma: Loredana Musmeci, Alessandro Alimonti, Pietro Comba 1

2 Indice 1. Lo studio di monitoraggio biologico sulle urine della popolazione di Civitella e per confronto della popolazione del centro urbano di Arezzo e di Badia Prataglia Premessa Il protocollo di studio...4 OBIETTIVI...4 MATERIALI E METODI...4 NUMEROSITÀ CAMPIONARIA...5 Indicatori biologici... 6 Motivazione della scelta degli analiti... 6 Questionario... 9 ANALISI DI LABORATORIO DEI CAMPIONI BIOLOGICI...9 ANALISI STATISTICA...10 TEMPISTICA...11 ASPETTI RELATIVI ALLA RISERVATEZZA DEI DATI Risultati...13 NUMEROSITA CAMPIONATA...13 CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE...13 GLI ANALITI...15 ANALISI DELLE VARIABILI RACCOLTE TRAMITE QUESTIONARIO...30 ANALISI DEI DATI DI MONITORAGGIO BIOLOGICO NEI RESIDENTI A CIVITELLA PER ISOAREA DI INQUINAMENTO Considerazioni Lo studio di monitoraggio biologico sui capelli di soggetti residenti a Civitella Note sulle procedure adottate Risultati...48 CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE...48 GLI ANALITI Considerazioni Lo studio di monitoraggio biologico sulle urine di soggetti residenti nelle frazioni di Quarata e di San Zeno del Comune di Arezzo Procedure adottate I risultati di Quarata...60 CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE...60 GLI ANALITI...61 ANALISI DELLE VARIABILI RACCOLTE TRAMITE QUESTIONARIO I risultati di San Zeno...68 CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE...68 ANALITI Considerazioni Bibliografia Legenda

3 - 1 - Lo studio di monitoraggio biologico sulle urine della popolazione di Civitella e per confronto della popolazione del centro urbano di Arezzo e di Badia Prataglia 1.1. Premessa Nell area di Civitella Val di Chiana, da qui in avanti denominata sempre Civitella, è attiva dalla metà degli anni 70 un azienda, la Chimet, che recupera e affina metalli preziosi utilizzando anche metodiche di incenerimento. Dalla metà degli anni 90 effettua inoltre incenerimento di rifiuti ospedalieri. Una grande preoccupazione sul possibile inquinamento ambientale prodotto dall azienda e sui suoi possibili impatti sanitari è emersa negli ultimi anni in seguito a vari fatti: (i) a due episodi di superamento dei limiti di emissione consentiti (per il mercurio nel 2005 e per le diossine e furani nel 2006), (ii) (iii) alla recente richiesta dell azienda di raddoppiare la propria attività industriale; la percezione di un possibile cluster di leucemie negli abitanti delle aree circostanti, oggetto peraltro di un approfondimento specifico concomitante a questo studio; (iv) i risultati di uno studio pilota di monitoraggio biologico umano effettuato nel 2009 in 57 soggetti di cui 39 residenti a Civitella entro un raggio di 3 Km dall impianto e 18 in un area considerata di controllo sulle montagne casentinesi, a Badia Prataglia; (v) l indicazione del Comitato d Inchiesta Pubblica attivato nell ambito della VIA dalla Provincia di Arezzo, che in base ai risultati dello studio pilota aveva suggerito di aspettare i risultati del vero e proprio studio di monitoraggio biologico umani prima di procedere ad una qualche decisione in merito. Lo studio pilota era stato effettuato con l intento di identificare i biomarcatori di esposizione (o di effetto biologico precoce) da utilizzare per un vero e proprio studio di monitoraggio biologico umano (MBU) da avviare successivamente per capire l entità, la distribuzione e l andamento nel tempo dell esposizione della popolazione residente nell area di Civitella agli inquinanti potenzialmente emessi dall azienda ivi presente. Lo studio pilota aveva evidenziato una possibile pressione ambientale, riconducibile presumibilmente anche all azienda Chimet, per i residenti nelle vicinanze dell impianto. I risultati dello studio pilota erano stati infatti i seguenti: - erano stati osservati livelli significativamente più elevati di Antimonio(Sb), Cadmio (Cd) e Nichel (Ni) urinari nel gruppo residente a Civitella rispetto a quello di Badia Prataglia; - erano stato osservati valori significativamente più elevati di Cr urinario nel gruppo di controllo - erano stati osservati pochi campioni con Ag urinario superiori al LoQ, ma questi erano solo nel gruppo di Civitella; - era stato infine osservato uno spettro qualitativamente alterato delle porfirine urinarie nel 30% del campione di residenti a Civitella. Lo studio pilota, con una piccola numerosità del campione (previsti 100 soggetti di cui 50 a Civitella e 50 a Badia Prataglia, tutti maschi; in realtà campionati 39 a Civitella e 18 controlli), aveva fornito una prima stima sperimentale delle medie campionarie e delle relative deviazioni standard (DS) delle concentrazioni ematiche di Cadmio e Mercurio, e urinarie di Antimonio, Cadmio, Cromo, Nichel, Argento, Cobalto, Platino, Mercurio, acido trans,trans-muconico e 1-idrossi-pirene. Data l esigua numerosità, minore perfino di quella prevista, le stime calcolate possono aver fornito un informazione incompleta o distorta e pertanto è stato disegnato e condotto lo studio di MBU descritto in questo rapporto. 3

4 1.2. Il protocollo di studio OBIETTIVI L obiettivo generale dello studio è quello di valutare nella popolazione generale di Civitella non professionalmente esposta l impatto a esposizioni a sostanze potenzialmente emesse in fase di incenerimento, trattamento rifiuti e affinazione metalli preziosi, attraverso il dosaggio di markers di dose interna o di esposizione/effetto più sensibili per monitorare tali esposizioni. In particolare, gli obiettivi specifici dallo studio sono così riassumibili: a) determinare gli attuali livelli degli analiti considerati nell urina delle 24 ore di un campione di persone residenti nelle zone vicino all impianto Chimet (frazioni: Pieve al Toppo, Badia al Pino e Tegoleto) e per confronto in 2 campioni di altre aree rappresentate da una zona bianca (Badia Prataglia) e da un area urbana residenziale (Arezzo); b) verificare l esistenza di eventuali gradienti di concentrazione dei vari analiti tra le zone campionate, e nell area di Civitella in relazione ai modelli diffusionali degli inquinanti emessi dall azienda Chimet, modelli sviluppati nel dall Università di Siena; c) per ogni analita individuare tramite questionario quali sono i fattori (abitudini alimentari, residenza, storia lavorativa ecc.) che incidono sull escrezione urinaria degli analiti considerati anche con lo scopo di identificare eventuali sottogruppi a particolare rischio. MATERIALI E METODI Il disegno dello studio Il disegno dello studio è parzialmente modificato rispetto allo studio pilota. In particolare: - è stato scelto di inserire nel campione di popolazione un fattore di variabilità rappresentato dalla popolazione femminile esclusa nello studio pilota a causa di problemi organizzativi (erano stati allora individuati i potenziali soggetti in studio tra i donatori di sangue che erano prevalentemente uomini); - è stato scelto di indagare anche una popolazione della stessa provincia, residente in un area antropizzata come Civitella, ma dove l inquinamento prodotto dall uomo non fosse industriale ma legato al traffico, e cioè il centro urbano del comune di Arezzo; - l indagine è stata limitata alla matrice urina scartando il sangue e utilizzando le urine delle 24 ore. I motivi di tale scelta sono i seguenti: (i) il prelievo dei campioni avviene con modalità non invasive, (ii) l urina è la matrice biologica più indicativa dal punto di vista del carico corporeo degli elementi oggetto di studio, specialmente in caso d esposizioni protratte nel tempo; (iii) lo studio pilota non aveva evidenziato per la matrice sangue differenze statisticamente significative nel confronto tra i residenti di Civitella in Val di Chiana e di Badia Prataglia; (iv) infine un unica matrice consente la ricerca di tutti gli analiti target e consente anche una raccolta integrata nelle 24 ore in modo da poter misurare il quantitativo assoluto dei singoli analiti escreto a livello giornaliero e non inficiato dal momento particolare di raccolta del campione spot; - gli analiti inorganici da indagare sono stati limitati ai seguenti: Cadmio, Mercurio, Nichel, Cromo, Antimonio, Platino, Argento e Cobalto escludendo l Arsenico che non aveva mostrato nello studio pilota alcuna differenza statisticamente significativa tra i residenti di Civitella in Val di Chiana e quelli di Badia Prataglia; - gli analiti organici sono stati limitati al solo spettro delle porfirine urinarie. Degli analiti determinati nello studio pilota infatti, sia l 1-idrossi-pirene che l acido trans,trans-muconico non mostravano differenze statisticamente significative tra i residenti di Civitella in Val di Chiana e di Badia Prataglia, mentre lo spettro delle porfirine disponibile solo nel campione di Civitella in Val di Chiana si era mostrato qualitativamente alterato nel 30% circa dei campioni prelevati. Lo studio è di tipo trasversale (cross-sectional). I partecipanti sono quindi maschi e femmine, di età compresa tra 18 e 60 anni. I soggetti campionati è stato deciso che dovessero essere persone in buone condizioni di salute e abitanti nei comuni sopra specificati da almeno 10 anni. Sono stati esclusi i fumatori, i lavoratori dell industria orafa e metalmeccanica, gli addetti ad impianti di incenerimento e/o lavorazione rifiuti, ed i netturbini. Il prelievo dei campioni era previsto che fosse completato nell arco temporale di 3 mesi per limitare la variabilità legata alla stagione 4

5 Popolazione La popolazione cui lo studio è stato rivolto e per la quale s intende inferire è la popolazione adulta, in buone condizioni di salute, residente nel comune di Civitella in Val di Chiana (frazioni: Pieve al Toppo, Badia al Pino e Tegoleto) e nei comuni di Arezzo (centro urbano) e Badia Prataglia- Casentino (area di controllo o riferimento). NUMEROSITÀ CAMPIONARIA Questo studio ha previsto di raccogliere e analizzare una numerosità adeguata ed ottimale per confermare le differenze statisticamente significative trovate per i livelli urinari dei biomarkers Sb, Cd, e Ni nello studio pilota, considerando oltre la popolazione adulta maschile anche quella femminile. Medie e DS calcolate per gli analiti che hanno dato risultati significativi nello studio pilota sono state pertanto utilizzate per la stima della numerosità campionaria della nuova indagine. Ponendo l errore di 1 a specie a 0,05 e la potenza al 90%, ipotizzando che i risultati ottenuti nei maschi fossero validi anche per le femmine (non si disponeva per loro di nessuna informazione preliminare dallo studio pilota), e ponendo un rapporto tra esposti e controlli pari a 1 si sono ottenute le numerosità campionarie riportate nella tabella 1.1. Per il calcolo si è utilizzato il programma STATA 9. Tabella Numerosità campionaria stimata utilizzando i risultati dello studio pilota Analita Alfa (due code) potenza Media 1 (DS1) Media 2(DS2) Numerosità necessaria per sesso Sb-U (0.08) 0.05 (0.03) 86 Cd-U (0.41) 0.21 (0.16) 25 Ni-U (3.1) 3.7 (2) 36 La numerosità campionaria scelta (n= 90 maschi, e n=90 femmine) nella zona di potenziale esposizione, cioè di Civitella, dovrebbe permettere anche di confermare le differenze tra i livelli di antimonio, con una buona potenza a posteriori dello studio. Per quanto riguarda la numerosità dei corrispondenti controlli residenti nella zona urbana di Arezzo, posti pari a 75 per ciascun sesso, risulta sufficiente per fornire un quadro della distribuzione dei livelli dei biomarkers per questa popolazione. La numerosità per la zona non industrializzata (Badia Prataglia-Casentino) pari a 100 (n=50 maschi e n=50 femmine) è minima ma stimata sufficiente per fornire la variabilità della distribuzione di analiti scelti in questa popolazione. Criteri di eleggibilità Il campione è costituito da maschi e femmine non fumatori, età anni, residenti nelle aree di interesse da almeno 10 anni. Ognuno dei partecipanti doveva fornire il proprio consenso informato allo studio in questione (allegato 1) e dichiarare di: a) non essere fumatore o essere ex-fumatore da almeno 5 anni. b) essere in buone condizioni di salute c) non avere malattie croniche che potessero pregiudicare i risultati dello studio, in particolare epatopatie acute e croniche ed insufficienza renale, né essere affetti da malattie ematologiche, compreso il trait talassemico d) non essere affetti e/o non avere parenti affetti da porfiria ereditaria e) non fare uso di droghe (l uso di alcool, integratori minerali e/o vitaminici in qualsiasi forma è stato comunque rilevato anche tramite questionario); f) non essere professionalmente esposto agli inquinanti oggetto dello studio. Non erano cioè idonee per l'inserimento nello studio le persone che svolgevano le attività lavorative seguenti : o lavoratori industria orafa e/o all affinazione dei metalli preziosi o lavoratori industria metalmeccanica o addetti agli impianti di incenerimento di qualsiasi tipo, di depurazione, discariche, alla raccolta e/o trattamento di rifiuti di qualsiasi tipologia (compresi operatori ecologici e netturbini) d) compilare un questionari ad-hoc e) fornire idonei materiali biologici (in quantità, qualità e rispondenza alle caratteristiche di accettabilità). 5

6 Modalità di reclutamento I soggetti sono stati reclutati con la collaborazione dei medici di famiglia i quali hanno provveduto a selezionare i propri assistiti sulla base dei criteri di inclusione nello studio. Ai soggetti così selezionati è stata inviata una lettera informativa (allegato 4) con la quale si dettagliavano i motivi dello studio chiedendo la disponibilità a fornire il campione e a firmare il consenso. A loro sono state inoltre comunicate le modalità di raccolta del campione (modi e tempi) e di compilazione del questionario. Per migliorare l'adesione dei partecipanti allo studio e per darne massima pubblicità, sono state messe a punto procedure per illustrarne le finalità e le modalità di conduzione (conferenza stampa, locandine, lettere informative). Indicatori biologici Lo studio ha previsto di utilizzare come matrici biologiche le urine delle 24 ore sulle quali sono stati determinati i seguenti analiti: - Antimonio - Argento - Cadmio - Cobalto - Cromo - Mercurio totale inorganico - Nichel - Platino - Creatinina - Profilo delle porfirine urinarie Motivazione della scelta degli analiti a) I metalli I metalli che sono stati scelti come traccianti delle emissioni di Chimet e sono Antimonio, Argento, Cadmio, Cromo, Cobalto, Mercurio, Nichel e Platino. Per ciascuno di essi vengono riportate le motivazioni che hanno portato a scegliere tali analiti. L antimonio (Sb) ( è ubiquitario nell ambiente. L Sb è aggiunto alle leghe metalliche per aumentarne la durezza. Gli ossidi di Sb sono utilizzati come ritardanti di fiamma nel materiale plastico/gomme, nei tessuti, nelle colle e nei pigmenti. E assorbito tramite inalazione degli aerosol o per contatto. La sua tossicità è dimostrata così come l assenza di effetti positivi sull uomo. L esposizione cronica provoca pneumoconiosi da Sb, bronchiti croniche, enfisemi, adesioni pleuriche e irritazione. Il comportamento tossicologico e fisiologico dipende dallo stato di ossidazione: l Sb (III) è molto affine ai globuli rossi e ai gruppi SH delle cellule ed è volatile. Il triossido di antimonio è stato classificato dalla IARC (1990a) nel gruppo 2B dei possibili cancerogeni per l uomo. L argento (Ag) è un metallo nobile. L'impiego principale è nel settore orafo, in fotografia, nell industria elettrica ed elettronica, altre applicazioni sono in odontoiatria ed in batterie di lunga durata e di grande capacità a base di zinco. I livelli d Ag nel suolo non sono solitamente alti tranne nelle zone minerarie dove possono a volte essere fino a 44 ppm. I composti possono essere lentamente assorbiti dai tessuti del corpo, con conseguente pigmentazione bluastra o nerastra della pelle (argiria) (Drake et al. 2005). Le soluzioni contenenti sali solubili a contatto con gli occhi possono provocare gravi ferite corneali, a contatto della pelle possono causare l'irritazione cutanea. Il contatto ripetuto e prolungato con la pelle può causare dermatite allergica. Questo metallo è di interesse, non tanto per la sua tossicità che si esplica principalmente ad alte dosi e su soggetti sensibili, ma perchè si pensa che possa essere un tracciante specifico delle emissioni della Chimet. Il cadmio (Cd) è un elemento molto diffuso in natura. I processi di combustione (carbone, legna, tabacco e petrolio), l incenerimento rifiuti e l industria metallurgica dei materiali non-ferrosi compresa quella orafa e galvanica sono le principali sorgenti antropiche del Cd rilasciato in atmosfera oltre all utilizzo di fertilizzanti in agricoltura. Il Cd ha una dose di riferimento orale di mg/kg/die. Il Cd è nefrotossico, neurotossico, teratogeno, genotossico e esplica effetti negativi sul sistema endocrino e riproduttivo, provoca osteoporosi (IPCS, 1992; IHCP, 2003). Studi epidemiologici e di laboratorio hanno evidenziato che il cadmio induce il tumore della prostata e del 6

7 polmone (Waalkes, 2000; Sahmoun et al., 2005). E stato classificato come cancerogeneno certo per l uomo (Gruppo 1) dalla IARC (1993), e probabile (Gruppo B1) dall US-EPA. L emivita del cadmio ematico è di uno - tre mesi, mentre la quota complessiva di Cd nell organismo umano ha un emivita lunghissima (10-30 anni). Questo metallo è stato scelto perché è considerato un buon marcatore delle emissioni degli inceneritori, è particolarmente volatile ha la proprietà di accumularsi con effetti tossicologici gravi. In uno studio condotto sulla popolazione svedese (Jarup et Al. 1997) è riportato che la dieta è il principale determinante dell intake di Cd nella popolazione generale non fumatrice. L abitudine al fumo è fonte di assorbimento a causa della presenza Cd nelle foglie di tabacco ed i livelli di Cd ematico nei soggetti fumatori possono risultare fino a 5 volte superiori rispetto ai non fumatori. In un ulteriore studio svedese (Hellstrom et Al. 2004), che si proponeva di valutare l influenza delle concentrazioni ambientali del metallo sui livelli di urinari ed ematici della popolazione generale, nessuna associazione significativa è stata osservata con il Cd nel suolo o nei vegetali in entrambi i sessi: le concentrazioni ambientali di Cd non possono essere impiegate come surrogati per stimare l esposizione umana al metallo. I livelli di cadmiuria sono influenzati in maniera statisticamente significativa dal sesso: uno studio condotto recentemente (Satarug et Al. 2002) su 61 cadaveri della popolazione generale australiana dimostra che i livelli medi di Cd nel fegato e nel rene risultano superiori nelle femmine a parità di età e di livelli polmonari. Il cromo (Cr) ( è un elemento molto diffuso in natura. Alcune sorgenti antropiche sono diventate molto importanti negli ultimi decenni. Il Cr è immesso in atmosfera attraverso i processi di combustione (carburanti, carbone ecc..) e dall industria dei metalli. Le principali forme sono il Cr 3+, considerato un nutriente, e il Cr 6+, che è molto tossico. Il Cr 6+ è prontamente assorbito dai polmoni, mentre lo è scarsamente il Cr 3+. Il Cr 6+ è stato classificato cancerogeno certo per l uomo (Gruppo 1) dalla IARC (1990b), e ci sono evidenze certe che induca il tumore del polmone. L US EPA lo ha classificato cancerogeno nel L apparato respiratorio è l organo target della tossicità del Cr 6+ sia acuta che cronica. L esposizione inalatoria cronica a Cr 6+ produce ulcerazioni e perforazioni del setto nasale, bronchiti, asma ed altri effetti. L inalazione di composti insolubili del Cr può causare pneumoconiosi. Le persone che vivono in prossimità di discariche che accolgono rifiuti contenenti Cr o in vicinanza di industrie che utilizzano Cr hanno alta probabilità di essere esposti ad una miscela di Cr. Il cobalto (Co) si ritrova naturalmente nelle rocce, suolo, piante ecc.. ed ha proprietà simili al ferro ed al nichel. Il metallo viene utilizzato per produrre leghe e acciai. I suoi composti sono utilizzati come pigmenti per la colorazione dei vetri, per gli smalti per ceramica e per colori e vernici, come catalizzatore in vari settori, come essiccante per vernici. Il 60 Co e 57 Co, radioattivi, sono utilizzatiper la sterilizzazione apparecchi medicali e alimenti, in radioterapia per il trattamento dei tumori e per la ricerca scientifica. La popolazione generale può essere esposta tramite l inalazione e l alimentazione. L assorbimento tramite gli alimenti è stato stimato essere 5 40 µg/die. A bassi livelli il Co è elemento in traccia essenziale in quanto entra a far parte della vitamina B12. L inalazione delle particelle contenenti Co provoca effetti sul tratto respiratorio. L esposizione occupazionale al metallo o alle sue leghe ha effetti sulla funzione respiratoria, aumenta asma e dispnea ai livelli di 0,015 0,13 mg/m3 di Co. Altri effetti negativi sono a carico della tiroide, del cuore, e provoca dermatiti allergiche e eczemi ( Studi su non esposti hanno riportato livelli ematici di 0,05 0,19 µg/dl e urinari di 0,04 2 µg/dl di Co ( ). Nel 2006 la IARC ha rivalutato la cancerogenicità delle particelle di Co metallico e il solfato di Co e altri Sali solubili di Co (II), concludendo che c è una limitata evidenza di cancerogenicità per l uomo del metallo e dei suoi Sali (gruppo 2B); mentre il Cobalto con carburo di tungsteno sono stati inserito nel gruppo gruppo 2A (IARC, 2006). Il Co è stato scelto per lo studio in quanto può essere considerato un indicatore delle emissione dei processi di fusione. E utilizzato in oreficeria in diverse leghe. Il mercurio (Hg) naturalmente sulla crosta terrestre (c.a. 80 µg/kg). Esiste in diverse forme chimiche: come metallo, in forma inorganica e organica, principalmente come metil-mercurio il più tossico. Il Hg metallico ed inorganico che vengono rilasciati in atmosfera dai processi di estrazione dell oro, fusione, da attività industriali (cloro-soda, produzione pile), combustione di combustibili fossili ed incenerimento di rifiuti, sono depositati sul suolo, e nell acqua e quindi trasferiti ai sedimenti dove sono trasformati in metil-mercurio, che si può bio-accumulare nella catena alimentare. Il metil-mercurio, che è presente principalmente nei pesci e nei molluschi, è particolarmente tossico per il sistema nervoso e sul cervello; il mercurio organico, ed in particolare 7

8 il metil-mercurio, viene distribuito al SNC, al fegato, al rene; nelle donne in gravidanza attraversa la placenta con effetto teratogeno. L esposizione durante il periodo prenatale (in utero) è considerata la più pericolosa per l uomo e provoca deficit intellettivi e motori. Gruppi di popolazione particolarmente sensibili risultano le donne in età fertile, gestanti, feti e bambini. Il Hg, la forma in cui si trova il Hg in atmosfera per 95% delle volte, è volatile ed viene principalmente assorbita a livello polmonare. Hg supera la barriera emato-encefalica e si accumula nel SNC dove esplica i suoi effetti; i sintomi correlati sono tremori, irritabilità, insonnia, perdita di memoria, perdita di tono muscolare, polineurpatia, decifit cognitivi. Ad alte dosi può provocare disfunzioni renali e polmonari. Hg 2+ è in grado di denaturare le proteine del tratto gastrointestinale con effetti corrosivi; può causare necrosi del tubulo renale. Nell ambito dell esposizione extralavorativa a mercurio, le amalgame dentarie rappresentano la fonte più importante di mercurio inorganico (IPCS-WHO, 2003) e condizionano i livelli del metallo in campioni biologici quali sangue e urina (WHO, 1997). E stato dimostrato che il mercurio viene continuamente rilasciato dalle amalgame in dipendenza della loro composizione, del ph della saliva, delle abrasioni meccaniche e dell attività dei microorganismi del cavo orale (Aronsson, 1989; Cox, 1987; Derand, 1989; Hensten-Pettersen, 1986; Vimy, 1985). In particolare la letteratura scientifica focalizza l attenzione sull aumento di concentrazione di mercurio nella saliva di soggetti portatori di otturazioni dentarie con amalgama in seguito a masticazione di gomma o bruxismo (digrignamento dei denti) (Barregard, 1995; Gay, 1979). Altra sorgente di introduzione di mercurio nell'organismo è l impiego di preparati (cosmetici, liquidi per lenti a contatto, vaccini, etc.) contenenti disinfettanti mercuriali (es. Thimerosal), specialmente quando questi vengono utilizzati con regolarità come nel caso di lavaggio e disinfezione delle lenti a contatto. L'abitudine al fumo di tabacco potrebbe essere causa di introduzione di mercurio nell'organismo umano: è stato riscontrato un contenuto del metallo nel tabacco dell ordine di 5 ng/sigaretta (Normann, 1977). Le urine sono considerate la miglior matrice per determinare il carico corporeo di Hg dovuto a esposizione sia breve sia a lungo termine a Hg e inorganico (WHO 2008). Il mercurio è stato scelto, oltre che per gli effetti tossici menzionati, per l evento di superamento del valore limite nelle emissioni della ditta Chimet avvenuto nel Il nichel (Ni) è ubiquitario nell ambiente a bassi livelli, deriva dall erosione delle rocce, dalle emissioni vulcaniche, dal fumo di sigaretta, dall alimentazione. E utilizzato dalle industrie chimiche, alimentari (produzione di grassi e olio), metallurgiche, petrolchimiche, nella produzione di plastiche, gomme sintetiche, batterie elettriche, monete e pigmenti. Il Ni è assorbito principalmente attraverso l apparato respiratorio sotto forma di Ni2+ solubile. La deposizione delle particelle nei polmoni dipende dal loro diametro, forma e densità. Nel tratto gastrointestinale è assorbito solo in parte (1-10%) della quantità ingerita. Il Ni non è metabolizzato e nel sangue si lega a proteine, si accumula soprattutto a livello polmonare e renale. La via di escrezione principale è quell urinaria. La tossicità del Ni varia a seconda della forma chimica: i sali di Ni causano dermatiti, il nichel carbonile causa cancro delle fosse nasali e del polmone. Le dermatiti da nichel, che consistono in eczemi e arrossamenti della cute, sono causate dal contatto prolungato. L US EPA ha classificato le polveri di raffineria del Ni e i solfuri cangerogeni per l uomo, e il Ni carbonile come probabile cancerogeno. I composti del Nichel sono stati classificati dalla IARC (1990b) nel Gruppo 1 dei cancerogeni certi per l uomo. Il Platino (Pt) è un metallo prezioso. L aumento dei livelli dei Pt nell ambiente e in matrici biologiche è stata documentata da numerosi studi in numerosi paesi ed è stata attribuita all introduzione delle marmitte catalitiche per abbattere le emissioni veicolari. Il Pt è praticamente inerte e gli effetti sanitari citati in letteratura sono attribuiti soprattutto ai sali solubili. A differenza degli altri metalli pesanti citati, i cui i livelli si vanno abbassando, i livelli di Pt vanno aumentano nella popolazione generale con effetti sanitari non del tutto noti. Questo metallo stato scelto come potenziale marcatore dell attività della Chimet e delle traffico autostradale. Alcuni tra i metalli scelti possono passare attraverso la placenta (Cd, Ni, Hg) o nel latte materno (Cd, Hg, Ni) così che un elevato carico corporeo si potrebbe ritrovare già nei feti e nei lattanti. b) Il profilo delle porfirine urinarie I prodotti intermedi della catena di sintesi del gruppo EME, sono isomeri che si chiamano porfirine; otto enzimi assicurano la sintesi del gruppo EME, ciascuno di essi è specificamente sensibile alla azione tossica di mercurio, piombo, alluminio, arsenico, oltre che ai bifenili, ai pesticidi polialogenati, alla diossina. Dosando nelle urine di una persona le singole porfirine ed i loro rapporti, è possibile tracciare il loro profilo escretivo. Il profilo escretivo non è un risultato numerico, 8

9 bensì una curva che indica come sta funzionando un processo di sintesi e quindi se esiste una interferenza funzionale da parte degli inquinanti menzionati eventualmente accumulati. Il profilo delle porfirine urinarie rappresenta quindi un test altamente sensibile dell effetto biologico negativo di eventuali carichi corporei di metalli quali mercurio, piombo, arsenico, alluminio, PCBs, composti alogenati. E specifico perché l effetto di ciascuno dei tossici considerati si traduce in uno specifico pattern escretivo; è inoltre un test quantitativo, ben correlandosi alla entità del body burden per i metalli pesanti considerati e si presta ad essere usato come test di controllo dell esposizione a miscele complesse di tossici (Fowler. 2001). Modalità di raccolta dei campioni: Una caraffa di plastica schermata dalla luce tramite film di carta stagnola è stata fornita dal personale della USL 8 ai soggetti arruolati affinché potessero inserire la loro urina delle 24 ore. Al termine della raccolta il personale sanitario della USL 8 ha provveduto a effettuare il ritiro del campione. Lo stesso personale sanitario ha misurato il volume totale escreto nelle 24 ore (diuresi) e trasferito una parte dell urina (circa 100 ml) in un contenitore di plastica sempre schermato dalla luce tramite carta stagnola. La diuresi è stata annotata sul contenitore consegnato al laboratorio in modo dal poter calcolare l escrezione dei singoli analiti nelle 24 ore. Il campione è stato quindi congelato alla temperatura di almeno -18 C. Entrambi i contenitori utilizzati per la raccolta dell urina sono stati essere preventivamente sottoposti a lavaggio con acido nitrico al 5% a cura del Laboratorio di Siena. Tutti i campioni sono stati trasportati congelati al Laboratorio, dove sono stati analizzati individualmente in cieco con metodiche analitiche validate ed affidabili e con stretto controllo di qualità. Il box seguente riporta con maggiore dettaglio le modalità operative di raccolta dei campioni. Modalità operative per la raccolta dei campioni Per ogni soggetto occorre 1 contenitore di plastica da utilizzare per la raccolta delle urine delle 24 ore delle quali dovrà essere misurato il volume (diuresi). Il partecipante dovrà raccogliere tutte le urine escrete durante le 24 h (dalle ore 8 della mattina alle ore 8 della mattina del giorno successivo) in un contenitore graduato (con scala graduata non superiore a 100 ml) di idonea capacità (2 L) protetto dalla luce con carta stagnola e conservato chiuso in luogo fresco. La raccolta dovrà essere consegnata al personale sanitario che provvederà dopo accurata agitazione a prelevarne un aliquota per l analisi (circa 100 ml in un contenitore in plastica per urinocultura). Il contenitore usato per il trasferimento dovrà essere protetto dalla luce tramite accurata e totale copertura con carta stagnola. Il campione dovrà essere identificato (ID) e dovranno essere annotate la diuresi e la data di inizio e fine raccolta. Il campione dovrà infine essere congelato a 18 C. Entrambi i contenitori dovranno essere preventivamente decontaminato tramite lavaggio con una soluzione di ac.nitrico al 5% e successivamente con acqua demineralizzata (il trattamento sarà eseguito dal Laboratorio di Area Vasta nel mese di Agosto). Per ciascun soggetto i campioni, dopo opportuna identificazione (ID = sigla alfa-numerica da concordare che deve comparire anche sul relativo questionario ad hoc), devono essere congelati a -18 C, e tenuti raggruppati in congelatore in modo ben identificato e separato da altri tipi campioni. I campioni tutti insieme saranno trasferiti, dopo accordo con il Laboratorio di Area Vasta, a cura del U.F. di Igiene e Sanità Pubblica con opportune procedure (contenitore termico in polistirolo con ghiaccio secco) al fine di non deteriorare campioni e scongelarli nel trasporto. Questionario Al momento della raccolta campioni il personale sanitario opportunamente addestrato ha fornito ai partecipanti il questionario predisposto ad hoc per valutare alcuni fattori che possono avere un influenza sull esposizione e sui risultati dello studio quali: caratteristiche personali del soggetto, attività professionale o extra-professionale, farmaci, presenza di otturazioni dentarie con amalgama, frequenza e modalità di esposizione a fumo passivo, e ad emissioni da traffico. ANALISI DI LABORATORIO DEI CAMPIONI BIOLOGICI Le analisi dei campioni raccolti sono state effettuate in maniera che l analista non fosse a conoscenza del nome del soggetto donatore delle urine. Gli analisti hanno condotto le analisi chimiche con il maggior livello possibile di precisione ed accuratezza osservando tutte le procedure operative. La validità del metodo analitico è stata assicurata da controlli di qualità interni 9

10 ed esterni. L accuratezza dei risultati è stata determinata con standard e materiali di riferimento. In tabella 1.2 sono riportati: gli analiti e i metodi utilizzati. Tabella 1.2 Matrici, analiti e metodi di riferimento Matrice biologica Analita Metodo Riferimento Antimonio ICP-MS Metodo interno Argento ICP-MS Metodo interno Cadmio ICP-MS Metodo interno Cobalto ICP-MS Metodo interno Cromo ICP-MS Metodo interno Urine 24 ore Nichel ICP-MS Metodo interno Platino ICP-MS Metodo interno Mercurio AAS FIMS Metodo interno accreditato SINAL Spettro Porfirine HPLC con rivelatore spettrofluorimetrico Metodo interno Legenda: AAS FIMS (Atomic Absorption Spectroscopy Flow Injection Mercury System) = spettroscopia di assorbimento atomico con tecnica dei vapori freddi; ICP-MS (Inductively coupled plasma-mass spectrometry) = spettrometria di massa con sorgente a plasma induttivo; HPLC (High-performance liquid chromatography) = cromatografia liquida ad alte prestazioni Sono stati considerati con profilo porfirinico alterato, cioè "non normali" quei patterns che presentano concentrazioni di porfirine totali > 300 nmoli/24 h, oppure, nel rispetto del precedente parametro, concentrazioni di uroporfirina > 25% con concentrazioni di coproporfirina < 60%. I soggetti con profilo porfirinico alterato sono stati sottoposti ad analisi di alcuni parametri ematochimici: emocromo con formula, parametri di funzionalità epatica e renale; e analoga verifica è stata effettuata su un campione casuale di soggetti con profilo non alterato sia della popolazione in studio che in quella di riferimento. ANALISI STATISTICA Per ciascun analita è stata effettuata una descrittiva in termini di: numerosità campionata, numero di valori outliers, numerosità dopo l esclusione degli outliers, numero di valori inferiori al LoQ (limite di quantificazione), numerosità di analisi. Quest ultima è pari a: la numerosità dopo l esclusione degli outliers, se i valori <LoQ non superano il 50% la numerosità dei soli valori >LoQ, se la percentuale sia superiore al 50%. I valori al disotto del LOQ sono stati sostituiti con il corrispettivo valore di LOQ/2 prima del calcolo delle medie. Gli outliers per ciascun analita sono stati individuati con il test di Grubbs (applicato al logaritmo di tali valori). Per ciascun analita sono stati inoltre considerati i seguenti parametri riportati inoltre: il range dei valori (minimo massimo), i percentili della distribuzione (P5, P25, P50, P75, P95), la deviazione standard, la media geometrica (GM), e gli intervalli di confidenza (IC) della media geometrica e del 50-esimo percentile, che corrisponde alla mediana della distribuzione. Per ciascun analista è stata I valori osservati per ciascuna soggetto, dopo essere stati moltiplicati per 1000, sono stati trasformati in logaritmi, al fine di ottenere una normalizzazione dei valori. Dopodichè,per ciascun analita è stato effettuato il test di Gauss (skeweness and kurtosis test of normality) per verificare la normalità della distribuzione dell intero campione. In caso di rifiuto dell ipotesi di distribuzione normale, la conferma è stata ottenuta effettuando altri due altri test per la normalità, Shapiro-Wilk W e Shapiro-Francia W. Per effettuare il confronto fra le 2 zone si è valutata la natura della distribuzione e il confronto è stato effettuato con i dati tal quali nel caso di normalità o sui logaritmi nel caso di distribuzioni lognormali tramite test t di Student. Il software STATA sarà utilizzato per l analisi statistica. I test parametrici applicati sono i seguenti: 10

11 T-Student per campioni provenienti da popolazioni con distribuzioni normali e varianza incognita. Il test confronta infatti la media aritmetica di due sottocampioni nell ipotesi nulla (H0) che la media nei due sottocampioni sia uguale ANOVA per campioni provenienti da popolazioni con distribuzione normale e omogeneità delle varianze: confronta le medie aritmetiche di più di due sottocampioni. I test non parametrici applicati sono i seguenti: Mann-Whitney (somma dei ranghi) verifica l ipotesi che due campioni indipendenti provengano da popolazioni con la stessa distribuzione. Kruskal-Wallis verifica l ipotesi che più campioni provengono dalla stessa popolazione. Per tutti i test si rifiuta l ipotesi nulla H0 se il p-value è inferiore a Per le porfirine è stata effettuata una valutazione della distribuzione per area geografica in relazione alla percentuale di porfirine quali-quantitativamente alterate o normali. Le percentuali rilevate per area geografica sono state confrontate con il test Chi-Quadro. Sono stati anche calcolati gli indici di Correlazione di Pearson (parametrico) e di Spearman (non parametrico) tra la classificazione dei valori di porfirina (normale- non normale) e i metalli urinari. Sono stati infine confrontati i valori di porfirine urinarie rilevate rilevati nei soggetti che hanno partecipato ad entrambe le rilevazioni, quella pilota e quella qui presentata. Le variabili raccolte tramite questionario, in particolare età, consumo di alcol, BMI, esposizione a fumo passivo, durata della residenza sono state valutate per alcune stratificazioni. Per il cadmio è stato riportato anche una descrittiva escludendo gli ex-fumatori (da almeno 5 anni). Per l argento e il cromo è stata effettuata anche la descrittiva dei soli valori inferiori a LoQ, in tabella), in quanto superavano il 50% dei valori nel campione di Badia Prataglia (rispettivamente 60% per l argento e 52.7% per il cromo). Le descrittive dell antimonio e del platino sono invece per i soli valori <LoQ in quanto tutti e tre i campioni hanno oltre il 60% dei valori <LoQ. Le residenze dei soggetti residenti a Civitella che hanno conferito le urine e i cui risultati di laboratorio sono stati considerati nell analisi statistica sono state georeferenziate. Ad ogni residenza è stata attribuito il valore dei dispersione o deposizione al suolo degli inquinanti utilizzati nel modello diffusionale messo a punto dall Università di Siena nel In particolare sono stati utilizzati i dati di dispersione relativi agli scenari ALL (predisposti utilizzando i dati delle aziende Chimet, Pavimental, Del Tongo, AISA e Società autostrade) per il PM10 e il Cadmio. Sono stati considerati solo quei metaboliti urinari per i quali sono evidenziate differenze significative tra i valori rilevati a Civitella rispetto a quelli delle altre aree. Per il pool dei soggetti ricadenti in ciascuna isoarea di inquinamento è stato calcolato il valor medio e mediano della concentrazione dei metaboliti urinari ed è stata quindi valutata la distribuzione di tali valori nelle varie aree di isoinquinamento così come definite dal modello diffusionale. TEMPISTICA La tempistica prevista per lo sviluppo e la conduzione dello studio era la seguente: Entro Luglio 2010 messa a punto dei documenti, i questionari, i moduli e la lettera d informazione e approvazione da parte del Comitato Etico (CE) della ASL 8. Entro ottobre 2010 predisposizione dei contenitori per la raccolta delle urine forniti dal Dipartimento della Prevenzione di Arezzo da parte del Laboratorio di analisi. Entro novembre 2010 contatto con i medici di famiglia dei Comuni oggetto dell'indagine Nel gennaio 2011 ai soggetti selezionati dai medici di famiglia invio della lettera informativa sullo scopo dello studio, con la richiesta di partecipazione e la dichiarazione di consenso informato e successo contatto con coloro che aderiscono per fornirgli la caraffa, il contenitore per la raccolta delle urine ed il questionario e per istruirli sulle modalità di restituzione del campione. Dal Gennaio al marzo 2011 raccolta dei campioni Marzo 2011 Luglio analisi dei campioni da parte del Laboratorio di analisi, archiviazione dei risultati, prime impressioni sui risultati Luglio 2011 analisi statistica dei dati e primo draft del documento finale dello studio di valutazione dell esposizione attuale. Ottobre 2011 Stesura del documento finale e diffusione dei dati. In realtà si è osservato un allungamento dei tempi: 11

12 - il CE ha approvato il protocollo in data 2 agosto si è avuto un allungamento dei tempi di raccolta dei campioni per ottenere una numerosità adeguata secondo quanto previsto dal protocollo. Tale fase si è conclusa nell aprile 2012 anziché nel marzo 2011 e comunque successivamente sono stati richieste analisi di controllo per quei soggetti che avevano conferito una quantità di urine delle 24 ore inferiore a 1 litro. Tale fase di controllo si è conclusa a dicembre 2012; - le fasi successive di lavorazione sono state pertanto posticipate e non hanno più potuto seguire le durate previste sovrapponendosi ad altri impegni delle Strutture coinvolte; - è stato deciso infine di sottoporre il documento finale prodotto da Gruppo di lavoro alla valutazione di un Comitato Scientifico prima di poter procedere alla diffusione dei dati. ASPETTI RELATIVI ALLA RISERVATEZZA DEI DATI Il protocollo dello studio è stato sottoposto all approvazione del Comitato di Bioetica della AUSL 8 di Arezzo, che lo ha approvato in data 2 agosto 2010 (Provvedimento D.A.n.1068 del ). I dati raccolti sono da considerare dati sensibili ai fini dell applicazione della normativa sulla riservatezza. (Legge 31 dicembre 1996 N. 675 e successivi regolamenti applicativi). E stato pertanto richiesto il consenso informato dei partecipanti, che sono stati preventivamente informati circa gli obiettivi e le modalità di effettuazione dello studio, e potevano ritirare in qualsiasi momento la loro disponibilità alla collaborazione. Tutte le informazioni individuali ottenute tramite i questionari e dall analisi dei campioni biologici, sono state considerate confidenziali e trattate quindi con la massima riservatezza. Tutti i campioni raccolti sono stati analizzati individualmente dal Laboratorio di Sanità Pubblica Area Vasta Toscana Sud Est localizzato a Siena con metodiche analitiche validate ed affidabili e con stretto controllo di qualità. I campioni dello studio sono stati utilizzati solo per gli scopi descritti e per le eventuali conferme e riprove dei risultati analitici, ed è previsto che vengano conservati solo per un anno dopo la conclusione dello studio. Le fasi organizzative dello studio sono state condotte con la massima pubblicità e cercando il coinvolgimento e il preventivo assenso di tutte le comunità di cittadini coinvolti. I risultati delle elaborazioni è previsto che siano divulgati solo in forma aggregata, collettiva e anonima, e comunque tale da non consentire l identificazione del partecipante. 12

13 1.3. Risultati NUMEROSITA CAMPIONATA Il campione è composto da 371 soggetti che hanno conferito le urine delle 24 ore e risposto al questionario (37 soggetti residenti a Civitella hanno anche fornito il capello). Di questi ne sono stati esclusi 68 per i seguenti motivi: 1 soggetto aveva conferito solo le urine spot 3 soggetti non risultavano avere le analisi delle urine (né spot né 24h), ma solo il questionario (nessuno di questi ha effettuato l analisi del capello) 1 soggetto aveva partecipato due volte al monitoraggio (analisi urine 24h + questionario) e sono stati considerati solo i risultati di laboratorio del secondo campione in quanto vi era una maggiore quantità di urine 24h (inoltre con quest ultima il soggetto ha conferito anche il capello) 7 soggetti perché non presentavano i criteri di selezione: a) 1 soggetto aveva valori delle porfirine alterati sia in quantità nmoli sia in eccesso URO b) 1 soggetto aveva dichiarato nel questionario di essere fumatore c) 2 soggetti erano affetti da epatite cronica d) 1 soggetto era portatore sano di epatite virale e) 1 soggetto era portatore trait talassemico f) 1 soggetto aveva il trait talassemico per 56 soggetti la quantità urine era inferiore ad 1 litro e ciò è stato considerato indicatore di mancato conferimento delle urine delle 24 ore Dopo le suddette esclusioni la numerosità dei soggetti campionati è di 303. La tabella 1.3 mostra la numerosità del campione ripartita per zona di residenza, prima e dopo le esclusioni. E riportata anche la percentuale dei soggetti rimasti sul totale iniziale. Tab. 1.3 Distribuzione dei soggetti campionati per località, prima e dopo le esclusioni: numetro assoluto e percentuali di riga. LOCALITA' N. iniziale partecipanti N. finale partecipanti N. % sugli iniziali Civitella Arezzo Casentino Totale CARATTERISTICHE DEL CAMPIONE Sesso Il campione complessivo analizzato è equilibrato per sesso(tabella 2.2): 50.8% femmine vs 49.2% maschi, mentre all interno dei sottocampioni si registra una prevalenza di femmine a Arezzo (63.2%), e di maschi nelle altre due località (rispettivamente 54.9% Civitella e 54.5% Casentino). Le differenze tra i 3 gruppi risultano significative secondo il test Chi-Quadro (p=0.015). Se confrontiamo i campioni a coppia (sempre utilizzando il test Chi-Quadro), risulta significativa la differenza tra Arezzo e le altre due località: rispettivamente vs Casentino (p=0.035), e vs Civitella (p=0.006). Tab Distribuzione dei soggetti campionati per località e sesso: numero e percentuali di colonna. LOCALITA' SESSO Civitella Arezzo Casentino Tot. Freq. % Freq. % Freq. % Freq. % Femmine 69 45, , , ,8 Maschi 84 54, , , ,2 Totale , , , ,0 13

14 Età In tabella 1.5 è riportata l età media (al momento della consegna delle urine) di ciascun partecipante e il range di età (min-max). Per questa variabile sono disponibili i valori di 300 soggetti: 152 di Civitella, 94 di Arezzo e 54 di Casentino. Tab. 1.5 Età media per località e range (min-max) LOCALITA' Età media Range età Civitella 42, Arezzo 45, Casentino 46, Tot. 44, Nel complesso l età media è di circa 44 anni con range da 18 a 63 anni. Nelle specifiche località, i residenti (campionati) di Civitella hanno un età media più bassa (42.6 anni medi) rispetto a quelli di Arezzo e Casentino. Le differenze tra le età medie delle località risultano non significative ad eccezione che per Civitella-Arezzo p= (Test T-Student effettuato per ciascuna coppia di campioni). La tabella 1.6 mostra la distribuzione per età suddivisa in due classi sopra e sotto i 40 anni: le differenze per l età divisa in classi non risultano significative al test Chi-Quadro. Tab. 1.6 Distribuzione per classe di età e località di residenza:numero dei soggetti e percentuali di colonna. LOCALITA' CLASSE DI ETA' Civitella Arezzo Casentino Tot. N. % N. % N. % N. % <= 40 anni 54 35, , , ,7 > 40 anni 99 64, , , ,3 Tot , , , ,0 BMI (Body mass index) L'indice di massa corporea si calcola come il rapporto tra la massa, espressa in chilogrammi, e il quadrato dell'altezza, espressa in metri. Se risulta tra e indica normopeso, se inferiore a sottopeso, se superiore a indica sovrappeso, e se superiore a 29,99 francamente obeso. In media il campione complessivo registra un BMI pari a 24.6 quindi normopeso (tabella 1.7). L unica differenza significativa che si riscontra (con il test Mann-Whitney che confronta i campioni due a due) è tra Civitella e Arezzo (P=0.0462, al limite). La numerosità sulla quale è stato calcolato l indice è pari a 289 soggetti: 144 Civitella 93 Arezzo 52 Casentino, poiché per alcuni soggetti non è stato indicato il perso e/o l altezza. Tab BMI medio per località e range (min-max) LOCALITA' BMI medio Range BMI Civitella 25, Arezzo 23, Casentino 24, Tot. 24,

15 GLI ANALITI Metodologia di analisi statistica e risultati di laboratorio Di seguito si riportano i risultati delle analisi descrittive effettuate sui valori in µg/urine 24h (Tab. 1.8) e µg/urine litro (Tab. 1.9) per i seguenti analiti: Hg, Cd, Ag, Cr, Co, Sb, Pt, Ni. Le analisi sono state effettuate per ciascun campione: Civitella, Arezzo e Casentino, di cui l ultimo è il confronto. I valori in tabella sono moltiplicati per 1000, al fine di avere numeri più raffigurabili (si eliminano decimali). Per ciascun analita è riportata la descrizione in termini di: numerosità campionata, numero di valori outliers, numerosità dopo l esclusione degli outliers, numero di valori inferiori al LoQ (limite di quantificazione), numerosità di analisi. Per ciascun analita sono riportati inoltre: il range dei valori (minimo massimo), i percentili della distribuzione (5, 25, 50, 75, 95), la deviazione standard, la media geometrica. Per quest ultima e per il 50-esimo percentile, che corrisponde alla mediana della distribuzione, è riportato anche l intervallo di confidenza (IC al 95%). Per il cadmio è stato riportato anche una descrittiva escludendo gli ex-fumatori (da almeno 5 anni), e in tabella come nel prosieguo del rapporto è indicato come Cd*. Per l argento e il cromo si è riportato anche la descrittiva dei soli valori inferiori a LoQ e tali descrittive sono riferite come Ag* e Cr*. L antimonio e il platino sono descritti per i soli valori <LoQ in quanto tutti e tre i campioni hanno oltre il 60% dei valori <LoQ ele elaborazioni sono riferite come Sb* e Pt*. I valori osservati per ciascuna soggetto (già moltiplicati per 1000) sono stati trasformati in logaritmi, al fine di ottenere una normalizzazione dei valori. Dopodichè,per ciascun analita è stato effettuato il test di Gauss (skeweness and kurtosis test of normality) per verificare la normalità della distribuzione dell intero campione (CIVITELLA+ARE+Casentino). Il test risulta significativo per il mercurio, il cadmio, l argento e il cromo, quindi c è evidenza per rifiutare l ipotesi di distribuzione Normale per i suddetti analiti. A conferma di ciò sono stati effettuati altri due altri test per la normalità, Shapiro-Wilk W e Shapiro- Francia W, i cui risultati portano a rifiutare l ipotesi che la distribuzione sia normale. Dunque per questi analiti è necessario effettuare anche test non parametrici per il confronto delle distribuzioni tra i 3 sottocampioni analizzati. In Tab è riportata la significatività (p-value) dei test parametrici applicati a tutti gli analiti e i test non parametrici applicati ai soli analiti la cui distribuzione campionaria non risulta distribuita normalmente. Successivamente vengono riportati i risultati per singolo analita esaminato. I risultati nelle figure sono indicati con A se relativi a Civitella, con B se relativi ad Arezzo e con C se relativi a Casentino. Nei boxplot, le linee inserite all interno dei box indicano il valore mediano, le estremità dei box i quartili, le estremità dei baffi indicano il valore più basso e quello più alto, ed i punti gli ouliers. 15

16 Tab Descrittive per analita dei risultati in µg/24h *1000 CIVITELLA AREZZO Casentino Hg Cd Cd* Ag Ag* Cr Cr* Co Sb* Pt* Ni µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h µg/24h N outliers N senza outliers n<loq (% su N) 2 (1.32%) 3 (1.97%) 3 (2.33%) 59 (38.56%) 59 (38.56%) 61 (40.13%) 61 (40.13%) (68.00%) 98 (64,47%) - N (analisi) Range P05 0,52 0,15 0,14 0,03 0,08 0,03 0,08 0,2 0,07 0,01 2,22 P25 0,91 0,28 0,28 0,05 0,11 0,05 0,12 0,44 0,08 0,02 3,89 P50 (IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) P75 1,95 0,53 0,52 0,2 0,29 0,22 0,31 1,14 0,18 0,03 9,29 P95 3,01 1,19 1,13 0,46 0,59 0,93 1,08 1,91 0,26 0,04 17,27 Dev.St. 1,07 0,4 0,33 0,16 0,17 0,36 0,43 0,61 0,07 0,01 4,55 M.Geom.(IC) , (5.47 ( ) ( ) ( ) (0,09-0,12) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ) N outliers N senza outliers n<loq (% su N) 2 (2.11%) 10 (10.53%) 3 (4.11%) 37 (38.95%) 37 (38.95%) 40 (42.11%) 40 (42.11%) - 72 (75.79%) 62 (65.26%) - N (analisi) Range ,68 P05 0,4 0,05 0,07 0,03 0,07 0,03 0,07 0,22 0,06 0,01 2,04 P25 0,98 0,16 0,21 0,05 0,11 0,05 0,11 0,34 0,07 0,02 3,69 P50 (IC) (5.34 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ) P75 2,03 0,45 0,47 0,19 0,25 0,21 0,32 1,11 0,12 0,04 18 P95 4,14 0,71 0,76 0,33 0,64 0,52 0,73 2,94 0,18 0,08 39,14 Dev.St. 1,12 0,22 0,22 0,2 0,23 0,27 0,32 0,88 0,03 0,02 10,98 M.Geom.(IC) (6.47 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ) N outliers N senza outliers n<loq (% su N) 4 (7.41%) 1 (1.82%) 1 (2.38%) 33 (60.00%) 33 (60.00%) 29 (52.73%) 29 (52.73%) - 47 (85.45%) 33 (60.00%) - N (analisi) Range P05 0,29 0,08 0,08 0,03 0,06 0,03 0,07 0,28 0,06 0,01 1,37 P25 0,56 0,23 0,22 0,05 0,09 0,05 0,13 0,39 0,07 0,02 3, P50 (IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) P75 1,4 0,53 0,39 0,11 0,14 0,18 0,29 0,88 0,22 0,03 7,08 P95 2,43 0,92 0,64 0,16 0,23 0,44 1,5 2 0,35 0,05 12,78 Dev.St. 0,6 0,23 0,2 0,04 0,04 0,28 0,38 0,6 0,1 0,01 3, M.Geom.(IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 16

17 Tab Descrittive per analita dei risultati in µg/l *1000 CIVITELLA AREZZO Casentino Hg Cd Cd* Ag Ag* Cr Cr* Co Sb* Pt* Ni µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l N iniziale outliers N senza outliers LoQ/2 0,105 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025-0,025 0,005 0,025 n<loq (% su N) 2 (1.32%) 3 (1.96%) 3 (2.31%) 59 (38.56%) 59 (38.56%) 61 (40.13%) 61 (40.13%) (68.00%) 98 (64.47%) - N (analisi) Range P05 0,3 0,09 0,08 0,025 0,06 0,025 0,06 0,11 0,05 0,01 1,1 P25 0,58 0,17 0,17 0,025 0,07 0,025 0,08 0,26 0,06 0,011 2,47 P50 (IC) 0.84 ( ) 0.25 ( ) 0.24 ( ) 0.07 ( ) 0.12 ( ) 0.07 ( ) 0.13 ( ) 0.45 ( ) 0.07 ( ) ( ) 3.99 ( ) P75 1,22 0,38 0,37 0,13 0,17 0,15 0,23 0,76 0,09 0,017 6,26 P95 2,11 0,98 0,84 0,31 0,33 0,6 0,69 1,46 0,23 0,023 10,87 Dev.St. 0,65 0,4 0,37 0,12 0,13 0,21 0,25 0,45 0,05 0,004 3, (3.44 M.Geom.(IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ) N outliers N senza outliers LoQ/2 0,105 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025-0,025 0,005 0,025 n<loq (% su N) 2 (2.11%) 10 (10.53%) 3 (4.11%) 37 (38.95%) 37 (38.95%) 40 (42.11%) 40 (42.11%) - 72 (75.79%) 62 (65.26%) - N (analisi) Range P05 0,23 0,025 0,04 0,025 0,05 0,025 0,05 0,11 0,05 0,01 1,17 P25 0,55 0,09 0,11 0,025 0,07 0,025 0,08 0,19 0,06 0,013 2, P50 (IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) P75 1,25 0,29 0,32 0,11 0,16 0,12 0,16 0,69 0,08 0,02 10,46 P95 2,93 0,54 0,55 0,26 0,35 0,6 0,44 1,53 0 0,04 16,92 Dev.St. 0,78 0,16 0,17 0,11 0,13 0,3 0,15 0,48 0,02 0,01 5, M.Geom.(IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) N outliers N senza outliers LoQ/2 0,105 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025-0,025 0,005 0,025 n<loq (% su N) 5 (9.09%) 1 (1.82%) 1 (2.38%) 33 (60.00%) 33 (60.00%) 29 (52.73%) 29 (52.73%) - 47 (87.04%) 33 (60.00%) - N (analisi) Range P05 0,11 0,06 0,05 0,025 0,05 0,025 0,05 0,1 0,06 0,01 0,54 P25 0,36 0,12 0,11 0,025 0,07 0,025 0,09 0,2 0,06 0,015 1, P50 (IC) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) P75 0,9 0,3 0,26 0,07 0,1 0,12 0,19 0,56 0,11 0,029 5,57 P95 1,23 0,63 0,45 0,14 0,15 0,29 0,69 1,88 0,15 0,04 9,13 Dev.St. 0,39 0,18 0,12 0,04 0,03 0,13 0,16 0,52 0,04 0,009 2,54 M.Geom.(IC) 0.50 ( ) 0.19 ( ) 0.16 ( ) 0.04 ( ) 0.08 ( ) 0.06 ( ) 0.13 ( ) 0.36 ( ) 0.08 ( ) ( ) 2.71 ( ) 17

18 Tab Test statistici effettuati sui valori trasformati in logaritmi (µg/24h *1000) Valori logaritmici degli analiti /urine 24h Numerosità sottocampioni (ESCLUSI gli outliers) CIV ARE BADIA TOT. test Gauss: distribuzi one Normale p-value (TOT) test T-Student (PARAMETRICO 2 compioni) confronto medie p-value (CIV vs ARE) p-value (CIV vs BADIA) p-value (ARE vs BADIA) p-value (CIV,ARE vs BADIA) p-value (ARE,BA DIA)vs CIV) test ANOVA (PARAME TRICO >2 campioni) p-value (CIV- ARE- BADIA) test Mann-Whitney (NON PARAMETRICO 2 campioni indipendenti) p-value (CIV vs ARE) p-value (CIV vs BADIA) p-value (ARE vs BADIA) p-value (CIV,ARE vs BADIA) p-value (ARE,BA DIA)vs CIV) test Kruskal- Wallis (NON PARAMETRI CO >2 campioni) p-value (CIV-ARE- BADIA) A B C A-B A-C B-C AB-C BC-A A-B-C A-B A-C B-C AB-C A-B-C MERCURIO ,0310 0,5114 0,0001 0,0001 0,0000 0,0001 0,4815 0,0002 0,0001 0,0000 0,0002 CADMIO ,0001 0,0000 0,0865 0,0479 0,8964 0,0001 0,0000 0,0002 0,0675 0,1452 0,5819 0,0003 0,0007 CADMIO * ,0003 0,0258 0,0243 0,7593 0,1108 0,0055 0,0205 0,0639 0,0098 0,4262 0,0395 0,0080 0,0200 ARGENTO ,0027 0,8120 0,0019 0,0031 0,0015 0,0062 0,8727 0,0066 0,0111 0,0040 0,0158 ARGENTO* ,0003 0,4981 0,0011 0,0060 0,0015 0,0052 0,4538 0,0022 0,0048 0,0016 0,0056 CROMO ,0001 0,3311 0,1969 0,6173 0,2882 0,3471 0,5169 0,3402 0,7183 0,4367 0,5966 CROMO* ,0000 0,1609 0,4022 0,8127 0,6435 0,3255 0,2249 0,5596 0,7615 0,8009 0,4660 COBALTO ,2331 0,3709 0,3138 0,8640 0,4857 0,5158 ANTIMONIO* ,0624 0,0497 0,9679 0,2117 0,6519 0,1597 PLATINO* ,1140 0,0003 0,0208 0,3150 0,3698 0,0006 NICHEL ,7702 0,0128 0,0107 0,0003 0,0016 0,0002 CIV= Civitella; ARE= Arezzo; BADIA= Casentino 18

19 Mercurio Il test di Grubbs (applicato al logaritmo dei dati moltiplicati per 1000) ha individuato 2 valori outliers che sono stati esclusi, uno a Civitella in eccesso ed uno a Casentino in difetto,. Grafico 1.1 Box plots: distribuzione dei valori osservati (in log) per ciascun campione analizzato. log_mercurio(µcg/24h) A B C Legenda: A= Civitella; B Arezzo centro; C=Casentino I valori<loq sono 8 nel campione generale, di cui 2 a Civitella, 2 a Arezzo e 4 a Casentino. Dalla tabella 1.8 si evince una mediana e una media geometrica più elevate per i campioni di Civitella e Arezzo rispetto a quelle di Casentino, mentre non si osservano differenze tra Civitella e Arezzo. Inoltre, Civitella e Arezzo registrano una variabilità delle unità intorno alla propria media quasi doppia rispetto a quella del Casentino, rispettivamente SD=1.07 (CIVITELLA), 1.12 (ARE) e 0.6 (Casentino). Dal test di normalità risulta esserci evidenza per rifiutare l ipotesi di normalità della distribuzione (pvalue=0.0310) Grafico 1.2 Istogramma: distribuzione di densità del mercurio (logaritmi) Density log_hg_24h Il test non parametrico Kruskal-Wallis risulta significativo, il che evidenzia una differente distribuzione del mercurio tra i tre sottocampioni Il test non parametrico Mann-Whitney, che va più in dettaglio confrontando i campioni a due a due, risulta significativo per tutti gli abbinamenti tranne tra Civitella e Arezzo, che risultano quindi provenienti da popolazioni con la stessa distribuzione In conclusione le differenze tra i campioni sono significative nei confronti con il Casentino, sia per CIVITELLA e ARE prese singolarmente che prese insieme. (Lo stesso esito si sarebbe avuto nell applicazione dei test parametrici). I test effettuati sui valori delle urine mcg/litro confermano i risultati precedenti. 19

20 Argento Il test di Grubbs non ha individuato alcun outlier. Grafico Box plots: distribuzione dei valori osservati (in log) per ciascun campione analizzato log_argento(µcg/24h) A B C Legenda: A= Civitella; B Arezzo centro; C=Casentino I valori<loq sono 129 nel campione generale, di cui 59 a Civitella (38.56% del sottocampione), 37 a Arezzo (38.95%) e 33 nel Casentino(60.00%). Sono significative le differenze tra la % di valori<loq di: CIVITELLA vs Casentino ( Chi-Q=7.54, p=0.0060) ARE vs Casentino ( Chi-Q=6.20, p=0.0128) Dalla tabella 1.8 si evince una mediana e una media geometrica identiche e più elevate per i campioni di Civitella e Arezzo rispetto a quelle del Casentino, mentre non si osservano differenze tra Civitella e Arezzo. La variabilità delle unità intorno alla propria media di Civitella e di Arezzo sono circa 4 volte quella registrata in Casentino. Dal test di normalità risulta esserci evidenza per rifiutare l ipotesi di normalità della distribuzione (pvalue=0.0027) Grafico 1.4 Istogramma: distribuzione di densità dell argento (in log) Density log_ag_24h Il test non parametrico Kruskal-Wallis risulta significativo (p-value=0.0158), il che evidenzia una differente distribuzione dell argento tra i tre sottocampioni Il test non parametrico Mann-Whitney risulta significativo per tutti gli abbinamenti tranne tra Civitella e Arezzo, che risultano quindi provenienti da popolazioni con la stessa distribuzione. In conclusione le differenze tra i campioni sono significative nei confronti con Casentino, sia per CIVITELLA e ARE prese singolarmente che prese insieme (lo stesso esito si sarebbe avuto nell applicazione dei test parametrici). I test effettuati sui valori delle urine mcg/litro confermano i risultati precedenti. 20