RNA. Uracile al posto della Timina RNA MESSAGGERO. Sempre a SINGOLO FILAMENTO

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Geronima Ippolito
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1 DNA 1

2 RNA Uracile al posto della Timina Sempre a SINGOLO FILAMENTO RNA MESSAGGERO Filamento lineare di sequenze nucleotidiche: copia l informazione presente sul DNA e porta il messaggio a livello dei ribosomi

3 RNA RIBOSOMALE componente dei ribosomi: fornisce un meccanismo per decodificare l mrnain amminoacidi 70S Subunità 30S contiene l rrna 16S Subunità 50S contiene l rrna 23S + 5S 3

4 RNA TRANSFER lega e trasferisce un amminoacido specifico ad una catena polipeptidicain crescita a livello dei ribosomi 4

5 La replicazione INTERVENGONO PER LA FORMAZIONE DELLA FORCELLA = DENATURAZIONE SINTETIZZANO I PRIMERS 5

6 Il codice genetico 64 possibili triplette (codoni) Codone AA Codone AA UUU Fenilalanina ACU Treonina UUC Fenilalanina ACC Treonina UCU Serina ACG Treonina UCC Serina ACA Treonina UCG Serina GGU Glicina UCA Serina GGC Glicina CCU Prolina GGG Glicina CCC Prolina GGA Glicina CCG Prolina CAU Istidina CCA Prolina CAC Istidina Alcuni AA sono specificati da più di un codone DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni 6

7 61 codoni = di senso, specificano per i 20 amminoacidi 3 codoni=di stop, sono impiegati come segnale di arresto della traduzione: TAA, TAG, TGA codone di inizio: ATG (GTG TTG), a cui corrisponde un trna che trasporta una N- formil-metionina 7

8 gene Sequenza nucleotidica continua, specificata da un codone di inizio, un certo numero di codoni interni a cui si aggiunge il codone di stop Codifica per un prodotto del fenotipo ORF= OPEN READING FRAME REGIONE CODIFICANTE, MA FENOTIPO SCONOSCIUTO 8

9 La trascrizione 9

10 Il sito promotore Ribosomal Binding Site = RBS GAGG AAGG GGA GGAG AGGA 10

11 La traduzione 11

12 INIZIO ATG GTG TTG CTG STOP TAA TAG TGA Promotore della trascrizione GENE OPERONE Schema di lettura aperto: Open Reading Frame ORF gene proteina 12

13 Operone ribosomale 13

14 Regolazione 14

16 La variabilità genetica Il DNA può cambiare Errori durante la replicazione Mutazioni Trasposizione

17 Mutazioni Cambio casuale ma stabile ed ereditabile Letali Negative Positive mutazioni da transizione= purina/purina pirimidina/pirimidina mutazioni da transversione= purina/pirimidina delezione o inserzione di una base = frame shift= Mutazioni puntiformi L espressione di una mutazione sarà rilevata solo se produce un fenotipo alterato che può essere riconosciuto

20 l ordine dei geni può cambiare? TRASPOSONI segmenti di DNA mobili La lunghezza dei trasposoni noti è compresa tra 750 e coppie di basi e nei batteri ne sono stati trovati di due tipi: SEMPLICI chiamati anche SEQUENZE DI INSERIMENTO O DI INSERZIONE. IR Trasposasi IR lunghezza media sequenze IS: bp lunghezza media IR: bp Sequenze ripetute invertite= IR

21 COMPLESSI altri geni IR IR IR IR sequenza IS sequenza IS trasposone (bp) marcatori genetici Tn Amp Tn Hg Tn Utilizzazione lattosio Tn Kc Tn Cm Tn Tet Tn Enterotossina stabile al calore Meccanismi di trasposizione: Semplice o non replicativa: entrambi i filamenti del DNA originale si spostano insieme da una regione all altra senza replicarsi. Replicativa: coinvolge la replicazione del DNA, una copia del trasposone rimane nel suo sito originario mentre l altra si inserisce in un nuovo locus.

22 Inattivazione del gene bersaglio promotore DNA mrna proteina promotore DNA mrna proteina assente o tronca

23 Attivazione di geni silenti promotore debole DNA gene non trascritto o scarsamente trascritto promotore forte gene altamente trascritto

24 La cellula può proteggersi dalle variazioni? Endodesossiribonucleasi di restrizione = Endonucleasi = ER Eco RI da E. coli 5 G-A-A-T-T-C- -C-T-T-A-A-G-5 = Siti di restrizione Hae III da Haemophilus aegyptius 5 G-G-C-C- -C-C-G-G-5 Hpa II da Haemophilus parainfluenzae 5 C-C-G-G- -G-G-C-C-5 Fanno parte del sistema di MODIFICAZIONE/RESTRIZIONE presente in molte cellule batteriche

25 Come possiamo sfruttare in laboratorio le conoscenze sul DNA? 1 Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche 2 Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica 3 Visualizzazione per via elettroforetica 4 Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA 5 Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma 6 Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate

26 Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche Raccolta e lavaggio delle cellule Risospensione in tampone + saccarosio (6%) Aggiunta di agente litico: lisozima (ph 7-8, 37 C per 30 min) Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20% Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico Centrifugazione e raccolta del surnatante Fase acquosa contenente il DNA Interfase Solvente Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH Scioglimento del DNA in tampone 26

27 Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica Il DNA ha un massimo di assorbimento a 260 nm 1 OD 260nm = 50 µg/ml Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami H e si separano i due filamenti Per l EFFETTO IPERCROMICO delle basi nucleotidiche, all aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD 260nm 27

28 28

29 Visualizzazione per via elettroforetica una molecola carica posta all interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta in un gel costituito da un polimero organico molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel È così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all interno di un supporto solido (gel) e colorandolo opportunamente I REAGENTI DELL ELETTROFORESI: Tampone : crea continuità nella vaschetta AGAROSIO: polimero che costituisce il gel Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gel BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo colora 29

30 LA STRUMENTAZIONE DELL ELETTROFORESI: 1) ALIMENTATORE: crea la differenza di potenziale 2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA: vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico 30

31 IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA frammenti di lunghezza maggiore POLO - frammenti di lunghezza minore ] bande di DNA POLO + VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA ( nm) 31

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