cardiomiocita linfocita

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1 REGOLAZIONE GENICA

2 cardiomiocita adipocita linfocita neurone

3 Cellula indifferenziata / pluripotente Cellule differenziate / specializzate? RIPROGRAMMAZIONE

4 John Gurdon, 1962

5 Shinya Yamanaka, 2006

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7 Controllo dell espressione dei geni I diversi tipi cellulari di un organismo contengono lo stesso DNA. Ciascuna cellula ha la potenzialita di esprimere qualsiasi gene Espressione genica e selettiva e altamente regolata Una cellula puo cambiare l espressione dei suoi geni in risposta a segnali interni e esterni Esistono diversi livelli di controllo nella via DNA à RNA à proteine

8 Trascrittoma L insieme dei geni espressi in una particolare cellula. Il trascrittoma determina l identita della cellula e la sua capacita di rispondere a segnali extracellulari (proliferare, differenziare, morire)

9 FPKM (livello di espressione) Espressione genica nella linea cellulare P19Cl6 Geni Liv. estremi: (Mier2) 4890 (Rplp1), range dinamico 1.6x10 6

10 Quali geni trascrivere e quando? Geni espressi in tutte le cellule (housekeeping genes) Molti geni sono regolati spazialmente (tessuto-specifici) e/o temporalmente

11 Livelli di controllo dell espressione genica

12 Regolazione della trascrizione Procarioti Eucarioti

13 La regolazione dei geni George Beadle e Edward Tatum 1941; i geni codificano per enzimi coinvolti nei processi metabolici; 1 gene à 1 enzima à 1 step Francois Jacob e Jacque Monod 1959: il concetto di geni regolatori che codificano per proteine che regolano altri geni Monod: perchè l enzima b-galattosidasi è prodotto in cellule batteriche solo quando I batteri ne hanno bisogno?

14 Il modello dell operone di Jacob e Monod: regolazione da controllo negativo Il repressore si lega anche ad un induttore (metabolita) che fa abbassare l affinita del repressore per l operatore à geni A e B espressi

15 Meccanismi di attivazione Attivazione per reclutamento della RNA pol II: operone trp; operone lac Attivazione allosterica: Attivatore NtrC, che controlla a distanza l espressione di geni coinvolti nel metabolismo dell azoto

16 Meccanismo: attivazione per mezzo del reclutamento della RNA polimerasi Molti promotori sono regolati da attivatori che favoriscono il legame della RNA polimerasi e/o da repressori che bloccano tale legame

17 1) l operone trp di E. coli Operone: Gruppo di geni che sono trascritti insieme da un singolo promotore sito di legame del repressore di triptofano L operone trp e regolato dalla presenza dell amminoacido triptofano nel mezzo

18 triptofano assente triptofano presente

19 Repressore trp inattivo Repressore trp attivo a-eliche di riconoscimento L attacco di 2 mol di trp al repressore cambia la conformazione della proteina che la rende capace di legarsi al DNA (operatore)

20 Legame al DNA di una proteina regolatrice batterica con il dominio elica-giro-elica l elica di riconoscimento sito di legame Regolatore batterico tipico -lega come omodimero ad una sequenza ripetuta e invertita -ogni monomero lega un emi sito -il legame e mediato da un dominio elica-giro-elica

21 2) l operone lac di E. coli Il promotore lac dirige la trascrizione dei gene lac in un unico mrna policistronico che comprende piu di un gene. L mrna viene tradotto in 3 proteine diverse coinvolte nel metabolismo di glucosio L espressione dei geni lac e regolato da un attivatore e un repressore (duplice controllo)

22 sito di legame dell attivatore CAP (Catabolite Activator Protein) sito di legame del repressore Lac due subunita del repressore Lac si legano all operatore (allolattosio inibisce la capacità del repressore di legare il DNA)

23 RNA polimerasi II dimeri di CAP actd Il regolatore CAP ha domini distinti per l attivazione della RNA pol. e il legame al DNA Complesso CAP-aCTD-DNA

24 Attivatore CAP (CRP, cyclic AMP Receptor Protein) camp e sintetizzata da ATP dall enzima adenilico ciclasi camp e una piccola molecola importante per la trasduzione di segnali intracellulari Nei batteri, i livelli di camp sono regolati dai nutrienti nel mezzo di coltura ( glucosio -- camp) camp (ligando)

25 I geni La fonte di energia preferite da E.coli e glucosio. Nell assenza di glucosio il batterio puo usare lattosio lacy codifica per la permeasi del lattosio che trasporta il lattosio nella cellula lacz codifica per l enzima b-galattosidasi che scinde il lattosio in galattosio e glucosio laca codifica per una transacetilasi che libera la cellula di alcuni prodotti metabolici tossici (tiogalattosidi)

26 Il duplice controllo dell operone lac Integrazione di due segnali metabolici, lacy, laca Proteine regolative: L attivatore CAP lega il DNA e attiva la trascrizione dei geni lac solo in assenza di glucosio Il repressore Lac lega il DNA e reprime la trascrizione dei geni lac solo in assenza del lattosio

27 CAP/cAMP Lattosio (rep inattivo) AND Attivazione Trascrizionale

28 Meccanismi di attivazione Attivazione per reclutamento della RNA pol II: operone trp; operone lac Attivazione allosterica: Attivatore NtrC, che controlla a distanza l espressione di geni coinvolti nel metabolismo dell azoto

29 Attivazione allosterica: regola passaggi successivi al legame della RNA polimerasi complesso RNA pol/dna chiuso complesso aperto Gli attivatori che funzionano allostericamente inducono un cambiamento conformazionale o nella RNA pol. o nel DNA

30 Attivazione allosterica mediata dall attivatore NtrC Azoto basso NtrC P NtrC NtrB (chinasi) NtrC ha domini distinti per il legame al DNA e l attivazione della RNA pol. e lega il DNA solo in presenza di uno specifico segnale metabolico (bassi livelli di azoto) +ATP RNA polimerasi nel complesso aperto La fosforilazione di NtrC espone il dominio di legame al DNA che permette di legarsi al DNA ~150 bp a monte del promotore

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32 Regolazione della trascrizione Procarioti Eucarioti

33 Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Lega fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; lega proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA 10% dei circa 30,000 geni umani codifica proteine regolatrici

34 I fattori generali di trascrizione assemblaggio sequenziale di FGT che porta la RNA pol al promotore à complesso di pre-inizio complesso di pre-inizio TFIIH induce il passaggio dal complesso chiuso al complesso aperto à promoter escape à fase di allungamento e rilascio dei FGT

35 Elementi genetici: - Promotore/Fattori Generali di Trascrizione - sequenze regolatrici (enhancers, suppressors)/proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) Enhancer: una regione del DNA che contiene siti di legame per una o piu proteine regolatrici Non ha ne posizione ne orientamento specifico rispetto al gene che regola Puo regolare la trascrizione in modo tessuto-specifico. L enhancer e presente in tutte le cellule ma se la proteina regolatrice e solo presente nel fegato à il gene che viene regolato sara trascritto solo nel fegato.

36 Suppressor: regione del DNA che contiene siti di legame per proteine regolatrici che sopprimono la trascrizione. PUO COINCIDERE CON UN UNHANCER competizione attivatore repressore mascheramento Interazione con FGT

37 Elementi genetici: - enhancers/suppressors; proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) aiutano i FGT e la RNA pol. ad iniziare e/o sostenere la trascrizione La RNA polimerasi oloenzima può essere reclutata al promotore da proteine attivatrici

38 Le proteine regolatrici eucariotiche possono legare a siti di DNA a monte o/e a valle del promotore I promotori dei geni eucariotici possono essere regolati a distanza e da sequenze regolatrici multiple

39 ISOLATORE CTCF

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41 In che modo le proteine regolatrici riconoscono il sito di legame sul DNA?

42 Le proteine regolatrici riconoscono sequenze specifiche nella doppia elica intatta

43 Il bordo di ciascuna coppia di basi presenta uno schema caratteristico di donatori e accettori di idrogeno e di zone idrofobiche riconoscibili dalle proteine regolatrici Potenziali Don. Legami H Potenziali Acc. Legami H Regioni idrofobiche (CH 3 ) Atomo di idrogeno Le quattro possibili configurazioni di coppie di basi

44 Il codice di riconoscimento sul DNA

45 Interazioni proteina-dna nella scanalatura maggiore

46 Le proteine regolatrici degli eucarioti usano diversi domini per il legame al DNA

47 I tipi di domini che legano il DNA sono di numero limitato Elica-giro-elica Omeodominio Dita di zinco Cerniera di leucine Elica-ansa-elica T-box I domini generalmente usano a eliche o foglietti b per legarsi alla scanalatura maggiore

48 elica N-terminale (elica C-terminale) Elica-giro-elica Il piu semplice e piu comune motivo, presente nei batteri (fattore s, repressore Trp, attivatore CAP) e negli eucarioti

49 elica di riconoscimento Omeodominio (variante di elica-giro-elica)

50 sequenza amminoacidica a-elica (12-25) Foglietto b antiparallelo (1-10) proteina con 3 dita di zinco, le a-eliche legano il DNA in solchi maggiori adiacenti aumentendo la forza e la specifita delle interazioni DNAproteina atomi di zinco Dita di zinco (zinc finger)

51 Cerniera di leucine (leucine zipper) a eliche a omodimero

52 Fascio di 4 a eliche che legano il DNA come omo- o eterodimero Elica-ansa-elica (helix-loop-helix) Eterodimerizzazione: esempio di controllo combinatoriale, in cui proteine diverse regolano un processo cellulare. Uno dei meccanismi usati dalle cellule eucariotiche per regolare l espressione genica

53 Le proteine regolatrici sono modulari

54 Sequenza di legame 5 3 FT 3 5 Frammentazione Immunoprecipitazione Ab Sequenziamento del DNA

55 Le proteine regolatrici si legano a sequenza specifiche del DNA BINDING MOTIF

56 Mappatura dei siti di legame sul genoma e identificazione dei geni regolati

57 Circuiti genici modelli di regolazione complessa Vegfr2 Vegfr3 Tbx20 Fgf8 Isl1 Gata4 Cyp26 Nkx2.5 Wnt5a Foxh1 Shh Mef2c Wnt RA signaling Gbx2 Pax9 Fgf8 Myst3 Foxc1/2 Tbx1 Chd7 Fgf10 Hes1 Smad7 p21 SRF BMP-Smad1 Congenital Heart Disease genes

58 Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Lega fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; lega proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA

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60 Regolazione della chromatina I nucleosomi controllano l accessibilita del DNA alle proteine regolatrici e trascrizionali Riorganizzazione dei nucleosomi struttura cromatinica aperta : attivazione trascrizionale; struttura chiusa : repressione trascrizionale. Lo stato cromatinico e regolato da due classi di fattori: modificatori degli istoni complessi di rimodellamento della cromatina (CRC)

61 Stato cromatinico di base Mod. istoni Rimodellamento fattore di trascriz. (FT) specifico pioniere interagisce con DNA Modifica stato cromatinico Reclutamento di altri FT RNA Pol. II, Trascrizione

62 L organizzazione strutturale degli istoni del core regione variabile regione conservata a-eliche

63 Istone-acetiltransferasi (HAT) Coattivatori nucleari, formano complessi multiproteici. Esistono 5 diverse famiglie di proteine HAT. Interagiscono con fattori di trascrizione, i quali reclutano le HAT su siti specifici. In qualche caso, un dominio HAT è parte di un fattore di trascrizione. Acetilazione istonica riduce affinità istoni-dna e rappresenta un punto di interazione con altri fattori di trascrizione.

64 Modificazione covalenti delle code N-terminali

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66 Lo stato di acetilazione degli istoni è reversibile Acetilazione HAT HDAC De-acetilazione

67 Istone-deacetilasi (HDAC) HDAC, catalizzano la deacetilazione degli istoni à reprimono la trascrizione Formano complessi multiproteici (Sir2, NuRD, Sin3), comprendenti i complessi di rimodellamento della cromatina; NuRD e Sin3 contengono proteine in grado di legare il DNA metilato

68 Metilazione H3 (operata da metiltrasferasi istoniche) H3K4me1 (struttura permissiva, enhancers in funzione) H3K4me2 H3K4me3 (attiva) H3K27me3 (sopprime) La metilazione istonica è letta da proteine cromodominio che legano gruppi metilici (per es CHD7, PRC1).

69 Lo stato di metilazione degli istoni è reversibile Metilato Metiltrasferasi ist. De-metilasi ist. Non-metilato

70 CONVERSIONE METILAZIONE-ACETILAZIONE Feng Tie et al. Development 2009;136:

72 Complessi di rimodellamento della cromatina Grossi complessi multiproteici che utilizzano energia da idrolisi di ATP per: Mobilizzare Disassemblare Modificare i nucleosomi I cambiamenti sono reversibili / temporanei Cambiano l accessibilita del DNA alle proteine regolatrici Trascrizione, Replicazione, Riparo Sono reclutati (da fattori di trascrizione) in regioni specifiche dove agiscono localmente

73 SWI-SNF: Rimodellamento attivatore SWI-SNF 1.promuove la mobilita del nucleosoma à espone TATA à assembla complesso di pre-inizio. 2.SWR1 facilita la sostituizione di un istone del core con una variante 3.FACT disassembla l ottamero istonico.

74 The SWI-SNF-like BAF complex

75 Posizione dei nucleosomi e accessibilità La posizione del nucleosoma non e alterata

76 (attivatore trascrizionale) (HAT) Possibile catena di eventi in seguito a interazione con attivatore trascrizionale (recettore glucocorticoidi) (1) TF lega il DNA e recluta il coattivatore CBP /HAT à acetilazione degli istoni locali (2) che crea sito di legame per un CRC (3) apre la cromatina del promotore (4) RNA pol si lega al promotore (5)

77 Gli attivatori di trascrizione, i complessi di rimodellamento della cromatina e le HAT cooperano per attivare la trascrizione

78 Polycomb: rimodellamento repressivo PRC2 > EZH2 -> H3K27me3 PRC1 In cellule staminali, polycomb sopprime geni che inducono il differenziamento

79 I repressori, i complessi di rimodellamento della cromatina e gli HDAC cooperano per reprimere la trascrizione di un gene

80 Organizzazione dei cromosomi all interno del nucleo

81 Eucromatina Modello dello scaffold proteico Le anse delle fibre di 300 nm sono ancorate alla matrice nucleare attraverso regioni ricche in AT (MAR, regioni associate alla matrice nucleare) Eterocromatina

82 Matrice nucleare Rete fitta di proteine filamentose e fibrille di RNA. Serve da organizzatore strutturale all interno del nucleo. L interazione tra le MAR e matrice organizza la cromatina in domini e mantiene i territori cromosomici.

83 Territori cromosomici: cromosomi umani 2 e 9 In-situ hybridization with whole chromosome painting probes for human Chr. 2 and 9

84 metafase umana dopo ibridazione con sonde specifiche per tutti i 24 cromosomi

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89 Transcription factories

90 Assemblaggio di un nodo trascrizionale

91 Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Lega fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; lega proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA

92 Metilazione del DNA Citosina del sito CpG viene metilata da DNA metiltrasferasi à 5 metilcitosina Genoma dei mammiferi; ~75% delle citosine dei siti CpG sono metilate Metilazione dei siti CpG tende ad impedire l attivazione del promotore Isole CpG, 1-2 kb nel DNA ricco di doppiette CpG, normalmente non metilate (nei geni espressi) e localizzate nella regione 5 del gene

93 5 metil citosina

94 Metilazione del DNA e repressione trascrizionale La repressione e mediata da proteine che legano CpG metilati, es. MeCP2 MeCP2 recluta complessi contenenti HDAC e metiltrasferasi istoniche La perdita di gruppi acetile e l aggiunta di gruppi metile portano all inattivazione della cromatina e al silenziamento genico DNA metiltrasferasi Reclutamento di corepressori con attivita istone metiltrasferasi

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101 Riassunto: regolazione trascrizionale I promotori dei geni eucariotici possono essere regolati a distanza Le sequenze regolatrici (enhancers) possono essere a monte e/o a valle del promotore. Sono riconosciute da fattori di trascrizione specifici (prot. regolatrici). Le proteine regolatrici lavorano insieme con la RNA pol II e i fattori generali di trascrizione per iniziare la trascrizione. La conformazione cromatinica è fondamentale per la regolazione genica. Le proteine regolatrici modulano l espressione genica di un organismo in modo tempo- e/o tissuto-specifico.