Stress biotici. Stress imposto da altri organismi

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1 Stress biotici Stress imposto da altri organismi

2 Patogeno vegetale: Organismo che, per completare parte o tutto il suo ciclo vitale, cresce all interno della pianta e nel fare ciò causa un effetto dannoso alla pianta stessa.

3 I patogeni vegetali sono agenti infettivi che causano malattie nelle piante I patogeni vegetali causano annualmente il 10 30% di perdita di prodotto Fino al 25% dei geni di una pianta rispondono all infezione di un patogeno La maggior parte delle piante sono resistenti alla maggioranza dei patogeni; la malattia è una eccezione, non la regola (es. Meno del 2% delle circa specie fungine note sono in grado di causare malattia nelle piante). La battaglia tra le piante e i patogeni determina diversità nei geni di difesa e di patogenicità

4 Molti tipi di organismi causano malattie nelle piante Nematodi sono grandi, anumali multicellulari Oomiceti Batteri Virus non sono cellulari ma semplici acidi nucleici impacchettati Funghi e Oomiceti sono eucarioti Batteri sono procarioti Funghi Funghi Large, E.C Advance of the Fungi. Jonathan Cape, London.

5 Una pianta può essere attaccata da più patogeni che possono prediligere tessuti specifici. Ciascun patogeno può dare origine a sintomi caratteristici della malattia.

6 Virus del mosaico del pomodoro (TMV) Oidio o Mal Bianco (Leveillula taurica)

7 What makes an interaction into a disease? (Disease triangle) Plants are exposed to countless microbes, but very, very few of these interactions lead to disease. Why? The pathogen must be able to overcome plant defenses The disease triangle (it takes three) The host plant must be susceptible to the pathogen Environment The environment must tip the balance in favor of the pathogen

8 Strategie del patogeno per colonizzare la pianta: Pressione meccanica o produzione di enzimi litici Penetrazione attraverso aperture naturali Penetrazione attraverso le ferite

9 Strategie del patogeno per utilizzare la pianta come substrato di crescita Necrotrofi Biotrofi Emibiotrofi

10 Come si difendono le piante dai patogeni? Difese costitutive: -barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete cellulare -metaboliti secondari tossici Difese indotte: - risposta locale: induzione di una serie di reazioni metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare l ingresso del patogeno -risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR)

11 Difese costitutive delle piante: Protezione delle superfici

12 La cuticola è formata da cutina e cere Il periderma, il tessuto che forma la corteccia esterna del fusto e radici durante l accrescimento secondario delle piante, contiene la suberina Cutina, cere e suberina: lipidi associati alla parete per ridurre le perdite di acqua e impedire l ingresso di patogeni (in quanto ne rallentano la germinazione per carenza di umidità)

13 Cuticola Parete cellulare

14 cuticola Strato cuticolare Parete cellulare primaria Membrana plasmatica

15 Parete cellulare vegetale: una barriera contro numerosi patogeni Emicelulose Pectine Proteine Cellulosa

16 Polimero di composti fenolici, specialmente fenilpropanoidi Rinforza la parete cellulare Lignina Alcol p-cumarilico Aumenta la resistenza all attacco dei funghi/patogeni La sintesi di lignina elimina H 2 O dalla parete e forma una trama idrofobica che lega la cellulosa e previene l estensione cellulare

17 Proteine strutturali e funzionali della parete cellulare vegetale

18 Le proteine strutturali formano legami nella parete In generale, sono delle glicoproteine, ricche in aminoacidi idrossiprolina, prolina o lisina. Sono idrofiliche e possono formare legami H. NH 3 della lisina può legarsi con COOdegli ac. pectici. Possono formare legami covalenti (estensina) tra residui di tirosina

19 HRGP, GRP e PRP Appena secrete sono relativamente solubili Diventano sempre più insolubili durante la maturazione cellulare o a seguito di ferite e attacco dei patogeni Si ritiene che il processo di insolubilizzazione sia dovuto a legami intramolecolari di difeniletere fra le tirosine Vengono indotte durante le ferite o attacco dei patogeni AGP Sono proteine arabinogalattaniche altamente glicosilate: il 90% della massa puo essere degli zuccheri! Potrebbero essere importanti nella segnalazione durante il differenziamento

20 Proteine con attività enzimatica Enzimi ossidativi perossidasi Enzimi idrolitici pectinasi, cellulasi Enzimi per l estensione cellulare espansine Inibitori degli enzimi secreti dal patogeno

21 Patogeni producono enzimi capaci di degradare la parete GLU PL XIL

22 Inibitore proteico della poligalatturonasi (PGIP) Riduce l attività macerante della PG Favorisce l accumulo di OG

23 Difese costitutive delle piante: Metaboliti secondari tossici

24 Metaboliti secondari Le piante producono una vasta gamma di composti chimici organici che non sembrano avere una funzione diretta sulla loro crescita e sviluppo. Queste sostanze sono note come metaboliti secondari o prodotti naturali.

25 Distinzione tra Metaboliti primari e secondari In assenza di una distinzione basata sulla struttura o sulla biochimica, si può effettuare solo una distinzione di tipo funzionale: Metaboliti primari: Partecipano nella nutrizione e nei processi metabolici essenziali della pianta. Metaboliti secondari: Influenzano le interazioni ecologiche tra la pianta e il suo ambiente.

26 I metaboliti secondari a differenza dei metaboliti primari si ritrovano soltanto in singole specie vegetali o in un gruppo di specie vegetali tassonomicamente affini.

27 RUOLI FISIOLOGICI Influenzano le interazioni ecologiche tra la pianta e il suo ambiente. Difesa delle piante contro microrganismi patogeni e erbivori Attrazione per animali impollinatori e che partecipano alla dispersione del seme Competizione tra specie di piante (allelopatia)

28 Esistono 3 gruppi principali di metaboliti secondari Terpeni Composti fenolici Composti contenenti azoto

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30 Terpeni Sintetizzati a partire dall acetil CoA o da intermedi della glicolisi Si formano per fusione di unità isopreniche a 5 atomi di carbonio Si classificano in base al numero di unità isopreniche: monoterpeni (2 unità, es. piretroidi) sesquiterpeni (3 unità, es. gossipolo) diterpeni (4 unità, es. acido abietico contenuto nelle resine) triterpeni (6 unità, saponine) politerpeni (n unità, gomma) Comprendono circa differenti composti

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33 Esempio di monoterpene Le zone chiare indicano le regioni di attacco degli scarafaggi della corteccia sul tronco di un pino. La resina prodotta in seguito all attacco contiene terpeni (a- e b- pinenemonoterpeni) tossico per l insetto.

34 Monoterpene

35 Monoterpene

36 Piretroidi (esteri monoterpenici) Piretro della Dalmazia (Tanacetum cinerariifolium (Trevir.) Sch.Bip. Famiglia delle Asteracee Es: deltametrina

37 Esempio del meccanismo d azione dei piretroidi come insetticidi

38 Similitudini Modello per il meccanismo di attivazione della H+-ATPasi da parte della fusicoccina prodotta dal fungo patogeno Fusicoccum amygdali (patogeno del pesco, mandorlo)

39 Composti fenolici Sostanze aromatiche che si formano attraverso la via dell acido scichimico o dell acido mevalonico. La fenilalanina è un intermedio nella via biosintetica della maggior parte dei fenoli vegetali es. lignina, antocianine, fitoalessine, tannini Comprendono circa differenti composti

40 Es. Stilbeni tra cui il resveratrolo (es. allelopatia) (fitoalessine)

41 (fitoalessine)

42 fitoalessine Composti a basso peso molecolare con attività antimicrobica. Vengono anche indotte in seguito ad infezione di patogeni

43 I flavoni e i flavonoli servono come difesa e come protettori dalle radiazioni UV (in quanto hanno la capacità di assorbire fortemente nella regione UV lasciando passare le lunghezze d onda del visibile, fotosinteticamente attive)

44 Struttura parziale della lignina

45 Componenti della lignina Alcohol coumaryl CH 2 OH

46 Tannini Si distinguono in due classi sulla base del percorso biosintetico: Tannini condensati Tannini idrolizzabili

47 Modalità d azione dei tannini con le proteine

48 È stato dimostrato che in molti tessuti vegetali sono presenti enzimi che nell intestino degli erbivori ossidano i fenoli nella corrispondente forma chinonica Diventano difficilmente assimilabili per gli erbivori

49 Composti contenenti azoto Sono sintetizzati a partire da amminoacidi Sono molto tossici per gli erbivori e, se ingeriti in quantità sufficienti anche per l uomo (es: la stricnina, l atropina e la coniina contenuta nella cicuta) Comprendono circa differenti composti -Alcaloidi, l atomo di azoto è presente normalmente in un anello eterociclico -I glucosidi cianogenetici liberano acido cianidrico (HCN) -I glucosinolati, contengono S, principalmente presenti nelle crucifere

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51 La degradazione dei glucosidi cianogenetici e dei glucosinolati è un processo enzimatico a 2 tappe Nel tessuto intatto non avviene perché il substrato e l enzima sono accumulati in differenti comparti cellulari

52 Glicosidi cianogeni CH 3 CH 3 C O CN glucose glucosidasi CH 3 CH 3 C OH CN + glucose Linamarina in Trifolium, Lotus Spontaneamente o idrossinitrile liasi L HCN è un veleno, interviene a livello della catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio (CN- reagisce con Fe+++ della CITOCROMO OSSIDASI e forma un complesso CN- CITOCROMO OSSIDASI, relativamente stabile con conseguente INIBIZIONE DELLA CATENA RESPIRATORIA MITOCONDRIALE (blocco della fosforilazione ossidativa e della produzione di ATP)) CH 3 CH 3 C O + HCN

53 L'amigdalina è un glucoside cianogenetico contenuto nei semi di diverse Rosacee (in gran quantità in quelli di mandorle amare). La beta-glucosidasi non si riscontra nei tessuti dei mammiferi, ma la flora batterica intestinale umana appare in grado di degradare in parte l'amigdalina (tramite enzimi simili alla beta-glucosidasi); Una eccessiva ingestione di semi di uva, mele, pere o il nocciolo della pesca, dell'albicocca è sconsigliata perché causa liberazione nell'organismo di acido cianidrico che può portare a morte per asfissia.

54 glucosinolati Contengono zolfo e azoto Questi prodotti aqiscono da difesa in quanto sono tossici per gli erbivori e hanno un gusto repellente. R C S glucosio N O SO 3 mirosinasi R-C + glucosio SH spontanea mente N-O-SO 3 - SO 4 R N C S isotiocinato R-C=N nitrile

55 Amminoacidi non proteici Modalità d azione La canavanina viene legata al trna dell arginina determinando la non funzionalità della proteina

56 Lectine Proteine che si legano ai carboidrati o alle glicoproteine. In seguito ad ingestione si legano alle cellule dell epitelio del tratto digerente interferendo con l assorbimento delle sostanze nutritive

57 Inibitori dei processi digestivi degli erbivori -Inibitori delle a-amilasi: impediscono la digestione dell amido -inibitori di proteinasi: bloccano l azione degli enzimi proteolitici legandosi al loro sito catalitico (es. legandosi alla tripsina o chimotripsina) Le piante transgeniche sovraesprimenti inibitori di proteinasi sono più resistenti all attacco degli insetti

58 Gli inibitori di proteasi sono un esempio di risposta indotta Come avviene?

59 polipeptide di 18 aa

60 La sistemina rappresenta l unico ormone proteico finora noto nelle piante

61 Risposte di difesa inducibili

62 Le piante posseggono numerosi meccanismi di difesa indotti Risposta di ipersensibilità (HR) Produzione di ROS Sintesi di NO Sintesi di proteine PR Fortificazione della parete cellulare Sintesi di sostanze ad attività antimicrobica

63 Attivazione temporale delle difese indotte

64 Terminologia da ricordare.. Interazione compatibile e incompatibile Descrive l interazione ospite-patogeno dal punto di vista del patogeno. Interazione incompatibile: indica una interazione in cui l ospite è resistente e quindi il patogeno non colonizza la pianta ospite Interazione compatibile: indica una interazione in cui l ospite è suscettibile al patogeno e quindi il patogeno colonizza la pianta ospite.

65 Risposta ipersensibile (HR) La risposta HR consiste in una rapida e localizzata morte cellulare Foglie di tabacco infettate con TMV che mostrano la risposta HR

66 Tentativo di invasione di un nematode su radici di pomodoro Interazione incompatibile: risposta HR a livello della zona di migrazione (A) e dei siti di tentata penetrazione (B) Interazione compatibile (C): è evidente la colonizzazione del tessuto ospite e le maggiori dimensioni del nematode

67 Controllo della morte cellulare durante la risposta HR indotta dal TMV: quali sono i segnali che attivano la morte cellulare delle prime cellule infettate? Jean T. Greenberg Developmental Cell Volume 8, Issue Degrade or Die: A Dual Function for Autophagy in the Plant Immune Response

68 Produzione di specie reattive dell ossigeno (ROS) Uno dei primi eventi che seguono l attacco del patogeno è l accumulo apoplastico e citosolico di specie reattive dell ossigeno (ROS) - perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) - anione superossido (O 2 ) - radicale idrossile (OH ) ROS possono essere generate da una serie di meccanismi enzimatici nell apoplasto: - NADP(H) ossidasi - ammino ossidasi - ossalato ossidasi (ossalato + O H+ 2 CO 2 + H 2 O 2 ) - perossidasi Questo fenomeno è chiamato scoppio ossidativo (oxidative burst)

69 Ruoli proposti per le ROS nella risposta di difesa: H 2 O 2 tossica per il patogeno In presenza di Fe, produzione del radicale idrossile (OH ) altamente reattivo Rafforzamento della parete cellulare (cross-linking di HRGP e PRG ai polisaccaridi di parete; aumento della velocità di formazione del polimero di lignina incrementando l attività perossidasica) Ruolo nella segnalazione (induce l acido benzoico 2- idrossilasi, la glutatione S-transferasi) Alterazione del bilancio redox (molti fattori di trascrizione dei mammiferi sono regolati dallo stato redox cellulare)

70 Produzione di ROS in una cellula vegetale (coltura in vitro) al sito di penetrazione da parte di un patogeno avirulento Colorazione istochimica dell anione superossido/perossido di idrogeno

71 Piante transgeniche di patata che sovraesprimono la glucosio ossidasi di Aspergillus niger per la produzione di H 2 O 2. E evidente che le piante transgeniche sulla destra non sono attaccata dal fungo Verticillium dahliae.

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73 La produzione di NO viene indotto durante l interazione incompatibile L ossido nitrico è una molecola segnale che nei mammiferi regola diversi processi biologici dei sistemi immunitario, nervoso e vascolare. Nelle piante viene indotta una rapida sintesi de novo di NO in seguito al riconoscimento di batteri avirulenti. Intensifica l induzione della morte cellulare causata da ROS (ROS da solo è insufficente ad indurre morte cellulare) Induce numerosi geni implicati nella risposta di difesa

74 Il rafforzamento della parete cellulare e attività extracellulari contribuiscono alla risposta di restenza Formazione di papillae di callosio e lignina Rapido cross-linking delle HRGP extracellulari Modulazione dell attività idrolitica delle PG fungine ad opera della PGIP

75 Induzione di Proteine PR Pathogenesis-Related proteins Families Type member Properties PR-1 Tobacco PR-1a antifungal PR-2 Tobacco PR-2 b-1,3-glucanase PR-3 Tobacco P, Q chitinase type I,II, IV,V,VI,VII PR-4 Tobacco 'R' chitinase type I,II PR-5 Tobacco S thaumatin-like PR-6 Tomato Inhibitor I proteinase-inhibitor PR-7 Tomato P69 endoproteinase PR-8 Cucumber chitinase chitinase type III PR-9 Tobacco 'lignin-forming peroxidase' peroxidase PR-10 Parsley 'PR1' 'ribonuclease-like' PR-11 Tobacco 'class V' chitinase chitinase, type I PR-12 Radish Rs-AFP3 defensin PR-13 Arabidopsis THI2.1 thionin PR-14 Barley LTP4 lipid-transfer protein PR-15 Barley OxOa (germin) oxalate oxidase PR-16 Barley OxOLP 'oxalate oxidase-like' PR-17 Tobacco PRp27 unknown

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77 Aumento di enzimi idrolitici Co-espressione della glucanasi e chitinasi in tabacco produce i migliori risultati per la resistenza al fungo Cercospora nicotianae

78 Aumento di enzimi idrolitici Piante transgeniche di tabacco che esprimono la glucanasi in antisenso. I sintomi dell infezione da TMV sono minori nella pianta transgenica (foglia superiore) rispetto alla pianta di controllo. In questo modo si è ridotta l attività glucanasica che il TMW induce in tabacco per rimuovere il callosio dai plasmodesmi.

79 Aumento di fitoalessine Sovraespressione della stilbene sintasi in tabacco che porta alla formazione della fitoalessina rasveratrolo (conferisce resistenza alla B. cinerea)

80 Le piante posseggono numerosi meccanismi di difesa indotti Risposta di ipersensibilità (HR) Produzione di ROS Sintesi di NO Sintesi di proteine PR Fortificazione della parete cellulare Sintesi di sostanze ad attività antimicrobica Risposta sistemica acquisita (SAR)

81 Risposta sistemica acquisita (SAR) Virus, funghi e batteri sono in grado di attivare in modo sistemico uno specifico sottogruppo di risposte di difesa nota come SAR, che implica la produzione locale di SA e un segnale floemamobile.

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83 Acido salicilico (SA) (e acido benzoico (BA)) intervengono in numerose risposte di difesa BA e SA si accumulano ad elevate concentrazioni nelle immediate vicinanze del sito di infezione in una reazione incompatibile

84 Piante di tabacco e Arabidopsis contenenti il transgene nahg (codificante la salicilato idrossilasi, che converte SA in catecolo) hanno una ridotta risposta di resistenza (es: al TMW) e non presentano l induzione di numerosi geni di difesa

85 Induzione sistemica degli inibitori di proteasi (e da stress da ferita) ad opera della sistemina

86 Via di segnalazione della sistemina per l induzione degli inibitori delle proteasi in pomodoro Fig TAIZ

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88 Come si attivano le risposte di difesa inducibili?

89 L attuazione delle risposte di difesa inducibili presuppone una capacità della pianta a: 1 percepire la presenza del patogeno (evento che viene definito di riconoscimento ) 2 trasmettere l'informazione all'interno della cellula infettata e alle cellule limitrofe il sito d'infezione 3 indurre una serie di modificazioni, sia a livello del sito d'infezione che sistemiche, in grado di limitare l'invasione del patogeno

90 Percezione del patogeno (evento di riconoscimento ) Capacità della pianta di distinguere molecole self da molecole non-self analogie con l auto-incompatibilità gametofitica che previene l autofecondazione in pianta ermafrodite

91 Impollinazione Granello pollinico Meccanismi di auto- e allo - incompatibilità che impediscono la auto- o allo - impollinazione Stigma Papilla stigmatica Stilo

92 Impollinazione

93 Impollinazione Riconoscimento

94 Le piante utilizzano i pattern recognition receptors (PRRs) presenti sulla membrana plasmatica per percepire dei potenziali patogeni presenti nell ambiente. PRRs riconoscono delle specifiche strutture conservate presenti nei microrganismi che sono chiamate pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) Questo riconoscimento conduce alla PAMP-triggered immunity (PTI), che previene efficacemente la colonizzazione della pianta ospite dai non-patogeni. Il sistema meglio studiato di PTI è la via dipendente dall FLS2. FLS2 riconosce il PAMP flg22 che è un componente della flagellina batterica.

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96 Meccanismo di rimozione di FLS2 attivato

97 I patogeni posseggono dei fattori di virulenza o effettori ( effectors ) che sopprimono la PTI. Questo conduce alla effector-triggered susceptibility (ETS) e il patogeno causa la malattia. Di conseguenza alcune piante hanno evoluto dei geni di Resistenza (R) che riconoscono gli effettori o la loro attività. Questo conduce alla effectortriggered immunity (ETI) e la pianta non si ammala. Sia la PTI che ETI determinano l induzione dei geni di difesa.

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99 A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system From: The plant immune system Jonathan D. G. Jones & Jeffery L. Dangl Nature 444, (16 November 2006). doi: /nature05286

100 PRR PTI ETI

101 Esempio di PRR e PAMP

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104 Struttura dei prodotti dei geni R e di alcune proteine coinvolte nello sviluppo Il motivo LRR è stato dimostrato mediare le interazioni proteinaproteina e recettore-ligando.

105 Tre possibili modi per riconoscere il patogeno

106 Geni di Avirulenza o geni Avr e i loro prodotti effettori Un patogeno che possiede geni Avr è considerato nonvirulento (Avirulento) su una pianta che possiede un gene R corrispondente; I prodotti dei geni Avr sono effettori. L associazione tra i geni Avr e R sono descritti nella interazione gene-for-gene di Flor.

107 Percezione del segnale Modello gene-per-gene proposto da Flor

108 Quattro tipi principali di organizzazione dei geni R

109 Meccanismi genetici che generano nuovi geni R

110 Meccanismi genetici che generano nuovi geni R

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113 Trasmissione del segnale di riconoscimento

114 Fig TAIZ Induzione delle risposte di difesa delle piante

115 Molti segnali regolano l espressione genica attraverso una cascata di proteine chinasi Trasmissione del segnale

116 I mutanti di Arabidopsis ndr1 e eds1 dimostrano l esistenza di distinte vie di segnalazione a valle del riconoscimento R-Avr

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118 Vie di segnalazioni parallele coordinano la complessa e localizzata risposta di difesa