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1 MODULO 1 MODULISTICA MODULO 1 - Dati generali TITOLO DEL PROGETTO: Identificazione di marcatori per la predizione della risposta a nuovi farmaci antitumorali (inibitori di HDAC, tirosino chinasi e pompe ioniche). COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO ,00 FINANZIAMENTO RICHIESTO AD ACC/ISS ,00 RISORSE PROPRIE ,00 COFINANZIAMENTI : 0,00 (SPECIFICARE ENTE EROGATORE, DATA INIZIO DISPONIBILITÀ FONDI E RELATIVO IMPORTO) / / / / / / / / / / / / / / / ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO / / / / / / / / / / / / / / / ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO / / / / / / / / / / / / / / / ENTE EROGATORE GG MM AA IMPORTO DURATA (in mesi, massimo 36) :36 I

2 MODULO 1 COORDINATORE DEL PROGETTO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Chairman Dipartimento di Oncologia Sperimentale indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo piergiuseppe.pelicci@ifom-ieo-campus.it DESTINATARIO ISTITUZIONALE PROPONENTE Destinatario Istituzionale Istituto Europeo di Oncologia Rappresentante legale Dott. Carlo Ciani Responsabile Scientifico UO 1 Prof. Pier Giuseppe Pelicci Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Prof. Pier Giuseppe Pelicci 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Prof. Saverio Minucci 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Susanna Chiocca 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Prof. Salvatore Pece 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Giuseppina Bonizzi 6. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Luisa Lanfrancone Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale) 7. IRCCS Istituto Clinico Humanitas Dott.ssa Paola Allavena 8. Istituto Dermopatico dell Immacolata Dott. Alessandro Terrinoni DESTINATARI ISTITUZIONALI PARTECIPANTI Destinatario Istituzionale FONDAZIONE IRCCS ISTITUTO NAZIONALE DEI TUMORI Rappresentante legale Dott. Stefano Zurrida Responsabile Scientifico UO 2 Dott.ssa Maria Grazia Daidone Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Maria Grazia Daidone 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Angela Greco 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Sylvie Ménard 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Gabriella Sozzi 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale Dott.ssa Franco Zunino 6. Dipartimento di Anatomia Patologica Dott.ssa Silvana Pilotti Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale) 7. Istituto Superiore di Sanità Dott. Stefano Fais II

3 Destinatario Istituzionale Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta Rappresentante legale Dott. Alessandro Moneta Responsabile Scientifico UO 3 Dott. Gaetano Finocchiaro Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 1. Struttura di Neuro-Oncologia Sperimentale, Ist. Besta Dott. Gaetano Finocchiaro 2. Struttura di Neurobiologia, Ist. Besta Dr. Maurizio Gelati Gruppi di ricerca afferenti al DI (Dipartimento/Sezione e nominativo del Responsabile Scientifico) 3. IEO Dott.ssa Giuliana Pelicci Gruppi di ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca (Istituzione e nominativi del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale) III

4 MODULO 2 MODULO 2 - DESCRIZIONE DEL PROGETTO (SINTESI DELLE ATTIVITÀ DI TUTTE LE UNITÀ OPERATIVE) BASE DI PARTENZA E RAZIONALE (max 4000 caratteri) L obiettivo della nuova Medicina Molecolare è la definizione degli specifici difetti genetico-molecolari di un determinato tumore per il disegno di farmaci appropriati ed esempi sono già ampiamente disponibili nella pratica clinica così come l identificazione di profili di espressione genica capaci di costituire signatures di sensibilità/resistenza ai diversi trattamenti. La risposta agli attuali quesiti della Medicina Molecolare sarà generata dalla sovrapposizione virtuale di farmacogenomica e farmacogenetica, ovvero del genoma della cellula tumorale con quello del singolo paziente con l obbiettivo finale di sviluppare modalità di trattamento con un razionale meccanicistico, in base al quale somministrare al momento opportuno il trattamento ottimale (singolo ma più verosimilmente in combinazione per agire su meccanismi di progressione primari, secondari o multipli e ridondanti) a pazienti individuali in base ad un razionale definito dalle alterazioni molecolari del singolo tumore, con una concreta possibilità di ottenere una risposta clinica duratura (anche in termini di cronicizzazione della malattia oncologica) e avendo a disposizione una diagnostica molecolare che ci consenta di identificare i pazienti potenzialmente responsivi allo specifico trattamento, così come quelli ad esso refrattari, e ad effettuare la validazione del bersaglio cellulare, ovvero verificare l avvenuta interferenza su pathway/s molecolare/i alterato/i. Tale atteggiamento implica una transizione dall atteggiamento conservativo/difensivo di una chemioterapia di combinazione, nella quale i farmaci vengono associati allo scopo di contrastare la resistenza, intrinseca e/o acquisita, ad un approccio innovativo e interventistico, con il quale si associano molecole contro differenti bersagli molecolari, quali ad esempio inibitori delle tirosino-chinasi o delle istone-deacetilasi, per sfruttare la suscettibilità della cellula e aumentare la possibilità di eradicare la malattia a livello molecolare. Inibitori delle tirosino-chinasi. In base alla considerazione che enzimi tirosin chinasici sono coinvolti in pathways di proliferazione e sopravvivenza cellulare e che varie protein chinasi hanno un ruolo regolatorio in tali processi, l inibizione di queste attività enzimatiche, attivate in modo aberrante in diversi tipi di tumore, rappresenta un nuovo ed estremamente promettente approccio con differenti opportunità terapeutiche con il quali interferire a diversi livelli sulla patofisiologia della cellula tumorale. Tra i recettori ad attività tirosin-chinasica quelli più studiati, definibili come upstream targets, appartengono alla famiglia EGFR (EGFR, HER-2/neu, HER-3), VEGFR (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3), PDGFR (KIT, PDGFRA, PDGFRB), mentre altri possibili bersagli terapeutici sono costituiti dalle molecole effettrici di tali recettori (downstream targets perché a valle della cascata indotta dall interazione tra fattore di crescita e recettore), tra cui Ras/Raf-MEK/Erk, BRAF, PI3K/Akt, PTEN, Ret. Proprio in relazione al loro ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale mitogenico e quindi nei processi di proliferazione e differenziamento cellulare così come nell attivazione dell angiogenesi, i recettori ad attività tirosin-chinasica sono stati oggetto di un intensa ricerca, finalizzata all identificazione di molecole in grado di interferire sulla loro attività in modo specifico. A tutt oggi diversi sono gli inibitori tirosin-chinasici, sia recettoriali che citoplasmatici, utilizzati in clinica nel trattamento di neoplasie solide e sistemiche. Generalmente si tratta di anticorpi monoclonali che legano la porzione extracellulare del recettore inibendone l interazione col ligando (gefitinib nel caso di EGFR, trastuzumab nel caso di HER-2, IMC-1C11 nel caso di VEGFR) o impedendone la dimerizzazione (come nel caso di pertuzumab per HER-2) e di piccole molecole capaci di inibire l attività enzimatica delle tirosin-chinasi (come nel caso dell imatinib per la proteina di fusione ad attività tirosin-chinasica BCR/ABL nella leucemia mieloide cronica). Inibitori delle istone-deacetilasi. Le deacetilasi (HDAC) e le acetil-transferasi (HAT) istoniche influenzano la struttura della cromatina e modulano l attività di diverse proteine non istoniche implicate nella regolazione di differenti funzioni cellulari. Ad oggi nell uomo sono state identificate 18 HDAC, che sono state raggruppate in tre classi. La classe I, a cui appartengono HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC8, è ubiquitaria ed è implicata nella patogenesi di numerosi tumori. La sperimentazione clinica di inibitori delle HDAC ha condotto recentemente il primo inibitore di HDAC (il SAHA) alla registrazione per l utilizzo nella terapia di alcuni linfomi a cellule T. Gli attuali inibitori delle deacetilasi istoniche in sperimentazione clinica (incluso il SAHA) mostrano tutti una certa tossicita e una bassa selettivita per i diversi isoenzimi HDAC. Uno di questi inibitori (l acido valproico o VPA) è da diversi decenni in uso come farmaco antiepilettico, a dosi che nei pazienti neurologici non sono però sufficienti ad inibire HDAC. Il VPA è un inibitore specifico per la classe I di HDAC, e potrebbe quindi rappresentare un farmaco selettivo per la sottofamiglia di HDAC maggiormente coinvolta nella tumorigenesi. OBIETTIVO PRINCIPALE E OBIETTIVI SECONDARI DEL PROGETTO (max 4000 caratteri) La caratterizzazione sistematica delle alterazioni genetiche e funzionali dei tumori ha consentito di identificare numerosi bersagli molecolari per la generazione di nuovi farmaci (Farmaci Molecolari). I primi studi clinici eseguiti con tali farmaci hanno confermato le proprietà attese di efficacia e scarsa tossicità. In generale, però, i Farmaci Molecolari si sono dimostrati attivi in una frazione modesta dei pazienti trattati, verosimilmente in quei casi nei quali lo specifico bersaglio molecolare è IV

5 accessibile e/o biologicamente rilevante. L obiettivo di questo programma di ricerca e la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica ad alcuni dei farmaci molecolari disponibili: inibitori di istonedeacetilasi, HDACi (VPA e SAHA); inibitori delle tirosino chinasi, TKi (herceptin e imatinib); inibitori delle pompe ioniche (PPI) in selezionati tipi di tumore (tumori della mammella, melanomi, leucemie mieloidi e glioblastomi). I tumori che verranno inseriti nello studio verranno caratterizzati per l espressione del bersaglio e, ove appropriato, per il suo stato di attivazione o per la presenza di alterazioni genetiche. La sensibilita ai Farmaci Molecolari selezionati verra analizzata sia sul bulk delle cellule tumorali che su colture di cellule staminali dello stesso tumore. Lo studio verra eseguito utilizzando modelli pre-clinici di neoplasia: i) modelli animali, comprendenti topi transgenici (leucemie mieloidi acute ottenute mediante transgenizzazione delle proteine di fusione PML-RAR e AML1-ETO; leucemia mieloide cronica esprimente bcr-abl; tumore mammario esprimente erbb2; melanomi sovraesprimenti B-Raf) e xenotrapianti dei corrispondenti tumori umani in topi immunodeficienti. Ii) Campioni umani, comprendenti colture primarie di tumore (per esempio cellule epiteliali mammarie e di melanoma), colture di cellule tumorali staminali (mammosfere, neurosfere, melanosfere e LTC-IC) e campioni bioptici dagli stessi tumori. La attivita sperimentale sara articolata in tre fasi: Fase 1: Valutazione della attivita biologica (crescita cellulare, apoptosi, senescenza, ciclo cellulare), biochimica (effetto sulle vie di segnalazione downstream allo specifico bersaglio molecolare: HDAC, TK, pompe ioniche) e molecolare (profili di espressione) di ciascun farmaco nelle varie colture primarie di tumore e nei modelli murini transgenici disponibili. Tali studi condurranno alla identificazione di bersagli critici della risposta e/o potenziali marcatori. Fase 2: Valutazione dell espressione dei marcatori di risposta nelle biopsie dei tumori, mediante ibridazione in situ e immunoistochimica. Fase 3: Validazione della efficacia predittiva dei marcatori selezionati mediante studi correlativi su xenotrapianti di tumori umani. Se questo programma di ricerca condurra alla identificazione di marcatori di risposta ai Farmaci Molecolari studiati, programmiamo la esecuzione di uno studio clinico pilota (carcinomi metastatici della mammella trattati con VPA). Infine, verranno condotti studi preliminari per la caratterizzazione del bersaglio molecolare di nuovi farmaci (ET-43) potenzialmente attivi nei confronti di liposarcomi esprimenti la proteina di fusione FUS- CHOP. METODOLOGIA (max 8000 caratteri) Studieremo la attivita anti-tumorale di HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi; herceptin nel tumore della mammella; imatinib nella leucemia mieloide cronica; PPI nel tumore della mammella; ET-43 nei liposarcomi. Task 1: Esperimenti in tumori umani. Testeremo l attivita e il meccanismo di azione dei vari farmaci su colture primarie di tumore al fine di identificare marcatori di risposta che verranno poi validati su campioni bioptici degli stessi tumori. In particolare: Caratterizzazione del bersaglio. Ciascun tumore verra caratterizzata per l espressione del bersaglio (le varie isoforme di HDAC, B-Raf, erbb2, bcr-abl, proteine di fusione) e, ove appropriato, per il suo stato di attivazione (erbb2, B-Raf e bcr-abl). Nei tumori mammari e nei melanomi, verra valutata la presenza di alterazioni genetiche di erbb2 e B-Raf. Colture primarie: i) cellule staminali di glioblastoma (neurosfere), di tumore mammario (mammosfere), melanoma (melanosfere) e di leucemie (LTC-IC); ii) cellule aderenti di tumore mammario (cellule epiteliali), melanoma e glioblastoma; iii) colture in mezzi liquidi di cellule da leucemia mieloide acuta e cronica. Test di sensibilita. L attivita biologica dei vari farmaci molecolari sara analizzata mediante test convenzionali per la valutazione della proliferazione cellulare, ciclo cellulare, apoptosi e senescenza. Valutazione biochimica. Valuteremo l effetto biochimico atteso di ciascun farmaco (inibizione dell acetilazione degli istoni e di altri bersagli; inibizione delle vie di segnalazione downstream a tirosino chinasi attivate; inibizione funzionale delle pompe protoniche vacuolari). Correlazioni molecolari. Ciascun trattamento sara valutato mediante analisi globale di espressione (eseguita prima e, serialmente, dopo l aggiunta del farmaco) al fine di identificare eventuali marcatori molecolari di risposta. Correlazioni funzionali. Gli studi sopra descritti consentiranno di identificare bersagli critici della risposta ai farmaci, che verranno validati biologicamente mediante esperimenti di RNAi negli stessi modelli. Tale approccio potra consentire di identificare specifiche vie di segnalazione che saranno rivalutate nei saggi biologi sopra descritti. Analisi delle biopsie. Le molecole che saranno identificate mediante i saggi sopra descritti verranno valutate per la loro espressione nei tumori originali mediante ISH o ICH nei campioni bioptici corrispondenti. Task 2. Modelli animali. Lo studio su modelli animali e diviso in due parti: Analisi della sensibilita ai farmaci molecolari. L efficacia in vivo dei vari farmaci sara valutata nei modelli animali di tumore gia disponibili nei nostri laboratori. Valuteremo in parallelo gli effetti biochimici e molecolari dei trattamenti, come descritto sopra. Valore predittivo dei marcatori di risposta. Gli studi descritti sopra consentiranno di identificare potenziali marcatori di risposta che verranno validati mediante trattamento e monitoraggio molecolare di xenotrapianti di tumore umano in topi immunodeficienti. Task 3. Studi clinici di fase1/2. I marcatori di risposta identificati verranno validati mediante studi clinici di fase 1/2. Prevediamo di eseguire uno studio su pazienti con carcinoma metastatico della mammella mediante l HDACi VPA. Tale V

6 scelta e motivata dal fatto che la identificazione di marcatori di risposta per tumore mammario e gia in fase avanzata di sviluppo nei nostri laboratori e il VPA disponibile a basso costo sul mercato farmaceutico. RISULTATI ATTESI (max 4000 caratteri) L obiettivo principale di questo programma di ricerca e la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica dei seguenti farmaci molecolari: HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi; herceptin, un anticorpo monoclonale contro erbb2, nel tumore della mammella; imatinib, un TKi per BCR/ABL, nella leucemia mieloide cronica; PPI, un inibitore delle pompe ioniche, nel tumore della mammella; ET-43 in una sottoclasse di liposarcomi. Per raggiungere tale scopo, ci aspettiamo i seguenti risultati: 1. Caratterizzazione molecolare del bersaglio di ciascun farmaco, in ciascuno dei tumori inclusi nello studio, in termini di livelli di espressione, presenza di mutazioni e stato funzionale; 2. Definizione della sensibilita a ciascun farmaco di tumori della mammella, glioblastomi e leucemie mieloidi mediante uso di modelli pre-clinici. A tale scopo, tratteremo con i vari farmaci colture primarie (comprese colture di cellule staminali tumorali) e modelli animali dei vari tumori (animali transgenici e xenotrpianti di tumori umani in topi immunodeficienti) e valuteremo i loro effetti biologici, biochmici (sul bersaglio e vie di segnalazione downstream ) e molecolari (mediante analisi globale di espressione); 3. Identificazione di bersagli critici della risposta a ciascun farmaco. I marcatori di risposta saranno valutati per il loro ruolo funzionale nella sensibilita del tumore ai vari farmaci nei medesimi modelli sperimentali; 4. Caratterizzazione dell espressione dei marcatori identificati nelle biopsie tumorali; 5. Validazione della accuratezza dei marcatori di risposta identificati mediante studi correlativi in xenotrapianti di tumori umani in topi immunodeficienti; 6. Esecuzione di studi clinici di fase 1/2 per la validazione clinica dei marcatori identificati (previsto uno studio clinico su carcinoma metastatico della mammella e l inibitor delle HDAC VPA). VI

7 MODULO 2 COMPOSIZIONE DEL COSTO COMPLESSIVO DEL PROGETTO Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni , ,00 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) 5.000,00 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 VII

8 Curriculum Vitae del Coordinatore del progetto (max 2 pagine) ( INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Pier Giuseppe Pelicci, M.D. - Ph.D. Data di nascita: 5 Settembre 1956 Luogo di nascita: Gubbio (Perugia), Italia MODULO : Diploma di Maturità Scientifica (Perugia). Votazione: 60/ : Iscrizione alla facoltà di Medicina e Chirurgia dell'università di Perugia. 1976: Allievo interno presso l'istituto di Microbiologia dell Università di Perugia diretto dal prof. M. Pitzurra. 1977: Allievo interno presso l'istituto di Fisiologia dell Università di Perugia diretto dal prof. F. Magni : Allievo interno presso l'istituto di Clinica Medica dell'università di Perugia diretto dal prof. P. Larizza. 1981: Laurea in Medicina e Chirurgia - Votazione: 110/110 e lode 1981: Medico interno con compiti assistenziali presso l'istituto di Clinica Medica dell'università di Perugia, diretto dal prof. P. Larizza. 1982: Ricercatore presso "Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Unite de Recherches en Genetique Moleculaire et Hematologie, I.N.S.E.R.M.-U.91", Creteil, France, diretto dal prof. H. Rochant. 1983: Medico interno con compiti assistenziali presso l'istituto di Clinica Medica dell'università di Perugia, diretto dal prof. P. Larizza : Ricercatore presso il laboratorio di biologia molecolare della "New York University Medical Center, Department of Pathology, New York, U.S.A." diretto dal prof. Riccardo Dalla Favera : Assistente medico con compiti assistenziali e responsabile del laboratorio di biologia molecolare e di diagnostica molecolare dei tumori dell'istituto di Clinica Medica I dell'università di Perugia, diretto dal prof. F. Grignani. 1987: Specialista in Medicina Interna, Università di Perugia, 50/50 e lode 1987: Dottore in Ricerca, Disciplina Biologia Molecolare : Aiuto Ospedaliero presso l'istituto di Clinica Medica I dell'università di Perugia, diretto dal prof. F. Grignani Professore Associato di Oncologia Medica, Università di Parma Professore Ordinario di Patologia Generale, Università Vita e Salute San Raffaele, Milano Chairman, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano Direttore Scientifico, Fondazione Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM) Professore Ordinario di Patologia Generale, Università degli Studi di Milano, Milano. TITOLI DI STUDIO: 1981 Dottore in Medicina, Università di Perugia, 110/110 e lode 1987 Specialista in Medicina Interna, Università di Perugia, 50/50 e lode 1987 Dottore di Ricerca in Biologia Molecolare ATTIVITA' DIDATTICA: 1982: Incarico di insegnamento al "Terzo Corso Annuale di Specializzazione in Educazione Sanitaria". Centro Sperimentale per l'educazione Sanitaria, Università di Perugia : Corsi integrativi e attivita' didattiche integrative, quale professore a contratto nella Scuola di Specializzazione in Medicina Interna, Facoltà di Medicina, Università degli Studi di Perugia : Attività didattica in forma di esercitazioni, seminari e partecipazione alla commissione di esame per l'insegnamento di Genetica Umana per gli studenti della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell'università di Perugia Professore Associato, Corso di Oncologia Medica, Facoltà di Medicina, Università di Parma Professore Ordinario, Corso di Patologia Generale, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università Vita Salute S. Raffaele, Milano, VIII

9 ATTIVITA' SCIENTIFICA L'attività di ricerca é documentata da 277 lavori originali e 41 rassegne pubblicati su riviste internazionali e 31 capitoli di libri. L'attività scientifica si é svolta sui seguenti temi: a) Meccanismi del riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline e del recettore delle cellule T e loro impiego nella diagnostica dei disordini linfoproliferativi. b) Analisi delle alterazioni genetiche delle cellule neoplastiche ed interpretazione delle stesse in termini di patogenesi della trasformazione e marcatori tumorali specifici. In particolare sono stati studiati: alterazioni degli oncogeni c-myc e c-myb nei linfomi; alterazioni del gene RAR nella leucemia acuta promielocitica c) Studi clinici e biologici sulla terapia differenziativa con Acido Retinoico delle Leucemie Acute Mieloblastiche e di alcune neoplasie solide. d) Clonaggio del gene Shc e definizione del ruolo della proteina SHC nella trasduzione del segnale da tirosin-chinasi attivate a Ras. e) Meccanismi genetici dell invecchiamento PUBBLICAZIONI 1. Alcalay M, Tiacci E, Bergomas R, Bigerna B, Venturini E, Minardi SP, Meani N, Diverio D, Bernard L, Tizzoni L, Volorio S, Luzi L, Colombo E, Lo Coco F, Mecucci C, Falini B, Pelicci P.G.. Acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic nucleophosmin (NPMc+ AML) shows a distinct gene expression profile characterized by up-regulation of genes involved in stem-cell maintenance. Blood 106(3), , Colombo E, Bonetti P, Lazzerini Denchi E, Martinelli P, Zamponi R, Marine JC, Helin K, Falini B, Pelicci P.G.. Nucleophosmin Is Required for DNA Integrity and p19arf Protein Stability. Mol Cell Biol 25(20), , Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, Santucci A, Bigerna B, Pacini R, Pucciarini A, Liso A, Vignetti M, Fazi P, Meani N, Pettirossi V, Saglio G, Mandelli F, Lo-Coco F, Pelicci P.G., Martelli MF; GIMEMA Acute Leukemia Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. New Engl J Med 352(7), 740, Giorgio M, Migliaccio E, Orsini F, Paolucci D, Moroni M, Contursi C, Pelliccia P, Luzi L, Minucci S, Marcaccio M, Pinton P, Rizzuto R, Bernardi P, Paolucci F, and Pelicci P.G.. Electron Transfer between Cytochrome c and p66shc Generates Reactive Oxygen Species that Trigger Mitochondrial Apoptosis. Cell 122, 1-13, Insinga A, Monestiroli S, Ronzoni S, Gelmetti V, Marchesi F, Viale A, Altucci L, Nervi C, Minucci S, Pelicci P.G.. Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway. Nat Med 11(2), 233, Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, Shing DC, Bonetti P, Luzi L, Volorio S, Bernard L, Pruneri G, Alcalay M, Pelicci P.G.. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Res 66(6), , Mariano AR, Colombo E, Luzi L, Martinelli P, Volorio S, Bernard L, Meani N, Bergomas R, Alcalay M, Pelicci P.G.. Cytoplasmic localization of NPM in myeloid leukemias is dictated by gain-of-function mutations that create a functional nuclear export signal. Oncogene 25(31), , Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F, Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci P.G., Di Croce L. The methyl-cpg binding protein MBD1 is required for PML-RAR{alpha} function. Proc Natl Acad Sci U S A 103(5), , Di Micco R, Fumagalli M, Cicalese A, Piccinin S, Gasparini P, Luise C, Schurra C, Garre' M, Nuciforo PG, Bensimon A, Maestro R, Pelicci PG, d'adda di Fagagna F. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444(7119), , Fazi F, Zardo G, Gelmetti V, Travaglini L, Ciolfi A, Di Croce L, Rosa A, Bozzoni I, Grignani F, Lo-Coco F, Pelicci PG, Nervi C. Heterochromatic gene repression of the retinoic acid pathway in acute myeloid leukemia. Blood 2007 IX

10 MODULO 3 MODULO 3: DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUNA UNITÀ OPERATIVA (Compilare un modulo per ciascuna UO) UNITÀ OPERATIVA N. 1: Istituto Europeo di Oncologia RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Chairman Dipartimento di Oncologia Sperimentale indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo piergiuseppe.pelicci@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 2000 caratteri) IEO. I gruppi di ricerca afferenti a IEO hanno messo a punto: i) protocolli per colture primarie di carcinomi mammari e melanomi (popolazioni bulk e staminali), glioblastoma (staminali; in collaborazione con Besta) e leucemie acute mieloidi (LTC-IC e colture in sospensione); ii) modelli animali di topi transgenici per leucemie (con PML-RAR; AML1-ETO e bcrabl), melanomi (B-Raf) e tumori mammari (MMTV-erbB2) e modelli di xenotrapianto per glioblastoma, melanoma e tumore mammario. I gruppi IEO si dedicheranno allo studio degli HDACi. Ad oggi nell uomo sono state identificate 18 HDAC, raggruppate in tre classi. Gli attuali inibitori delle deacetilasi istoniche in sperimentazione clinica (incluso il SAHA) mostrano tutti una bassa selettivita per i diversi isoenzimi HDAC. Uno di questi inibitori (VPA) è da diversi decenni in uso come farmaco antiepilettico ed è un inibitore specifico per HDAC di classe I. SAHA e VPA verranno utilizzati nei tumori mammari, melanomi, glioblastomi e leucemie mieloidi acute, come dettagliato nella Descrizione della Proposta. Contemporaneamente, mediante RNAi, saranno spente le varie HDAC di classe I per determinare quale HDAC e principalmente implicata nel mantenimento del fenotipo tumorale ed eventualmente nella sensibilita agli HDACi. IDI. Il gruppo IDI coinvolto in questo progetto partecipera agli studi degli effetti di HDACi in carcinomi mammary, melanomi e leucemie mieloidi studiando, in particolare la regolazione farmacologica della famiglia p53/p63/p73. ICH. Un sottotipo di liposarcomi umani e caratterizzato dalla presenza del fattore di trascrizione chimerico FUS-CHOP e dalla sensibilita all effetto citotossico di un nuovo agente anti-tumorale: ET-743, un prodotto naturale in sperimentazione clinica. Il gruppo di ricerca di Humanitas testera l ipotesi che il farmaco ET-743 agisca bloccando la capacita transattivante di FUS-CHOP. X

11 METODOLOGIA (max 4000 caratteri) Dal punto di vista metodologico, la esecuzione di questo progetto di ricerca comporta i seguenti principali approcci tecnologici (tutti già disponibili nel laboratorio del proponente): a) Propagazione in vitro di cellule staminali ematopoietiche, di melanoma, glioblastomas e mammarie umane e murine mediante colture a lungo termine di midollo osseo (LTC-IC) o mammosfere, melanosfere, neurosfere rispettivamente. b) Ingegnerizzazione dellecellule staminali. Le cellule staminali ematopoietiche e mammarie verranno modificate geneticamente mediante uso di retrovirus o lentivirus, al fine di esprimere proteine mutanti o di attenuare l espressione di geni endogeni (RNAi). c) Trapianto di celle staminali nell animale da esperimento. Le cellule staminali emopoietiche, neuroinali, melanocitiche e mammarie propagate (e manipolate) in vitro verranno poi trapiantate, rispettivamente, in topi letalmente irradiati, sottocute, intracerebralmente o nel grasso mammario (previamente svuotato di tessuto mammario endogeno). d) Esecuzione di profili di espressione. Vari campioni cellulari (comprese specifiche sottopopolazioni di staminali/progenitori) di origine ematopoietica o da tessuto mammario verranno analizzati per i loro profili di espressione genica, mediante tecnologia Affimetrix. e) Tecniche convenzionali di imaging, biologia molecolare e biochimica. Questo progetto prevede l uso di tecnologie standard di imaging (in vitro e in vivo), biologia molecolare (produzione di virus ricombinanti), biologia cellulare (trasfezioni, infezioni etc.) e biochimica (proteomica, studi di interazioni proteiche etc). XI

12 MODULO 3 COMPOSIZIONE DEL COSTO DELL UNITÀ OPERATIVA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 5.000, ,00 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc , ,00 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XII

13 MODULO 3 Curriculum Vitae del Responsabile Scientifico dell Unità Operativa (max 1 pagina) (PERIODO DI RIFERIMENTO: ULTIMI 5 ANNI; INDICARE ANCHE LE 10 PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE RITENUTE PIÙ SIGNIFICATIVE, CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A QUELLE DELL AREA TEMATICA SCIENTIFICA SULLA QUALE INSISTE IL PROGETTO) Curriculum Vitae Prof. Pier Giuseppe Pelicci, M.D. - Ph.D. Data di nascita: 5 Settembre 1956 Luogo di nascita: Gubbio (Perugia), Italia Chairman, Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano Direttore Scientifico, Fondazione Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM) Professore Ordinario di Patologia Generale, Università degli Studi di Milano, Milano. ATTIVITA' SCIENTIFICA L'attività di ricerca é documentata da 277 lavori originali e 41 rassegne pubblicati su riviste internazionali e 31 capitoli di libri. L'attività scientifica si é svolta sui seguenti temi: a) Meccanismi del riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline e del recettore delle cellule T e loro impiego nella diagnostica dei disordini linfoproliferativi. b) Analisi delle alterazioni genetiche delle cellule neoplastiche ed interpretazione delle stesse in termini di patogenesi della trasformazione e marcatori tumorali specifici. In particolare sono stati studiati: alterazioni degli oncogeni c-myc e c-myb nei linfomi; alterazioni del gene RAR nella leucemia acuta promielocitica c) Studi clinici e biologici sulla terapia differenziativa con Acido Retinoico delle Leucemie Acute Mieloblastiche e di alcune neoplasie solide. d) Clonaggio del gene Shc e definizione del ruolo della proteina SHC nella trasduzione del segnale da tirosin-chinasi attivate a Ras. e) Meccanismi genetici dell invecchiamento PUBBLICAZIONI 1. Alcalay M, Tiacci E, Bergomas R, Bigerna B, Venturini E, Minardi SP, Meani N, Diverio D, Bernard L, Tizzoni L, Volorio S, Luzi L, Colombo E, Lo Coco F, Mecucci C, Falini B, Pelicci P.G.. Acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic nucleophosmin (NPMc+ AML) shows a distinct gene expression profile characterized by up-regulation of genes involved in stem-cell maintenance. Blood 106(3), , Colombo E, Bonetti P, Lazzerini Denchi E, Martinelli P, Zamponi R, Marine JC, Helin K, Falini B, Pelicci P.G.. Nucleophosmin Is Required for DNA Integrity and p19arf Protein Stability. Mol Cell Biol 25(20), , Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, Santucci A, Bigerna B, Pacini R, Pucciarini A, Liso A, Vignetti M, Fazi P, Meani N, Pettirossi V, Saglio G, Mandelli F, Lo-Coco F, Pelicci P.G., Martelli MF; GIMEMA Acute Leukemia Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. New Engl J Med 352(7), 740, Giorgio M, Migliaccio E, Orsini F, Paolucci D, Moroni M, Contursi C, Pelliccia P, Luzi L, Minucci S, Marcaccio M, Pinton P, Rizzuto R, Bernardi P, Paolucci F, and Pelicci P.G.. Electron Transfer between Cytochrome c and p66shc Generates Reactive Oxygen Species that Trigger Mitochondrial Apoptosis. Cell 122, 1-13, Insinga A, Monestiroli S, Ronzoni S, Gelmetti V, Marchesi F, Viale A, Altucci L, Nervi C, Minucci S, Pelicci P.G.. Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway. Nat Med 11(2), 233, Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, Shing DC, Bonetti P, Luzi L, Volorio S, Bernard L, Pruneri G, Alcalay M, Pelicci P.G.. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Res 66(6), , Mariano AR, Colombo E, Luzi L, Martinelli P, Volorio S, Bernard L, Meani N, Bergomas R, Alcalay M, Pelicci P.G.. Cytoplasmic localization of NPM in myeloid leukemias is dictated by gain-of-function mutations that create a functional nuclear export signal. Oncogene 25(31), , Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F, Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci P.G., Di Croce L. The methyl-cpg binding protein MBD1 is required for PML-RAR{alpha} function. Proc Natl Acad Sci U S A 103(5), , Di Micco R, Fumagalli M, Cicalese A, Piccinin S, Gasparini P, Luise C, Schurra C, Garre' M, Nuciforo PG, Bensimon A, Maestro R, Pelicci PG, d'adda di Fagagna F. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444(7119), , Fazi F, Zardo G, Gelmetti V, Travaglini L, Ciolfi A, Di Croce L, Rosa A, Bozzoni I, Grignani F, Lo-Coco F, Pelicci PG, Nervi C. Heterochromatic gene repression of the retinoic acid pathway in acute myeloid leukemia. Blood 2007 XIII

14 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 1. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Pier Giuseppe Pelicci) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Pier Giuseppe Pelicci struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Chairman Dipartimento di Oncologia Sperimentale indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo piergiuseppe.pelicci@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Recentemente abbiamo perfezionato il protocollo di coltivazione delle cellule epiteliali della ghiandola mammaria (mammosfere) e dimostrato che le mammosfere murine sono in grado di differenziare in cellule duttali e mioepiteliali, quando vengono coltivate in presenza di siero in condizioni di aderenza su collagene e ricostituire la ghiandola mammaria svuotata. E nostra intenzione purificare cellule staminali normali e da mammelle dei topi MMTV-ErbB2/neu, che sviluppano tumori spontanei alla ghiandola mammaria. Utilizzeremo quindi popolazioni staminali purificate per testare la loro sensibilita a inibitori di istone-deacetilasi. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Le cellule mammarie verranno purificate mediante selezione negativa con quattro anticorpi (CD45, CD31, CD140a e TER119) e coltivate in condizione di non adesione (mammosfere). Allo scopo d identificare la cellula o le cellule staminali presenti nella mammosfera, adotteremo una strategia alternativa sfruttando la capacita di tali cellule di rimanere quiescenti dopo la divisione asimmetrica. Per raggiungere tale obiettivo, le cellule epiteliali, purificate come descritto sopra, verranno colorate con il PKH, un colorante che s inserisce nella membrana cellulare e e viene diluito durante le varie divisioni cellulari: in questo modo le cellule che replicano poco (cellule quiescenti) trattengono il colorante e sono localizzate nel centro della mammosfera, rispetto alla maggioranza delle cellule presenti nella periferia che non sono colorate e rappresentano le cellule progenitrici. XIV

15 COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XV

16 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 2. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Saverio Minucci) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Saverio Minucci struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Group Leader indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo saverio.minucci@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il nostro obiettivo e la identificazione di marcatori biologici e molecolari di predizione della risposta clinica agli inibitori di istone-deacetilasi. Lo studio si articolerà in tre fasi principali: Fase 1: Valutazione della attivita biologica, biochimica e molecolare di ciascun farmaco ed identificazione di potenziali marcatori. Fase 2: Valutazione dell espressione dei marcatori di risposta. Fase 3: Validazione della efficacia predittiva dei marcatori selezionati. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) In collaborazione con gli altri gruppi di ricerca afferenti a IEO, questo gruppo ha messo a punto: i) protocolli per colture primarie di carcinomi mammari (popolazioni bulk e staminali), glioblastoma (staminali; in collaborazione con Besta) e leucemie acute mieloidi (LTC-IC e colture in sospensione); ii) modelli animali di topi transgenici per leucemie (con PML- RAR; AML1-ETO e bcr-abl), e tumori mammari (MMTV-erbB2). Il nostro gruppo si dedicherà allo studio dell effetto degli inibitori delle istone deacetilasi in questi modelli, mirando principalmente (mediante l esecuzione sistematica di profili di espressione genica in tumore/normale, in correlazione con la risposta al trattamento con inibitori di HDAC in vitro/in vivo) alla identificazione e successiva validazione di marcatori predittivi di risposta a tali farmaci. Se validati, tali marcatori saranno usati successivamente in studi clinici. XVI

17 COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XVII

18 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 3. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa Susanna Chiocca) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Susanna Chiocca struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Group Leader indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo susanna.chiocca@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Questo gruppo di ricerca si dedicherà alla messa a punto di protocolli per il silenziamento mediante RNAi delle HDAC di classe I (identificazione di sequenze oligonucleotidiche e clonaggio in vettori adeguati), e si dedicherà in collaborazione con gli altri gruppi di ricerca IEO allo studio mediante tali tecnologie del ruolo delle varie HDAC di classe I nel mantenimento del fenotipo tumorale e nella determinazione della sensibilità agli inibitori della istone deacetilasi. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) Studieremo la attivita anti-tumorale di HDACi (VPA e SAHA) nei tumori della mammella, melanomi, glioblastomi e leucemie acute mieloidi. Questi modelli cellulari ed animali verranno usati per identificare (mediante knock-down sistematico delle HDAC di classe I) quali sono le specifiche HDAC coinvolte nel mantenimento del fenotipo tumorale, e nella determinazione della sensitività a VPA e SAHA. In particolare, valuteremo nei modelli ex vivo la capacità proliferativa e differenziativa delle culture primarie tumorali (bulk e staminali) prima/dopo silenziamento, e la capacità tumorigenica in vivo di cellule esprimenti vari oncogeni attivati, prima/dopo il silenziamento delle varie HDAC. Una volta identificate le HDAC chiave, profili di espressione genica mirati tenteranno di identificare marcatori HDAC-specifici, a complemento dei marcatori generali di risposta identificati negli studi effettuati dagli altri gruppi di ricerca. XVIII

19 COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XIX

20 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 4. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Prof. Salvatore Pece) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Prof. Salvatore Pece struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Ricercatore indirizzo : Via Ripamonti, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo salvatore.pece@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il contributo di questa U.O. consistera nell utilizzo di colture primarie a lungo termine e di cellule staminali, isolate da tumori mammari umani, come sistemi-modello pre-clinici di malattia neoplastica per: i) validazione funzionale di specifici meccanismi molecolari, oggetto di studio di questo progetto, quali effettivi bersagli farmacologici anti-tumorali; ii) identificazione e validazione di bio-marcatori per la stratificazione dei pazienti ed il monitoraggio delle terapie molecolari. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) 1. Caratterizzazione di tumori mammari con sovversione funzionale di HDACs e ErbB2, e validazione di bio-marcatori per la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio di terapie molecolari. Saranno usate tecniche di immunoistochimica (valutazione dello stato globale di acetilazione istonica; espressione di ErbB2) e ibridizzazione in situ (FISH per diverse HDACs e ErbB2) su tessuti tumorali inclusi in paraffina. 2. Utilizzo di colture primarie, da tumori previamente caratterizzati per gli specifici bersagli molecolari, per lo studio di fenotipi cellulari (proliferazione, differenziazione, apoptosi) e profili di espressione genica (Affymetrix) in risposta a: i) uso di farmaci con azione molecolare (HDACi, Herceptin); ii) ablazione di bersagli molecolari tramite RNAi. 3. Utilizzo di cellule staminali tumorali per valutare gli effetti dei suddetti farmaci sui programmi di morfogenesi tumorale (saggi di formazione di mammosfere in sospensione e organogenesi tumorale in 3D- matrigel). XX

21 COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XXI

22 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 5. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa Giuseppina Bonizzi) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Giuseppina Bonizzi struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Ricercatore indirizzo : Via Ripamonti, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo salvatore.pece@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il nostro gruppo, negli ultimi anni, ha identificato e validato in vitro e in vivo culture primarie di cellule staminali provenienti da modelli murini di cancerogenesi mammaria. La stessa metodologia è stata applicata con successo a tessuto tumorale umano. La possibilità di discriminare cellule staminali da progenitrici, permetterà di identificare le cellule sensibili ai vari farmaci molecolari e di validare l accuratezza predittiva in modelli di xenotrapianto di nuovi marcatori molecolari identificati. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) 1. Identificazione delle cellule staminali tumorali provenienti da topi MMTV-ErbB2/neu che sviluppano tumori spontanei della mammella. Le cellule epiteliali tumorali verranno colorate con il PKH, seguendo il protocollo da noi validato che permette di discriminare le cellule staminali dai progenitori. Tali cellule verranno trattate con i farmaci molecolari a nostra disposizione descritti sopra in maniera da determinare la cellula sensibile al trattamento e i pathway coinvolti. In vitro tali cellule verranno testate per determinare la sopravvivenza durante trattamento e per identificare nuovi pathway responsabili della resistenza. In parallelo, queste stesse cellule verranno iniettate nel topo secondo le metodiche in uso per valutare la capacità di tali farmaci di inibire la crescita tumorale in vivo. 2. Cellule e pezzi operatori provenienti da tumori mammari umani, verranno xenotrapiantati sottocute in topi immunodeficienti per permettere di identificare l efficacia in vivo di tali farmaci molecolari. L identificazione in vivo dell efficacia di un trattamento permetterà di ottenere la migliore terapia per quel determinato paziente. XXII

23 COMPOSIZIONE DEL COSTO DEL GRUPPO DI RICERCA Voci di costo e breve descrizione Totale di cui a carico dei fondi ministeriali 1. Personale dipendente ,00 NULLA 2. Personale a contratto/consulenza/borsa di studio , ,00 3. Missioni 4. Attrezzature (solo a noleggio o leasing): 5. Materiale di consumo , ,00 _ 6. Pubblicazioni / organizzazione convegni, ecc. 7. Elaborazione dati (specificare) 8. Spese generali delle strutture coinvolte (specificare) , ,00 TOTALE , ,00 XXIII

24 : DESCRIZIONE DEL CONTRIBUTO DI CIASCUN GRUPPO DI RICERCA (Si devono presentare tanti moduli 3bis quanti sono i gruppi di ricerca coinvolti) GRUPPO DI RICERCA: 6. Dipartimento di Oncologia Sperimentale - Istituto Europeo di Oncologia (Dott.ssa Luisa Lanfrancone) RESPONSABILE SCIENTIFICO: nominativo: Dott.ssa Luisa Lanfrancone struttura di appartenenza : Istituto Europeo di Oncologia funzione: Group Leader indirizzo : Via Adamello, Milano N. tel: 02/ N. fax: 02/ indirizzo luisa.lanfrancone@ifom-ieo-campus.it RAPPRESENTANTE LEGALE: nominativo: Dott. Carlo Ciani CONTRIBUTO SPECIFICO FORNITO AL PROGETTO (max 500 caratteri) Il contributo specifico fornito da questo gruppo di ricerca è quello di identificare e caratterizzare nuovi bersagli cellulari e molecolari per un potenziale intervento terapeutico nel melanoma metastatico. Recenti evidenze sperimentali indicherebbero infatti la presenza di una cellula staminale melanocitaria in linee cellulari di melanoma, non considerata quale bersaglio delle attuali terapie. Ulteriori studi sono richiesti per isolare e caratterizzare tale popolazione nel contesto di campioni bioptici di melanoma, oltre che per valutare le eventuali capacità tumorigeniche in vivo e per identificare le molecole coinvolte nei processi di divisione cellulare, proliferazione e differenziazione di queste cellule. Tale popolazione staminale verrà quindi utilizzata per verificare la sensibilità ai farmaci e il loro eventuale meccanismo di azione nel melanoma. METODOLOGIA (max 1000 caratteri) COLTURE PRIMARIE DI CELLULE DI MELANOMA Le biopsie di melanoma verranno suddivise per poter isolare cellule da crescere in aderenza (colture primarie di melanoma) e in sospensione. Una delle caratteristiche, infatti, delle cellule staminali isolate da altri tumori (gliomi, carcinomi della mammella e del polmone) è quella di crescere in assenza di aderenza al substrato, formando aggregati cellulari definiti sfere. Queste sfere (melano-sfere) verranno susseguentemente caratterizzate per l espressione dei marcatori precedentemente identificati, quali il CD20, il CD133 e la nestina. I campioni bioptici di melanoma sono in grado di generare colture continue di cellule in aderenza nel laboratorio del proponente: queste colture verranno quindi caratterizzate per il loro livello di differenziazione e la sensibilità ai farmaci valutata in entrambe le popolazioni. CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA E BIOCHIMICA DELLE CELLULE DI MELANOMA TRATTATE CON I FARMACI I campioni bioptici di melanoma verranno caratterizzati per l espressione, lo stato di attivazione e le alterazioni genetiche di B-Raf e N-Ras. Le vie molecolari implicate nell attivazione di questi oncogeni verranno valutate durante l azione dei farmaci sulle popolazioni cellulari cresciute in coltura. Livelli di attivazione dei recettori tirosin chinatici e integrinici, così come delle loro molecole bersaglio, verrà analizzato mediante studi biochimici e validato inibendo le molecole coinvolte mediante interferenza a RNA. Proliferazione ed apoptosi verranno valutate mediante citofluorimetria con marcatori specifici (Ki-67, caspasi 3 e Tunel assay). MODELLI ANIMALI DI MELANOMA Un modello di attivazione di B-Raf in vivo mediante mutazione V600E è attualmente in corso di preparazione nel laboratorio del proponente. Tale modello verrà utilizzato per generare melanomi murini in vivo ed validare l efficacia dei farmaci usati in vitro. XXIV