CRESCITA MICROBICA scissione binaria cenociti crescita di popolazioni

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1 CRESCITA MICROBICA aumento dei costituenti cellulari che può risultare in: aumento del numero delle cellule e.s., quando un microrganismo si riproduce per gemmazione o per scissione binaria aumento della dimensione delle cellule e.s., i microrganismi cenociti hanno divisioni nucleari che non sono accompagnate da divisioni cellulari i microbiologi in genere studiano la crescita di popolazioni e non di cellule individuali 1

2 Il ciclo cellulare procariotico ciclo cellulare: sequenza di eventi che vanno dalla nascita di una nuova cellula fino alla sua successiva divisione cellulare la maggior parte dei batteri si divide per scissione binaria generazione = processo attraverso cui da una cellula madre se ne formano due figlie 2

3 Scissione binaria 3

4 durante il ciclo cellulare avvengono due processi : replicazione e partizione del DNA citochinesi 4

5 Replicazione e partizione del cromosoma la maggior parte dei cromosomi procariotici è circolare origine di replicazione sito d inizio della replicazione termine sito di arresto della replicazione replisoma gruppo di proteine necessarie per la sintesi del DNA; 5

6 MreB un omologo dell actina eucariotica coinvolto nella determinazione della forma cellulare 6

7 Citochinesi Settazione: processo di formazione di una parete trasversale di divisione tra due cellule Tale processo si compone di 5 fasi: 1. scelta del sito di formazione del setto 2. assemblaggio dell anello Z 3. congiunzione dell anello alla membrana plasmatica 4. assemblaggio dell apparato di sintesi della parete cellulare 5. costrizione dell anello Z e formazione del setto 7

8 Diverse proteine Fts (filamentous temperature sensitive) sono essenziali per la divisione cellulare Un ruolo chiave è svolto dalla proteina FtsZ Rappresenta l elemento di formazione dell anello Z Diverse unità di tale proteina di dispongono ad anello intorno al corpo cilindrico cellulare, nel centro della cellula e diventa il piano di divisione cellulare 8

9 La proteina MinCD agisce da inibitore dell assemblaggio dell anello Z Evita la formazione dell anello Z in una zona non perfettamente al centro della cellula La sintesi di nuovo peptidoglicano richiede la rottura controllata del peptidoglicano esistente da parte delle autolisine e la contemporanea inserzione di precursori peptidoglicanici 9

10 Dinamica di crescita di una popolazione microbica Crescita cellulare = aumento ordinato dei costituenti cellulari Crescita della popolazione = incremento numerico delle cellule di una popolazione microbica Tale aumento è una progressione geometrica in base

11 Tempo di generazione (o tempo di duplicazione) = tempo necessario affinché avvenga una generazione Varia tra i vari microrganismi Dipende da vari fattori, principalmente terreno (nutrienti, ph ecc.) e condizioni di incubazione (T, aerazione) Può avere durata di minuti, ore o giorni In terreni colturali può essere molto più breve di quello che si osserva in ambienti naturali 11

12 Il modello di crescita in cui il numero di cellule raddoppia in un dato intervallo di tempo è chiamato crescita esponenziale Se si riportano su di un grafico su scala aritmetica (lineare) i dati relativi al numero delle cellule in funzione del tempo, si ottiene una curva la cui pendenza aumenta in modo costante 12

13 Se, invece, si riporta il numero di cellule su scala logaritmica (log10) ed il tempo su scala aritmetica, si ottiene un grafico semilogaritmico ed i punti cadono su di una linea retta Le cellule crescono in modo esponenziale 13

14 Nella fase iniziale di crescita la velocità d incremento è, ma aumenta col passare del tempo In un uguale periodo di tempo negli stadi avanzati di sviluppo l incremento è notevole! Esiste una relazione matematica tra il numero di cellule presenti inizialmente in una data coltura ed il numero di cellule presenti dopo un certo periodo di crescita esponenziale N o è il numero di cellule iniziali N t è il numero di cellule al tempo t n è il numero di generazioni avvenute fino al tempo t 14

15 k = n t numero di generazioni nell unità di tempo se la popolazione raddoppia in un determinato tempo t t = g (dove g è il tempo medio di generazione) 15

16 k = n g Sostituendo ad n la sua equazione E ad N t il valore 2N 0 k = 1 g e quindi g = 1 k g = t n 16

17 il tempo medio di generazione può essere determinato direttamente dal grafico semilogaritmico 17

18 Ciclo di crescita Oltre alla fase esponenziale, la crescita batterica, in un contenitore chiuso si caratterizza per altre fasi Una condizione di coltura in batch non permette una crescita infinita - terminano i nutrienti - si accumulano le sostanze di scarto - limitazione spaziale 18

19 Si può così graficare la curva di crescita batterica, ma si può applicare anche agli eucarioti che si moltiplicano per scissione binaria Tale curva si può costruire se si verificano tre condizioni: coltura chiusa, terreno liquido,scissione binaria E riferita ad una popolazione, non ad una singola cellula!!!! 19

20 1. Fase di latenza Non si osserva subito la crescita di un inoculo batterico in un terreno fresco Intervallo di tempo più o meno lungo e dipende: -tipo di inoculo -natura del terreno La cellula è comunque biosinteticamente attiva -nuovi componenti cellulari -produzione di enzimi 20

21 2. Fase di esponenziale La durata è variabile e dipende da: - terreno colturale - condizioni ambientali - caratteristiche genetiche dei microrganismi Sulla base del rapporto superficie/volume i procarioti crescono più rapidamente degli eucarioti In questa fase i microrganismi si trovano nel loro migliore stato di salute e le popolazioni mostrano la massima uniformità di proprietà fisiologiche Può arrivare ad un massimo, in genere, di circa 10 9 cellule/ml 21

22 Questa fase rappresenta un esempio di crescita bilanciata, in cui tutti i componenti sono sintetizzati a velocità costanti e coordinate Se cambia una determinata condizione intrinseca al terreno o un parametro ambientale la crescita diventa non bilanciata Il tasso di sintesi dei componenti cellulari varia fino a che non si raggiunge un nuovo equilibrio - shift-up (da terreno povero a terreno ricco) - shift-down (da terreno ricco a terreno povero) 22

23 3. Fase stazionaria Non si osserva variazione del numero di cellule Non c è crescita netta anche se continuano a funzionare metabolismi energetici e processi biosintetici Alcune cellule si moltiplicano, ma altre muoiono e si verifica la crescita criptica (duplicazione e morte si bilanciano), quindi il numero delle cellule vitali è costante) Può accadere per diversi motivi: -scarsità di nutrienti -accumulo di metaboliti tossici -mancanza di spazio (le cellule sentono la presenza delle altre) ad esempio le cellule eucariotiche entrano in tale fase ad un numero < alle procariotiche = livello critico di densità cellulare 23

24 In condizioni di mancanza di nutrienti i batteri possono produrre delle starvation proteins Permettono una > resistenza ai danni cellulari -aumento del numero di legami crociati del peptidoglicano -legano il DNA -proteggono le proteine dalla denaturazione In questa fase possono anche essere prodotte le spore 24

25 4. Fase di morte E anch essa una fase esponenziale varie ipotesi: 25

26 Misurazione della crescita microbica Si possono contare le cellule (metodi diretti) - conta totale - conta vitale - colonie su membrana filtrante Si può misurare la massa cellulare (metodi indiretti) - determinazione del peso secco - determinazione del peso umido - analisi chimica di un costituente cellulare (C o N) - torbidità delle sospensioni cellulari 26

27 Conta diretta al microscopio Si contano tutte le cellule vive e morte Si può effettuare su campioni essicati utilizzando i normali vetrini e su sospensioni cellulari utilizzando le camere di conta 27

28 La camera di conta più usata è la camera di Petroff-Hausser Lo spazio tra reticolo e vetrino è di 0.02 mm Il reticolo è formato da 25 quadrati grandi con un area totale di 1 mm 2 e volume totale di 0.02 mm 3 Calcolo cellule/ml Si contano le cellule presenti in un quadrato grande per volta, si fa la media di più quadrati grandi 16 x 25 x 50 x cellule/mm cellule/mm cellule/ml 28

29 Conta diretta al microscopio Contatori elettronici (Coulter Counter) utili per grandi microrganismi e per cellule del sangue, ma non per i procarioti la sospensione microbica è forzata attraverso un piccolo orificio il movimento del microorganismo attraverso l orificio provoca una caduta di tensione elettrica si contano queste cadute di corrente 29

30 Limiti della conta diretta al microscopio Non fornire una stima delle cellule vive Le cellule molto piccole sfuggono alla conta La stima è altamente imprecisa E necessaria la colorazione del campione ed alcune cellule sfuggono In alternativa è necessario il microscopio a contrasto di fase Inadeguata per campioni poco concentrati Le cellule non devono essere mobili 30

31 Conta vitale o conta in piastra Una cellula vitale è una cellula in grado di dividersi e generare una progenie Una conta vitale permette di determinare il numero delle cellule di un campione in grado di formare colonie su di un opportuno terreno agarizzato Il presupposto di questa metodologia è che ogni colonia sia originata (almeno) da una singola cellula vitale 31

32 Trattamento del campione Il campione da analizzare per il contenuto microbico deve essere diluito affinché un numero appropriato ( contabile ) di colonie sia presente in piastra Il risultato sarà riferito a: -unità di peso per i campioni solidi (grammo) -unità di volume per i campioni liquidi (millilitro) -unità di superficie per le superfici campionate (centimetro quadro) -unità di volume per l aria (litro) 32

33 Affinché l aliquota prelevata sia rappresentativa dell intero campione, nel caso di matrici solide si preleva una quantità di campione compresa tra 10 e 25g Per le matrici liquide si preleva una quantità di campione più bassa, generalmente tra 1 e 10ml Per le superfici si impiegano delle mascherine che delimitano un area nota Per l aria si usano dei campionatori ad impatto 33

34 SCHEMA OPERATIVO -omogenizzazione del campione (1 a diluizione) -allestimento diluizioni seriali (o scalari) in base 10 -piastramento -incubazione -conteggio 34

35 I campioni vengono diluiti in soluzioni isotoniche con le cellule: -soluzione fisiologica (nella >parte dei casi), NaCl 8.5-9g/l -H 2 O peptonata, peptone 1g/l -soluzione di sodio-citrato -tampone fosfato -soluzione Ringer La prima diluizione dei campioni solidi prevede una omogenizzazione mediante stomacher, omogenizzatore a coltelli rotanti o beuta frangiflutto 35

36 La prima diluizione dei campioni liquidi, viene preparata generalmente in beuta con volumi grandi, oppure, dopo intensa agitazione, può anche essere effettuata direttamente in provetta Tutte le diluizioni (la prima e le successive) vengono preparate con lo stesso criterio, una parte di campione e 9 parti di diluente Dalla seconda diluizione in avanti l omogenizzazione della sospensione avviene mediante vortex I trasferimenti si effettuano con pipette graduate o puntali sterili e con filtro 36

37 Diluizione seriale 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 a diluizione 3 a diluizione 4 a diluizione 5 a diluizione 6 a diluizione 1 a diluizione 1/100 (10-2 ) 1/1.000 (10-3 ) 1/ (10-4 ) 1/ (10-5 ) 1/ (10-6 ) 1/10 (10-1 ) 37

38 Inoculo e conta in piastra L inoculo delle piastre viene effettuato in maniera a seconda del metodo che si segue Esistono due metodi per eseguire una conta in piastra: -piastramento per spatolamento (o spandimento o in superficie), generalmente usato per i microrganismi aerobi -piastramento per inclusione, generalmente usato per i microrganismi anaerobi spatolamento 0.1 ml inclusione 1 ml 38

39 incubatore 39

40 Piastramento ed incubazione 4 a diluizione (10-4 ) 5 a diluizione (10-5 ) 6 a diluizione (10-6 ) Non contabili 44 5 Dopo incubazione 40

41 Conteggio delle colonie ed espressione del risultato La pratica statisticamente più valida prevede che le piastre da contare siano quelle contenenti un numero di colonie comprese tra 30 e 300 (inclusione) e tra 20 e 200 (spatolamento) A numeri troppo elevati non c è significatività di conteggio per la coalescenza, eccessivo affollamento che impedisce sviluppo di colonie, colonie satelliti Numeri troppo bassi non sono significativi a prescindere Per una maggiore significatività statistica del risultato si effettuano più repliche della conta (doppio o triplo) e si fa la media delle tre piastre contenenti il range numerico sopra riportato nell esempio: 44 (colonie) x 10 5 (fattore di diluizione) = 4.4 x 10 6 UFC/ml (g) Se si tratta di spatolamento si moltiplica ancora per 10 = 4.4 x 10 7 UFC/ml (g) 41

42 Monitoraggio microbiologico delle superfici Il prelievo della superficie viene effettuato con l ausilio di appositi tamponi (bastoncini con ovatta) sterili L area da analizzare (in genere si campiona un area compresa tra 20 e 100 cm 2 ) è delimitata da una mascherina (delimitatore, riquadro vuoto) di un materiale resistente alla corrosione e al calore (es. acciao) Il tampone deve essere spezzato facilmente (in cotone sintetico, es. rayon) perché viene poi inserito in una provetta per la prima diluizione 42

43 Calcolo della concentrazione per unità di superficie (cm 2 ) C1 + C2 Vol iniz sosp (ml) 1 1 x x x = CFU/cm 2 2 Area (cm 2 ) diluizione Vol sosp sagg (ml) 43

44 Monitoraggio microbiologico dell aria Esistono metodi Il più comune impiega il campionatore ad impatto Lo strumento aspira un determinato volume di aria in un tempo stabilito, in genere 10 minuti per un m 3 = 1000 litri Tale volume è direttamente convogliato su una piastra contenente il terreno di coltura 44

45 Fonti di errore della conta vitale Il numero delle colonie dipende da una molteplicità di fattori: -dalla vitalità delle cellule -dal terreno di coltura -dalle condizioni di incubazione -dal periodo di incubazione La conta, di per sé, è soggetta ad un ampio margine di errore: -pipettamento non accurato -campione non omogeneo (1 a diluizione) -insufficiente rimescolamento (dalla 2 a diluizione in poi) La conta vitale è sempre una sottostima della reale popolazione microbica di un campione soprattutto delle popolazioni sottodominanti Non esiste un terreno in grado di permettere lo sviluppo di tutti i microrganismi presenti in una nicchia ecologica 45

46 MPN o conta più probabile in liquido MPN (most probable number) è utile quando il numero dei microrganismi è molto basso Permette il conteggio di microrganismi in grado di sviluppare in un opportuno terreno liquido È una tecnica basata sulla stima, in termini statistici, del numero di microrganismi che è più probabile siano presenti nel campione Tale metodo afferma che esiste il 95% di probabilità che la popolazione microbica rientri in un determinato intervallo 46

47 Principio: si inoculano più tubi. Ad una determinata diluizione si avranno alcuni tubi in cui è avvenuta crescita. Per le diluizioni precedenti tutti i tubi presentano crescita, mentre per le diluizioni successive tutti i tubi sono negativi Dalla combinazione dei tubi positivi e negativi è possibile risalire al numero più probabile di microrganismi per g o ml di campione. 47

48 Si usa prevalentemente per i batteri nitrificanti chemiolitoautotrofi e per i coliformi (H 2 O e latte).per i clostridi butirrici (settore caseario) 48

49 Campione non diluito 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 a diluizione (10-1 ) 2 a diluizione (10-2 ) 3 a diluizione (10-3 ) 4 a diluizione (10-4 ) 5 a diluizione (10-5 )

50 Si usano delle tabelle statistiche (di McCrady) per trasformare la tripletta in valore di MPN Nel nostro caso abbiamo 0.93 batteri in 1 ml (per ciascun tubo della diluizione 10-3 ), da cui: 0.93 x 10 3 = 9.3 x 10 2 batteri per ml di campione non diluito 50

51 Vantaggi del metodo MPN È un metodo sensibile per basse concentrazioni Con particolari accorgimenti (substrati fluorogenici) è possibile ottenere risultati in poche ore È facile da usare con substrati selettivi Svantaggi del metodo MPN È molto meno preciso delle conte in piastra È molto più laborioso e può essere costoso 51

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53 Metodo della membrana filtrante Metodo usato per le analisi delle acque o dei liquidi non viscosi Il liquido da esaminare viene filtrato mediante apposite membrane filtranti con cut-off tali (0.20 μm) da non fare passare i batteri che restano intrappolati sulla superficie delle stesse Le colonie sviluppano sulla superficie di queste membrane dopo trasferimento su terreni agarizzati 53

54 Metodi indiretti Peso secco -richiede tempo e non è molto sensibile Quantificazione di un particolare costituente cellulare -utile se la quantità di sostanza è costante in ogni cellula Misure torbidimetriche (deviazione della luce) -veloci, facili e sensibili 54

55 Misurazioni della torbidità Una soluzione appare torbida perché ogni cellula riflette la luce Più cellule, più luce riflessa, più torbidità La torbidità può essere misurata mediante colorimetro o spettrofotometro Si misura la quantità di luce non riflessa che riemerge dopo passaggio nella sospensione I due strumenti si differenziano per il modo in cui viene generata la luce incidente: -unico filtro nel colorimetro -prisma nello spettrofotometro 55

56 La diminuzione della luce non riflessa dovuta all aumento del numero di cellule è misurata in unità colorimetriche o in unità di densità ottica (OD), rispettivamente con colorimetro e spettrofotometro Per ottenere una stima del numero di cellule si deve prima preparare una curva standard per ciascun microrganismo 56

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58 Colture continue di microrganismi crescita in un sistema aperto (ambiente costante per lunghi periodi) continua fornitura di nutrienti Volume costante continua rimozione dei rifiuti mantenimento delle cellule in fase log con una concentrazione di biomassa costante per lunghi periodi realizzato usando un sistema di coltura continua fondamentale per studi fisiologici studio della crescita microbica a contentrazioni di nutrienti molto basse, vicine a quelle che si osservano negli ambienti naturali 58

59 Una volta raggiunto l equilibrio, volume, numero di cellule e concentrazione di sostanze nutritive sono costanti Stato di equilibrio (steady state) 59

60 chemostato 60

61 Il chemostato è l apparecchiatura più comunemente utilizzata Controlla contemporaneamente velocità di crescita e densità di popolazione di una coltura Il terreno sterile passa nella camera di crescita alla stessa velocità con cui il terreno contenente microrganismi viene sottratto Il controllo è dettato da due parametri: -velocità di diluizione (controlla la velocità di crescita) -concentrazione di un nutriente limitante (controlla la densità di popolazione) 61

62 il chemostato funziona al meglio ad un tasso di diluizione 62

63 Il turbidostato è dotato di una fotocellula che misura la torbidità (assorbanza) della coltura regola il tasso del flusso del terreno attraverso il contenitore per mantenere una torbidità o una densità cellulare predeterminata il turbidostato funziona meglio ad alto tasso di diluizione 63

64 Effetti ambientali sulla crescita dei microrganismi in un dato ambiente (espressione delle caratteristiche fisiche e chimiche dell ambiente) soluti e attività dell H 2 O ph temperatura O 2 pressione radiazioni 64

65 attivita dell acqua rapporto tra la tensione di vapore acqueo di una matrice (P) e la tensione di vapore dell acqua pura (P 0 ) alla stessa temperatura a w p p 0 0 < a w < 1 a w di una soluzione è 1/100 dell umidità relativa a w RH 100 a w = misura della quantità di acqua disponibile per l organismo 65

66 L H 2 O di una data matrice può essere non disponibile per i microrganismi perché: contiene soluti disciolti come sali o zuccheri: - interazione con le molecole di soluto (effetto osmotico) - maggiore [soluto] minore a w è cristallizzata sotto forma di ghiaccio; è presente come acqua di idratazione; è assorbita dalle superfici Valori di a w ottimali per diversi gruppi microbici BATTERI = 0,990-0,995 LIEVITI = 0,870 MUFFE = 0,700 66

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68 Effetto dei soluti sull a w 68

69 Effetti dei soluti sui microrganismi Alofili, crescita ottimale a >0.2 M Alofili estremi, richiedono >2 M 69

70 molti organismi osmotolleranti e alofili utilizzano soluti compatibili per la loro concentrazione osmotica interna soluti compatibili con il metabolismo e la crescita. le concentrazioni non interferiscono con le normali funzioni citoplasmatiche Molecole solubili sprovviste di carica netta a ph fisiologico che non aderiscono e non reagiscono con macromolecole intracellulari. Aminoacidi o derivati: prolina, glicin-betaina e carnitina; zuccheri (saccarosio) o alcoli (glicerolo) I microrganismi alofili conservano l equilibrio osmotico mantenendo una concentrazione di KCl nel citoplasma uguale a quella extracellulare: meccanismo dell accumulo di sale nel citoplasma Gli organismi osmotolleranti accumulano tali soluti con un meccanismo a 2 fasi: - [K+] e glutammato - [soluti compatibili] 70

71 Gli alofili estremi possiedono proteine e membrane che richiedono elevate concentrazioni di soluto per la loro stabilità ed attività 71

72 ph il ph (potential of hydrogen) è il logaritmo negativo della concentrazione idrogenionica (ph = -log 10 [H + ]) 72

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74 Rispetto all optimum di crescita, i microrganismi riescono a sviluppare in intervalli di ph di circa 2-3 unità 74

75 I microrganismi reagiscono a fluttuazioni del ph esterno con meccanismi che mantengono il ph citoplasmatico neutro Anche per basofili e acidofili il ph intracellulare tende alla neutralità anche se non come i neutrofili I neutrofili scambiano H + con K + Gli alcalofili scambiano Na + con H + Alcuni microrganismi modificano il ph del loro ambiente producendo acidi o basi Alcuni microrganismi producono proteine da shock (acid-shock proteins). L omeostasi può essere garantita anche da sistemi tampone intracellulari 75

76 Nelle colture in batch il ph tende a modificarsi per il normale metabolismo cellulare che consuma e produce sostanze acide o basiche Ai terreni colturali vengono aggiunte delle sostanze tamponanti (buffer) che evitano bruschi cambiamenti di ph Il tampone più usato per terrni con ph vicino alla neutralità ( ) è il tampone fosfato (KH 2 PO 4 ) 76

77 Temperatura La temperatura è uno dei parametri ambientali più importanti Benché non possano crescere a T troppo o troppo possono sopravvivere in un range di valori che varia tra i microrganismi Essa può influenzare i microrganismi in diversi modi Al suo aumentare le reazioni chimiche procedono ad una velocità > e la crescita è più rapida, ma non oltre un certo limite In generale, le basse temperature ne rallentano o ne bloccano la crescita, le alte temperature li distruggono 77

78 Temperature cardinali 78

79 T minima. Al di sotto di questa T non si ha crescita. Avviene la gelificazione delle membrane, che essendo alterate non consentono più, o molto lentamente, il trasporto dei materiali all interno della cellula ed il trasporto H +, non rendendo possibile la crescita T ottimale. T alla quale si ha il massimo tasso di crescita. In genere la temperatura ottimale ha un range piuttosto ampio, anche di 5-7 C T massima. T al di sopra della quale non vi è più crescita in quanto gli enzimi sono denaturati e le proteine e i lipidi di membrana sono danneggiati in modo irreversibile. Si ha il collasso della membrana e lisi termica 79

80 Classificazione dei microrganismi in funzione della T In funzione della T ottimale ed, in generale del range di T, di crescita, si distinguono 5 gruppi principali di microrganismi 80

81 psicrofili da 0 a 20 C con optimum a 15 C psicrotrofi da 0 a 35 C con optimum tra C mesofili da 15 a 45 C con optimum tra C termofili da 45 a ~ 80 C con optimum tra C ipertermofili da 70 a oltre i 100 C con optimum tra 80 C e oltre 81

82 Adattamento dei microrganismi Psicrofili: Producono enzimi che vengono facilmente denaturati a T mesofile Tali enzimi hanno una particolare conformazione che permette loro di essere flessibili alle T (contengono + AA polari e AA idrofobici) Le membrane hanno un maggior numero di acidi grassi insaturi (mantengono la fluidità) ed alcuni poliinsaturi 82

83 Adattamento dei microrganismi Termofili: Gli enzimi non differiscono molto da quelli dei mesofili ma contengono alcuni AA, detti critici, in alcuni punti dell enzima che ne modifica la struttura quaternaria evitando la denaturazione termica la struttura proteica è stabilizzata in molti modi: > quantità di legami H > quantità di legami ionici > quantità di prolina che rende le proteine - flessibili > quantità di chaperonine le proteine histone-like stabilizzano il DNA le membrane sono stabilizzate in molti modi lipidi più saturi, più ramificati e di peso molecolare maggiore legami etere (membrane degli Archeobatteri) 83

84 Ossigeno Molti microrganismi non crescono in presenza di O 2 L importanza dell O 2 è legata al metabolismo energetico di un microrganismo In relazione alle richieste dei O 2 si distinguono 5 gruppi di microrganismi 84

85 aerobi obbligati. Met. en. respirazione aerobica (Pseudomonas spp., Bacillus spp., molti funghi e lieviti) anaerobi obbligati. Met. En. respirazione anaerobica e fermentazione (Clostridium spp.) anaerobi facoltativi: Met. en. respirazione aerobica, anaerobica e fermentazione (Lieviti, Salmonella, E. coli) microaerofili. Met. en. respirazione aerobica (Campylobacter spp.) anaerobi aero-tolleranti. Met. en. fermentazione (la >parte dei batteri lattici) 85

86 Perché l O 2 è tossico? L O 2 può inattivare alcune proteine La riduzione dell O 2 ad H 2 O richiede l aggiunta di e -. Il processo si verifica gradualmente e si possono produrre numerosi prodotti secondari dell O 2 che risultano tossici per le cellule 86

87 Sistemi protettivi Molti microrganismi possiedono enzimi in grado di proteggerli dagli effetti tossici 87

88 Saggio della catalasi 88

89 La crescita degli aerobi in laboratorio richiede una buona aerazione, l O 2 consumato dai microrgannismi deve essere velocemente rimpiazzato: -ventilazione degli incubatori per i terreni solidi -i terreni liquidi si tengono in agitazione su agitatori oscillanti o orbitanti oppure si insuffla aria sterile 89

90 Per la crescita degli anaerobi in laboratorio è fondamentale disporre di sistemi che eliminino l O 2 La sensibilità all O 2 dell aria può essere variabile Si possono usare sistemi: -terreni contenenti agenti riducenti come il tioglicolato -uso di una pompa da vuoto per rimuovere l aria -uso di atmosfere modificate di N e CO 2 -sistema GasPack 90

91 Per anaerobi altamente sensibili all O 2 si utilizzano le cabine anaerobiche per la manipolazione 91

92 Pressione Numerosi microrganismi hanno come habitat naturale le profondità marine I barotolleranti sono colpiti dall aumento della pressione ma non così gravemente come lo sono gli organismi non barotolleranti I microrganismi barofili necessitano o crescono più rapidamente in presenza di alta pressione I barofili estremi non crescono sotto le 400 atm -possiedono una membrana ricca di acidi grassi insaturi che quindi è molto fluida ed è soggetta a variazioni di conformazione sotto P 92

93 Radiazioni 93

94 radiazioni ionizzanti raggi x e γ mutazioni morte Danni da radiazioni distruggono la struttura chimica di molte molecole, compreso il DNA il danno può essere riparato dai meccanismi di riparazione del DNA radiazione ultravioletta (UV) mutazioni morte causa la formazione di dimeri di pirimidina nel DNA il danno può essere riparato dai meccanismi di riparazione del DNA (fotoriattivazione, riattivazione al buio, sistema SOS)) luce visibile (l energia luminosa è assorbita da fotosensibilizzatori) ad alta intensità genera ossigeno singoletto ( 1 O 2 ) potente agente ossidante pigmenti carotenoidi proteggono molti microrganismi esposti alla luce dalla fotossidazione 94

95 Crescita microbica in ambienti naturali gli ambienti microbici sono complessi, cambiano costantemente spesso contengono una bassa concentrazione di nutrienti (ambiente oligotrofico) i microrganismi possono essere esposti a gradienti sovrapposti di nutrienti e di fattori ambientali Legge di Liebig del minimo la biomassa totale di un organismo è determinata dal nutriente presente alla concentrazione più bassa Legge di Shelford della tolleranza sopra o sotto certi limiti ambientali, indipendentemente dalle quantità e dai nutrienti forniti, un microrganismo non crescerà 95

96 Ambienti oligotrofi gli organismi diventano più competitivi nella captazione di nutrienti e nell uso delle risorse disponibili cambiamenti morfologici per aumentare l area superficiale e la capacità di assorbire i nutrienti Graduale disattivazione del metabolismo meccanismi di competizione -alcuni nutrienti sono complessati e non disponibili per i competitori -velocità di crescita -efficienza dell utilizzazione dei nutrienti -capacità di utilizzare un ampia varietà di substrati metabolici -mobilità -produzione di sostanze tossiche 96