MONOLISA Anti-HCV PLUS Version 2

MONOLISA Anti-HCV PLUS Version 2 1 piastra - 96 tests 72317 5 piastre - 480 tests 72318 KIT PER IL MONITORAGGIO DEGLI ANTICORPI ANTI-HCV (VIRUS DELL'EPATITE C) NEL NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO MEDIANTE TECNICA DI IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO IVD Controllo di qualità del produttore Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società BIO-RAD sono sottoposti ad un sistema di assicurazione di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ciascun lotto di prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e viene messo in commercio soltanto se risulta conforme ai criteri di accettazione. La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata negli archivi della nostra società. 45

SOMMARIO 1 - SCOPO DEL DOSAGGIO 2 - PRINCIPIO DEL METODO 3 - COMPOSIZIONE DEL KIT 4 - MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO 5 - ISTRUZIONI PER L'IGIENE E LA SICUREZZA 6 - PRECAUZIONI 7 - CAMPIONI 8 - RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI VALIDITÀ - CONSERVAZIONE 9 - PROCEDURA 10 - ADATTAMENTO 11 - CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 12 - VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEL CONIUGATO 13 - CARATTERISTICHE DEL METODO 14 - LIMITI DEL METODO 15 - BIBLIOGRAFIA 46

1 - SCOPO DEL DOSAGGIO MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2 è una tecnica immunoenzimatica di tipo indiretto per il monitoraggio degli anticorpi associati a un'infezione da virus dell'epatite C nel siero o nel plasma umano. 2 - PRINCIPIO DEL METODO MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2 si basa sull'impiego di una fase solida preparata con antigeni purificati: tre proteine ricombinanti prodotte da E.coli a partire da cloni selezionati nella regione non strutturale (NS3 e NS4) e nella regione strutturale del genoma del virus dell'epatite C e di una fase liquida (coniugato) costituito da anticorpi di capra anti-igg umane purificati mediante cromatografia di affinità e legati alla perossidasi. Il test va eseguito attenendosi alle fasi di reazione seguenti : 1) Nei pozzetti vengono distribuiti sia i campioni da esaminare sia i sieri di controllo. Se sono presenti anticorpi anti-hcv, questi si legano agli antigeni fissati sulla fase solida. 2) Dopo il lavaggio, vengono aggiunti gli anticorpi anti-igg umane marcati con perossidasi. Questi si fissano a loro volta agli anticorpi specifici trattenuti sulla fase solida. 3) Dopo l'eliminazione del coniugato enzimatico non legato, il complesso antigene-anticorpo viene rivelato per aggiunta del substrato. 4) Una volta arrestata la reazione, la lettura si esegue sull'apparecchio spettrofotometrico a 450/620-700 nm. L'assorbenza misurata per un campione consente di determinare la presenza o assenza di anticorpi anti-hcv. L'intensità della colorazione è proporzionale alla quantità di anticorpi anti-hcv legati alla fase solida. 3 - COMPOSIZIONE DEL KIT ETICHET NATURA DEI REAGENTI PRESENTAZIONE -TATURA 1 piastra 5 piastre R1 MICROPIASTRA : 12 strisce da 8 pozzetti sensibilizzati 1 5 con 3 antigeni ricombinanti purificati specifici dell'epatite C R2 SOLUZIONE DI LAVAGGIO : 1 flacone 2 flaconi concentrata 10 volte Tampone Tris NaCl ph 7,4 100 ml 2 x 250 ml contenente l'1% di Tween 20 Conservante : Thimerosal (0,01%) R3 SIERO DI CONTROLLO NEGATIVO : 1 flacone 1 flacone Siero umano negativo all'ag HBs, agli anticorpi anti-hiv1 1 ml 3 ml e anti-hiv-2 e agli anticorpi anti-hcv Conservante : Azide di sodio (< 0,1 %) R4 SIERO DI CONTROLLO POSITIVO : 1 flacone 1 flacone Siero umano contenente anticorpi anti-hcv e negativo per l'antigene 1 ml 3 ml HBs e per gli anticorpi anti-hiv1 e anti-hiv2, inattivato fotochimicamente Conservante : Azide di sodio (< 0,1 %) R6 DILUENTE PER CAMPIONI : 1 flacone 2 flaconi Soluzione di latte scremato : tampone PBS addizionato con colorante 15 ml 2 x 40 ml di controllo del deposito campione Conservante : Azide di sodio (< 0,1 %) e Thimerosal (0,01%) R7 CONIUGATO : 1 flacone 2 flaconi Anticorpi di capra anti-igg umane marcati con la perossidasi 15 ml 2 x 40 ml Conservante : Thimerosal (0,01%) R8 TAMPONE SUBSTRATO DELLA PEROSSIDASI : 1 flacone 2 flaconi Soluzione di acido citrico e acetato di sodio ph 4,0 60 ml 2 x 60 ml contenente 0,015% di H 2 O 2 e 4% di dimetilsulfosside (DMSO) R9 CROMOGENO : 1 flacone 2 flaconi Soluzione contenente tetrametil benzidina (TMB) 5 ml 2 x 5 ml R10 SOLUZIONE DI ARRESTO : 1 flacone 3 flaconi Soluzione di acido solforico 1N 28 ml 3 x 28 ml PELLICOLE ADESIVE x 4 x 12 47

4 - MATERIALE NECESSARIO, MA NON FORNITO Acqua distillata o completamente demineralizzata. Candeggina e bicarbonato di sodio. Carta assorbente Guanti mono-uso Occhiali di protezione Provette mono-uso Pipette automatiche o semi-automatiche regolabili o fisse atte a distribuire 20 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl e 1 ml Provette graduate da 10 ml, 200 ml e 1000 ml. Agitatore tipo vortice. Sistema di lavaggio automatico*, semi-automatico* o manuale per micropiastre. Bagnomaria o incubatore a secco*, eventualmente dotato di termostato a 37 C ± 1 C. Contenitore per rifiuti contaminati. Apparecchio per la lettura* di micropiastre (dotato di filtro 450/620-700 nm). (*) Consultarci per informazioni precise riguardo agli apparecchi approvati dai nostri servizi tecnici 5 - ISTRUZIONI PER L'IGIENE E LA SICUREZZA Tutti i reagenti contenuti nel kit sono destinati all'uso diagnostico "in vitro". Indossare guanti mono-uso per maneggiare i reagenti e i campioni e lavarsi le mani con cura dopo la manipolazione. Non "pipettare con la bocca". Il controllo positivo è stato inattivato fotochimicamente. Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo negativo (R3) è stato sottoposto a test ed è risultato non reattivo all'antigene di superficie del virus dell'epatite B (Ag HBs), agli anticorpi diretti contro il virus dell'epatite C (anti-hcv) e agli anticorpi diretti contro il virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv-1 e anti-hiv-2). Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo positivo (R4) è stato sottoposto a test ed è risultato non reattivo all'antigene di superficie del virus dell'epatite B (Ag HBs), e agli anticorpi diretti contro il virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv-1 e anti-hiv-2). Poiché nessun metodo di controllo finora conosciuto può dare la certezza assoluta dell assenza di agenti infettivi, considerare sia i reagenti sia tutti i campioni prelevati dai pazienti come potenzialmente infettivi e maneggiarli con le precauzioni d uso Nessun metodo può garantire in maniera assoluta l assenza di virus HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Considerare sia i reagenti di origine umana sia i campioni dei pazienti come potenzialmente infettivi e maneggiarli con le precauzioni d'uso. Considerare sia il materiale a diretto contatto con i campioni sia i reagenti di origine umana sia le soluzioni di lavaggio come prodotti contaminati. Evitare schizzi di campioni o di soluzioni che li contengono. Le superfici sporche devono essere pulite con candeggina diluita al 10 %. Se il liquido contaminante è un acido, le superfici sporche devono essere neutralizzate preventivamente con bicarbonato di sodio, poi lavate con candeggina e asciugate con carta assorbente. Il materiale utilizzato per pulire dovrà essere gettato in un contenitore speciale per residui contaminati. I campioni dei pazienti, i reagenti di origine umana come pure i materiali e i prodotti contaminati devono essere eliminati dopo essere stati decontaminati - o mediante immersione in candeggina in concentrazione finale del 5 % di ipoclorito di sodio per 30 minuti, - oppure mediante autoclavaggio a 121 C per un minimo di 2 ore. ATTENZIONE : non introdurre nell'autoclave soluzioni contenenti ipoclorito di sodio. Evitare qualunque contatto del tampone substrato, del cromogeno e della soluzione di arresto con la pelle e le mucose. Su richiesta sono disponibili schede di sicurezza. Non dimenticare di neutralizzare e/o autoclavare le soluzioni o i residui dei lavaggi o qualunque liquido contenente campioni biologici prima di eliminarli nel lavello. Taluni reagenti contengono azide di sodio. Questo composto, a contatto con le tubature di piombo o rame può formare azoturi metallici ad alto potere esplosivo. Onde evitare l'accumulo di detti azoturi nelle tubazioni durante l'eliminazione di questi reagenti in un lavello, neutralizzare i reagenti e lavare il lavello con abbondante acqua. 48

6 - PRECAUZIONI La qualità dei risultati dipende dal rispetto delle buone pratiche di laboratorio di seguito riportate : Non utilizzare reagenti scaduti. Non mescolare reagenti di lotti diversi nel corso di uno stesso dosaggio. NOTA : È possibile utilizzare altri lotti di soluzione di lavaggio (R2, indicata 10 x in blu sull etichetta), di tampone substrato (R8, indicato con TMB buf. in blu), di cromogeno (R9, identificato con TMB 11x. in viola) e di soluzione di arresto (R10, indicata con 1N in rosso) diversi da quelli inclusi nel kit con riserva di utilizzare un solo e unico lotto nel corso dello stesso dosaggio. Detti reattivi possono essere utilizzati con altri prodotti della nostra ditta. Contattare il nostro servizio di assistenza tecnica per informazioni dettagliate. Prima dell'utilizzo, attendere 30 minuti affinché i reagenti ritornino alla temperatura ambiente. Ricostituire con attenzione i reagenti evitando qualunque contaminazione. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi, alcalini, aldeidi) o di polveri che potrebbero alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare recipienti di vetro perfettamente lavati e risciacquati con acqua distillata o preferire materiale mono-uso. Non lasciare che la micropiastra si asciughi tra la fine del lavaggio e la distribuzione dei reagenti. La reazione enzimatica è molto sensibile a tutti i metalli o ioni metallici. Di conseguenza, nessun elemento metallico deve venire a contatto con le diverse soluzioni contenenti il coniugato o la soluzione substrato. La soluzione di rivelazione (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La presenza di una colorazione diversa nei minuti successivi alla ricostituzione indica che il reagente è inutilizzabile e deve essere sostituito. Per questa preparazione utilizzare preferibilmente recipienti e materiale in plastica mono-uso distribuiti in commercio o recipienti in vetro precedentemente lavati con acido cloridrico 1N, risciacquati con acqua distillata e asciugati. Conservare la soluzione al riparo dalla luce. Utilizzare un cono di distribuzione nuovo per ciascun siero. Il lavaggio dei pozzetti costituisce una fase essenziale della manipolazione. Rispettare il numero di cicli di lavaggio prescritti e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti, poi svuotarli del tutto. Un lavaggio eseguito male può produrre risultati errati. Non utilizzare mai lo stesso recipiente per distribuire il coniugato e la soluzione di rivelazione. 7 - CAMPIONI Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche d'uso. I test vengono eseguiti su campioni non diluiti di siero o di plasma (prelevati con anticoagulanti come EDTA, eparina, citrato, ACD, CPD e CPDA). I campioni che presentano aggregati devono essere chiarificati mediante centrifugazione prima del test. Le particelle o aggregati di fibrina in sospensione possono produrre risultati falsi positivi. Se il monitoraggio è eseguito entro 7 giorni i campioni vanno conservati a +2-8 C oppure essere congelati a - 20 C. Evitare congelamenti/scongelamenti ripetuti. Se i campioni devono viaggiare, imballarli secondo le normative vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici e trasportarli preferibilmente congelati. NON UTILIZZARE SIERI CONTAMINATI, IPER-LIPEMICI O IPER-EMOLIZZATI NOTA : Non sono state messe in evidenza interferenze sia nei campioni contenenti fino a 90 g/l di albumina e 200 mg/l di bilirubina, sia nei campioni lipemici contenenti fino a 36 g/l di trioleina e nei campioni emolizzati contenenti fino a 1,25 g/l di emoglobina. 8 - RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI - VALIDITÀ - CONSEVAZIONE Lasciare i reagenti del kit MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2 a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'utilizzo. 1) Reagenti pronti per l'uso Micropiastra Ag HCV (R1) Prima di aprire la bustina, lasciare che la micropiastra ritorni alla temperatura ambiente nell'imballo protettivo per evitare la formazione di condense di acqua nei pozzetti. Riporre immediatamente nella bustina le strisce inutilizzate. Richiudere con cura facendo attenzione a lasciar uscire l'aria e sigillare con un adesivo. Conservare quindi a + 2-8 C. Diluente per campioni pronto per l'uso (R6) Omogeneizzare capovolgendo il flacone prima dell'uso. 49

Coniugato pronto per l'uso (R7) Omogeneizzare capovolgendo il flacone prima dell'uso. 2) Reagente da ricostituire Soluzione di lavaggio (R2) Diluire a 1/10 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata, sapendo che per una piastra è necessaria una dose pari a 2 x 250 ml di soluzione pronta per l'uso. Omogeneizzare. Soluzione di rivelazione enzimatica (R8 + R9) Diluire il reagente R9 nel reagente R8 in proporzioni pari a 1/11 (esempio: 1 ml di reagente R9 in 10 ml di reagente R8) sapendo che per l'analisi di 12 strisce sono necessari e sufficienti 10 ml. Omogeneizzare. 3) Validità Conservare il kit a +2-8 C. Dopo la preparazione, i reagenti da ricostituire presentano le seguenti stabilità : ETICHETTATURA REAGENTI VALIDITÀ R1 Micropiastra in bustina accuratamente richiusa 1 mese a +2-8 C R2 Soluzione di lavaggio diluita 2 settimane a +2-8 C R8 + R9 Soluzione di rivelazione 6 ore a +18-30 C (al buio) Una volta aperti tutti gli altri reagenti rimangono stabili fino alla data di scadenza indicata sul kit se conservati ad una temperatura pari a 2-8 C. 9 - PROCEDURA Seguire rigorosamente il protocollo proposto. Ogni volta che si esegue il test utilizzare i sieri di controllo negativo e positivo per validare la qualità del test. Applicare le buone pratiche di laboratorio. Sono possibili due metodi di individuazione degli anticorpi anti-hcv : Procedura 1 Procedura 2 Incubazione dei campioni 37 ± 1 C 40 ± 1 C 60 ± 5 min bagnomaria/incubatore a secco Incubazione del coniugato 37 ± 1 C 40 ± 1 C 30 ± 5 min bagnomaria/incubatore a secco Rivelazione enzimatica temperatura ambiente (18-30 C) 30 ± 5 min (al buio) 1) Stabilire accuratamente il piano di distribuzione e d identificazione dei campioni. 2) Preparare la soluzione di lavaggio diluita. 3) Estrarre il telaio di supporto e le strisce (R1) dall imballaggio di protezione. 4) Porre direttamente, senza prelavaggio della piastra, in successione: 4.1) 80 µl di diluente (R6) in ciascun pozzetto N.B.: Dopo aver aggiunto il diluente viola, è possibile verificare mediante lettura(e) spettrofotometrica(che) a 620 nm la presenza del diluente nei pozzetti (cfr. capitolo 12 : VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEL CONIUGATO 4.2) 20 µl di siero di controllo negativo (R3) in A1, B1 20 µl di siero di controllo positivo (R4) in C1, D1, E1 20 µl del primo campione in F1 se detto pozzetto non è utilizzato come pozzetto di controllo del diluente per la validazione del deposito dei campioni 20 µl del secondo campione in G1, ecc. omogeneizzando la miscela mediante almeno 3 aspirazioni con una pipetta da 20 µl. È altresì possibile porre 100 µl di un campione precedentemente diluito a 1/5. Se la distribuzione dei campioni eccede i 10 nm, si raccomanda di distribuire i controlli negativi e positivi dopo i campioni da testare. 50

NB : Una volta aggiunto il campione, il diluente cambia colorazione dal viola al blu. È possibile verificare mediante lettura spettrofotometrica a 620 nm la presenza dei campioni nei pozzetti (cfr. capitolo 12 : VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEL CONIUGATO) 5) Ricoprire con una pellicola autoadesivo esercitando una pressione omogenea su tutta la superficie per assicurare l ermeticità. 6) Incubare la micropiastra in un bagnomaria dotato di termostato o in un incubatore a secco per micropiastre per : Procedura 1 : 60 ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. Procedura 2 : 60 ± 5 minuti a 40 C ± 1 C. 7) Togliere la pellicola autoadesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti contaminati (contenenti ipoclorito di sodio) e aggiungere in ogni pozzetto un minimo di 0,370 ml di soluzione di lavaggio. Aspirare nuovamente. Ripetere il lavaggio 2 volte (effettuare almeno 3 lavaggi). Il volume residuo deve risultare inferiore a 10 µl (se necessario, asciugare la piastra capovolgendola su un foglio di carta assorbente). Se si dispone di un lavatore automatico, seguire lo stesso ciclo di operazioni. 8) Distribuire rapidamente 100 µl di soluzione di coniugato in tutti i pozzetti. Agitare il coniugato prima dell'uso. Ricoprire con una pellicola autoadesiva nuova e incubare per: Procedura 1 : 30 ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. Procedura 2 : 30 ± 5 minuti a 40 C ± 1 C. NB : Il coniugato presenta una colorazione verde. È possibile verificare mediante lettura(e) spettrofotometrica(che) a 620 nm la presenza del coniugato nei pozzetti (cfr. capitolo 12: VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEL CONIUGATO 9) Togliere la pellicola adesiva, svuotare tutti i pozzetti mediante aspirazione e lavare 4 volte come in precedenza. (Se necessario asciugare le strisce capovolgendole su un foglio di carta assorbente). 10) Preparare la soluzione di rivelazione (cfr. capitolo 8, reagenti R8 + R9). 11) Dispensare rapidamente in tutti i pozzetti 100 µl di soluzione di rivelazione dell'attività enzimatica (R8 + R9) preparata in precedenza. Lasciare che la reazione si sviluppi al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18 30 C). Durante questa incubazione, non utilizzare alcun film adesivo. N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di rivelazione, che presenta una colorazione rosa. Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. (fare riferimento al paragrafo 12 per la verifica automatica VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI). 12) Aggiungere 100 µl della soluzione di arresto (R10) seguendo la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione come per la soluzione di rivelazione. Omogeneizzare la miscela di reazione. N.B.: A questo stadio della manipolazione è possibile controllare visivamente la distribuzione della soluzione di arresto, che è incolore. La colorazione del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per i campioni positivi), scompare dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per i campioni positivi) in seguito ad addizione della soluzione di arresto. 13) Asciugare accuratamente la parte inferiore delle piastre. Attendere almeno 4 minuti dopo la distribuzione della soluzione di arresto e leggere la densità ottica a 450/620-700 nm per mezzo di un lettore di piastre, entro i 30 minuti successivi all arresto della reazione. 14) Verificare, prima della trascrizione dei risultati, la concordanza tra la lettura ed il piano di distribuzione e di identificazione delle piastre e dei campioni. 10 - ADATTAMENTO LAVAGGIO : È indispensabile attenersi alle procedure di lavaggio al fine di ottenere dal test prestazioni ottimali. Per i dispositivi PW 40/41 e LP 35 e altri strumenti BIO-RAD : Attenersi al protocollo fornito da BIO-RAD. 51

11 - CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La presenza o assenza degli anticorpi anti-hcv è determinata confrontando per ciascun campione l'assorbenza registrata con quella del valore-soglia calcolato. 1. Calcolare la media dei valori di assorbenza misurati per il siero positivo (DO R4) Esempio : Controllo positivo R4 Campione Densità ottica C1 1,636 D1 1,704 E1 1,650 Totale 4.990 Densità Ottica Totale 4,990 DO R4 = -------------------------------------------------- = ---------------- = 1,663 3 3 2. Calcolo del valore-soglia (Vs) Media DO R4 Vs = ------------------------------------- 5 Esempio : Media DO R4 = 1,663 1,663 Vs = ------------------ = 0,332 5 Di seguito sono riportati i criteri di validazione : a) Per il controllo negativo : ogni singolo valore dell'assorbenza misurata deve essere inferiore a 0,150. b) Per il controllo positivo : la media dei valori di assorbenza misurati deve essere superiore o uguale a 1,000 e inferiore o uguale a 2,400. se uno dei valori singoli del controllo positivo si allontana di oltre il 30 % dalla media, rieseguire il calcolo con i due valori di controllo positivo rimanenti. Se i controlli negativi e/o se piu di un controllo positivo risultano al di fuori dell'intervallo dei valori sopra indicati, il test deve essere rieseguito. Interpretazione dei risultati I campioni che presentano una densità ottica inferiore al valore-soglia sono considerati negativi secondo il test MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2. Tuttavia, i risultati che si trovano proprio al di sotto del valore-soglia (DO campione > DO valore-soglia 10 %) devono essere interpretati con prudenza e i campioni corrispondenti devono essere ritestati in doppio. I campioni che presentano una densità ottica superiore o uguale al valore-soglia sono considerati inizialmente positivi e devono essere ritestati in doppio prima dell'interpretazione definitiva. Una volta ripetuto l'esame, il campione viene considerato positivo in base al test MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2 se la seconda e/o la terza misurazione risulta (risultano) positiva(e), vale a dire superiore o uguale al valore-soglia. Il campione è considerato negativo qualora detti due valori risultino inferiori al valore-soglia. 12 - VERIFICA SPETTROFOTOMETRICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI E DEL CONIUGATO (FACOLTATIVO) VERIFICA DEL DEPOSITO DEI CAMPIONI Nota : una volta aggiunto il campione, la colorazione del diluente dei campioni (R6) cambia da viola a blu. Metodo n 1 : non utilizza bianco di reazione La presenza dei campioni nei pozzetti può essere verificata mediante lettura spettrofotometrica a 620 nm confrontando per ciascun pozzetto le densità ottiche misurate dopo il deposito del diluente dei campioni (R6) con le densità misurate dopo la distribuzione dei campioni. a) Lettura dopo il deposito del diluente I valori di DO dei pozzetti che contengono esclusivamente diluente per campioni (R6) devono essere superiori a 0,200 b) Lettura dopo il deposito del campione/o del controllo un pozzetto contenente un campione da sottoporre a test deve presentare una variazione di DO superiore a 0,200 (una variazione di DO tra le due misure di pochissimo inferiore a 0,200 indica una distribuzione errata del campione da testare) Variazione DO = DO (Camp. + diluente) - DO diluente 52

Metodo n 2 : richiede la realizzazione di un bianco di reazione La presenza dei campioni può essere verificata mediante lettura spettrofotometrica a 620 nm effettuando una sola lettura delle DO ottenute per ciascun pozzetto dopo la distribuzione dei campioni e confrontandole con la DO di un pozzetto di controllo contenente esclusivamente il diluente dei campioni (R6) : il valore della DO del pozzetto di controllo che contiene esclusivamente diluente per campioni (R6) deve essere superiore a 0,200 un pozzetto contenente un campione da sottoporre a test deve presentare una variazione di DO superiore a 0,200 rispetto al pozzetto di controllo (una variazione di DO di pochissimo inferiore a 0,200 indica una distribuzione errata del campione da testare) Variazione DO = DO pozzi (Camp. + diluente) - DO pozzo di controllo diluente VERIFICA DEL DEPOSITO DEL CONIUGATO NOTA : il coniugato (R7) presenta una colorazione verde. È possibile verificare la presenza del coniugato (R7) nei pozzetti mediante lettura spettrofotometrica a 620 nm: il valore della DO misurata per ciascun pozzetto dovrà essere superiore a 0,300 (un valore che risulti al di sotto di detta norma indica una distribuzione errata del coniugato). VERIFICA DEL DEPOSITO DELLA SOLUZIONE DI RIVELAZIONE È possibile verificare la presenza della soluzione di rivelazione rosa mediante lettura automatica a 490 nm : un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione deve avere una densità ottica superiore a 0,100 (una DO inferiore indica una cattiva distribuzione della soluzione di rivelazione). Vi è una differenza evidente tra la colorazione di un pozzetto vuoto e quella di un pozzetto contenente la soluzione di rivelazione rosa. 13 - CARATTERISTICHE DEL METODO Le modifiche apportate al kit MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2 rispetto al kit MONOLISA anti-hcv PLUS riguardano esclusivamente la soluzione di rivelazione (R8 + R9) e la soluzione di arresto (R10). I risultati degli studi di specificità e di sensibilità della versione 2 consentono di confermare le stesse caratteristiche di seguito enunciate ottenute con il test MONOLISA anti-hcv PLUS. Le performance del test MONOLISA anti-hcv PLUS sono state determinate sia su campioni di donatori di sangue non selezionati, sia su campioni di sangue di pazienti affetti da infezioni del virus dell'epatite C, sia su campioni di pazienti che presentavano patologie non rilevanti del virus dell'epatite C. La sensibilità del test MONOLISA anti-hcv PLUS è stata valutata su 523 campioni documentati di cui 191 campioni di pazienti portatori cronici del virus dell'epatite C e per i quali l'infezione da virus dell'epatite C è stata constatata attraverso la presenza di reattività anticorpali anti-hcv mediante tecniche Immuno-Blot e/o attraverso la positività con la tecnica PCR. Nell'ambito del presente studio la sensibilità del test MONOLISA anti-hcv PLUS è risultata pari al 100 %. La sensibilità del test MONOLISA anti-hcv PLUS è stata altresì valutata sui campioni di sieroconversione di 55 pazienti. Rispetto al kit MONOLISA anti-hcv New antigens, 6 sieroconversioni sono state individuate più precocemente dal MONOLISA anti-hcv PLUS. La specificità del test valutata su 5450 campioni di donatori di sangue non selezionati è risultata pari al 99,8%. L'analisi dei 264 campioni di pazienti con patologie senza relazione con il virus dell'epatite C non ha evidenziato reazioni aspecifiche significative. Campioni da genotipi da 1 a 5 sono stati valutati e trovati positivi col kit MONOLISA anti-hcv PLUS Version 2. La precisione del test MONOLISA anti-hcv PLUS è stata determinata mediante l'analisi di 4 campioni : 1 siero negativo (camp. 1), 2 sieri positivi bassi (camp. 2 e camp. 3) e 1 siero positivo alto (camp. 4) agli anticorpi anti- HCV. La ripetibilità (intra-dosaggio) della tecnica è stata valutata mediante l'analisi di questi 4 campioni sottoposti a test per 30 volte nel corso di una stessa manipolazione; la riproducibilità (inter-dosaggio) è stata valutata mediante l'analisi di questi stessi 4 campioni testati in triplicato in 5 giorni diversi, in ragione di 2 prove diverse al giorno. I risultati sono riassunti nelle due tabelle seguenti : Tabella 1 : Ripetibilità (intra-dosaggio) n = 30 camp. 1 camp. 2 camp. 3 camp. 4 Media delle DO 0,056 1,188 1,170 1,773 Media dei rapporti (DO/Cut-off) 0,13 2,86 2,75 4,27 CV (%) rapporti 13,39% 6,54% 7,27% 4,69% 53

Tabella 2 : Riproducibilità (inter-dosaggio) n = 30 camp. 1 camp. 2 camp. 3 camp. 4 Media delle DO 0,085 1,164 1,200 1,727 Media dei rapporti (DO/Cut-off) 0,22 2,93 3,02 4,34 CV (%) rapporti 12% 6,51% 4,04% 5,50% 14 - LIMITI DEL METODO A causa della diversità dei rapporti immunologici nei pazienti infetti dal virus dell'epatite C (in particolare in corso di sieroconversione), si possono osservare differenze di individuazione tra i test in funzione della natura delle proteine antigeniche utilizzate. Un risultato analitico negativo durante un test di monitoraggio non esclude quindi la possibilità di un'esposizione o di un'infezione da virus dell'epatite C. Il metodo colorimetrico di verifica del deposito dei campioni e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione non consente di verificare l'esattezza dei volumi distribuiti ma soltanto di evidenziare la presenza di campioni e/o dei coniugati e/o della soluzione di rivelazione. Il tasso di risposte errate ottenute con tale metodo è collegato alla precisione del sistema utilizzato (dei CV con cumuli di pipettaggio e di lettura superiori al 10% possono deteriorare significativamente la qualità di detta verifica). Nel caso di lavaggio inefficace in seguito alla fase di incubazione del coniugato, la verifica automatica della distribuzione della soluzione di rivelazione (mediante lettura a 490 nm delle densità ottiche dei pozzetti) può dare risultati errati con densità ottiche superiori a 0,100 in assenza di soluzione di rivelazione. Tuttavia questo fenomeno non è stato osservato nel corso delle valutazioni condotte su 939 campioni testati. 15 - BIBLIOGRAFIA Vedere versione francese 54