Studio dell infezione da WNV e C M V tra i donatori della Provincia di Crotone Crotone 09-10 Ottobre 2015 ANGELA LIGUORI DANIELA CANTAFORA LEONARDO PROIETTO SIMT Crotone
Studio dell infezione da WNV e C M V tra i donatori della Provincia di Crotone Una delle più recenti definizioni di infezione emergente è quella dello Institute of Medicine (IOM) statunitense che, nel 2009, definisce le infezioni emergenti come quelle la cui incidenza fra soggetti umani sia aumentata nelle ultime due decadi o rischi aumentare nel futuro prossimo.
VIRUS EMERGENTI : Quali trasmissibili con il sangue? HBV DNA variant WNV RNA TTV RNA CJD (prione) M. di CHAGAS H5N1 H1N1 CHIKV CMV DNA
Malattia da West Nile virus nell uomo Il virus è stato isolato e identificato per la prima volta nel 1937 da un paziente in stato febbrile che viveva in Uganda (West Nile province); La presenza si è successivamente estesa ad Europa, Asia, Africa e Medio Oriente. Nel 1999 ha fatto la sua comparsa negli Stati Uniti. In Europa primo focolaio in Camargue nel 1962. La maggior parte delle infezioni, è di lieve intensità o clinicamente non manifesta. In circa 1 caso su 150 (soprattutto in persone anziane) provoca una malattia neurologica grave (encefalite o meningite). La trasmissione all uomo avviene attraverso la puntura della zanzara del genere Culex, ma anche Aedes albopictus (zanzara tigre)si è rivelato vettore di una certa importanza.
Distribuzione geografica dei focolai Israele 1951/1954,1957 Francia 1962 Sud Africa 1974 Nord Africa 1994,1996 Romania 1996,1997 Repubblica Ceca 1997 Algeria 1994 Marocco 1996 Tunisia 1997 Ucraina 1980 Italia 1998 Russia 1999 USA dal 1999 Israele 1998, 1999 Francia 2000, 03, 06
Distribuzione geografica West Nile Disease: evoluzione della diffusione nel mondo 1960-1969 1970-1979 1980-1989 1990-1999 2000-2003 2004-2007
Distribuzione geografica In Europa: 1996 Epidemia a Bucarest: 853 casi umani, 17 decessi 1998 Italia: 14 equini, 6 decessi 1999 Epidemia a Volgograd: 826 casi umani, 40 decessi Francia 2000: Umani 0 Equini 76 casi 21 Decessi 2003: Umani 7 casi - Equini 7 casi 1 Decesso 2006: Umani 0 Equini 6 casi 0 Decessi
Il Piano di Sorveglianza Nazionale 2008: D.M. 29 novembre 2007 ABRUZZO: Foce del fiume Vomano BASILICATA : Lago di San Giuliano CALABRIA: Foce del Fiume Neto CAMPANIA: Serre Persano EMILIA-ROMAGNA : Valli di Comacchio FRIULI VENEZIA GIULIA: Laguna di Grado e Marano LAZIO: Lago di Sabaudia MARCHE: Sentina MOLISE: Foce del Biferno PUGLIA : Manfredonia SARDEGNA: Stagno di S ' Ena Arrubia SICILIA : Stagni costieri di Vendicari TOSCANA: Padule di Fucecchio UMBRIA: Lago di Trasimeno VENETO: Valle Averto - Laguna Sud di Venezia
2002 2002, 2004 2005 Distribution in space and time of Virus Neutralization positive horses 2002, 2003, 2004, 2007 2003 2003 2007
Surveys in horses Random samplings Transmission season Survey 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Areas at risk (North to South orde r) VN - VN + VN - VN + VN - VN + VN - VN + VN - VN + VN - VN + LAGUNA DI MARANO GRADO E VALLE A VERTO - LAGUNA SUD DI VENEZIA 62 1 69-33 1 57-23 - 42-98 1 77-52 - 118-24 - 78 - VALLI DI COMACCHIO PADULE DI FUCECCHIO SENTINA LAGO TRASIMENO FOCE DEL FIUME VOMANO FOCE DEL BIFERNO MANFREDONIA 103-62 - 22-63 - 37-61 - 186 26 105 1 87 3 118-41 - 134 1 64-20 - 48-80 - 49-53 - 160 1 59-42 - 96-42 - 53-26 - - - - - - - - - - - 27-59 - 4-7 - 3-18 - 15-30 - 47-9 - 20-63 - LAGO DI SABAUDIA 36-77 3 10-43 - 27-85 - LAGO DI SAN GIULIANO 158-82 - 18-13 - - - - - SERRE PERSANO 67 - - - - - 30 - - - - - STAGNO DI S'ENA ARRUBIA 18-19 - 35-27 - 7-19 - FOCE DEL FIUME NETO - - 29 2 - - 1 - - - 5 - STAGNI COSTII ERI DI VENDI CARI 18-80 - 55-64 - 37-307 2 Total 1038 29 768 6 453 4 726-310 - 918 3
Sorveglianza Veterinaria Obiettivo: individuare le aree con circolazione virale per attivare la sorveglianza sull uomo e misure di prevenzione per la popolazione, nonché per fornire informazioni utili per la protezione degli equidi sorveglianza veterinaria Sorveglianza Integrata Medico-Veterinaria Nei cavalli, polli sentinella, avifauna selvatica (non solo animali morti, ma anche monitoraggio degli uccelli abbattuti nell ambito dei piani provinciali di controllo) e nei bovini.
Epidemiologia: gli ospiti Gli animali maggiormente recettivi e in cui è riscontrabile una sintomatologia evidente sono: Uccelli (reservoir) Cavallo (ospite terminale) Uomo (ospite terminale)
Epidemiologia: gli ospiti Gli anticorpi verso il WN virus sono stati trovati in numerose specie: Uomo e altri primati Uccelli (oltre 150 specie) Bovini, ovi-caprini e suini Cane e gatto Rettili (alligatori) ed anfibi Roditori (cavia, topo ) Pipistrelli...
Epidemiologia: gli uccelli Gli uccelli sono l ospite vertebrato di elezione per il virus della West Nile. Essi sono serbatoio di infezione (elevata viremia). La patogenicità negli uccelli è molto varia In Italia sono riconosciute come appartenenti alla fauna ornitica autoctona, oltre 500 specie; di queste circa i due terzi compiono migrazioni a breve o a lungo raggio. Le specie che possono importare l infezione, sono quelle che svernano in aree dove la WNF è endemica o vi sostano durante la migrazione.
West Nile virus Il West Nile virus (WNV) rientra nel gruppo degli Arbovirus (Arthropod Borne viruses), appartiene al genere Flavivirus, famiglia Flaviviridae, in cui sono compresi circa 70 virus, la maggior parte dei quali trasmessi da vettore (zecca, zanzara). Il WNV è un virus a RNA a singolo filamento, a polarità positiva, con diametro di 45-50 nm, envelope costituito da un doppio strato lipidico in cui sono inserite le proteine M ed E ed un capside con simmetria icosaedrica.
West Nile virus Le 3 proteine strutturali (pr-m di membrana, E dell envelope, C del capside) sono maggiormente coinvolte nelle fasi di formazione del virus. Le 7 proteine non strutturali hanno il compito di regolare la fase di replicazione e di assemblaggio, e di eludere la risposta immunitaria dell ospite
La Diagnosi di laboratorio La diagnosi di laboratorio, d'infezione da WNV, si basa esclusivamente, su metodi che sono in grado di identificare in modo specifico il virus o la risposta anticorpale indotta dall'infezione. I dati biochimici, di solito non sono utili al fine di distinguere l'infezione da WNV da altre patologie ad eziologia virale. L'identificazione del virus, può essere ottenuta mediante isolamento colturale in cellule o in topo neonato, cui segue l evidenziazione, di solito eseguita mediante tecnica d'immunofluorescenza (IFA), con anticorpi monoclonali virus specifici. In alternativa alla tecnica di IFA si può eseguire un saggio in reverse transcription PCR (RT-PCR) per identificare il genoma virale.
La Diagnosi di laboratorio La messa in evidenza di una risposta anticorpale specifica di classe IgM, nel siero e/o nel liquor cefalo rachidiano, fornisce quindi la maggiore evidenza di laboratorio, a supporto della diagnosi clinica, in corso di fase acuta di patologia neuro invasiva da WNV. L'identificazione della risposta di classe IgG riveste un'utilità soprattutto epidemiologica. I metodi sierologici, disponibili in routine per la determinazione della risposta anticorpale specifica anti WNV sono, l immunoenzimatica e l'immunofluorescenza: queste due tecniche sono sostanzialmente sovrapponibili, per quanto relativo a sensibilità e specificità.
Le Tecniche e i Metodi nella diagnosi di Laboratorio Le tecniche attraverso cui è determinabile la viremia WNV, quelle basate sulla amplificazione degli acidi nucleici (NAAT). sono sostanzialmente La tecnica real time RT-PCR è stata dimostrata essere un metodo rapido ed affidabile per l'identificazione virale su un gran numero di campioni biologici, inclusi sangue, liquor cefalo rachidiano, tessuti umani ed animali. L'utilizzo di metodi real-time RT-PCR con rivelazione mediante SYBR Green (molecole dotate di attività fluorofora, utilizzate in biologia molecolare quale colorante di acidi nucleici ) ha sensibilità paragonabile a quella dei metodi basati su TaqMan, ma specificità leggermente inferiore. Se sviluppata con tecnologia basata su sonde TaqMan, questa tecnica, ha una sensibilità analitica pari a 0,1 PFU ( enzima presente nell ipertermofilo archaeon Pyrococcus furiosus ) di RNA virale per campione. Entrambi i metodi sono dotati di elevatissima sensibilità analitica, di possibilità di esecuzione in automazione completa e sono quindi estremamente adatti all'impiego per screening trasfusionale, o per la validazione virologica di donazioni di organi e tessuti.
Le Tecniche e i Metodi nella diagnosi di Laboratorio Vista l'elevata percentuale di casi asintomatici (>80%) l'infezione da WNV pone in modo consistente la problematica della sicurezza delle donazioni di sangue, organi e tessuti. L'applicazione di questi sistemi diagnostici, allo screening trasfusionale e trapiantologico, permette una sostanziale riduzione del rischio connesso alla fase viremica asintomatica dell'infezione da WNV, ma la potenziale trasmissione di WNV, con sangue ed organi, resta un'eventualità concreta, seppure rara, poiché i livelli viremici, in assenza di sintomi, sono molto bassi, verosimilmente, in alcuni casi al di sotto della soglia di sensibilità di queste metodiche, specie se le stesse tecniche vengono eseguite su campioni in pool. A questo proposito, va ricordato che la diminuzione di sensibilità dei metodi NAAT per l'identificazione di WNV, decresce in modo direttamente proporzionale al numero di campioni che vengono riuniti in pool prima del saggio.
Esperienza del SIMT di Crotone nella determinazione WNV con tecnologia NAT L implementazione dello screening Nat per il West Nile virus,dal punto di vista operativo, non ha per niente condizionato i nostri piani di lavoro in quanto : i tempi di lavorazione non si discostano da quelli relativi all esecuzione dei Test in uso; la seduta di analisi viene operatore; effettuata comunque da un solo in ogni seduta, le operazioni aggiuntive, consistono nell inserimento dei relativi controlli e della master mix.
Esperienza del SIMT di Crotone nella determinazione WNV con tecnologia NAT Tenuto conto che nel Piano di sorveglianza sanitaria per la West Nile Disease, la Foce del Fiume Neto, è compresa tra le aree di studio, abbiamo analizzato campioni di soggetti provenienti dalle raccolte effettuate sul territorio dei Comuni interessati.
Area di studio: Foce del fiume Neto (KR) West Nile Disease - Piano di controllo 2009 REGIONE PROVINCIA COMUNE CALABRIA CROTONE BELVEDERE DI SPINELLO CALABRIA CROTONE CARFIZZI CALABRIA CROTONE CASABONA CALABRIA CROTONE CIRO' CALABRIA CROTONE CIRO' MARINA CALABRIA CROTONE CROTONE CALABRIA CROTONE CUTRO CALABRIA CROTONE MELISSA CALABRIA CROTONE PALLAGORIO CALABRIA CROTONE ROCCA DI NETO CALABRIA CROTONE SAN MAURO MARCHESATO CALABRIA CROTONE SAN NICOLA DELL'ALTO CALABRIA CROTONE SANTA SEVERINA CALABRIA CROTONE SCANDALE CALABRIA CROTONE STRONGOLI CALABRIA CROTONE UMBRIATICO
La Foce del Neto
Esperienza del SIMT di Crotone nella determinazione WNV con tecnologia NAT Sedute Sono stati esaminati : Pool (6 campioni) Campioni / seduta 1 16 96 2 6 36 3 5 30 4 15 90 5 18 108 6 12 72 Totale 72 432 Dal punto di vista epidemiologico, tenuto conto del numero esiguo dei campioni esaminati (Tutti Negativi), non si è stati in grado di trarre conclusioni.
Esperienza del SIMT di Crotone nella determinazione WNV con tecnologia NAT La Foce del Fiume Neto resta comunque una zona sottoposta a sorveglianza sanitaria, in quanto dal 2003 ad oggi, vi sono state manifestazioni del virus.
Esperienza del SIMT di Crotone nella determinazione WNV con tecnologia NAT La Tecnologia Roche Real Time PCR (Piattaforma Cobas S201,Test Taq Screen WNV) risulta un sistema diagnostico accreditato, con elevata specificità (99,9%) con una notevole sensibilità Analitica (97,5%) e con un dectetion limit 95% pari a 40 copie di WNV-RNA/mL.
West Nile News Aggiornamento epidemiologico Il rapporto presenta i risultati nazionali della Sorveglianza dei casi umani di malattia neuroinvasiva da West Nile Virus (WNV) in Italia, elaborati dal Reparto di Epidemiologia delle Malattie Infettive (Cnesps) dell Istituto superiore di sanità. In Italia da giugno sono stati segnalati 14 casi confermati di malattia neuroinvasiva da West Nile Virus (WNND). La Regione Emilia-Romagna ha segnalato 4 casi confermati di febbre con infezione da WNV. E stata segnalata positività per WNV in dodici donatori di sangue: 4 in Emilia Romagna, 7 in Lombardia e 1 in Friuli V.G.. Nell Unione Europea sono stati riportati 13 casi confermati di malattia da WNV nell uo-mo (febbri e forme neuro invasive) e 17 casi nei Paesi limitrofi (Fonte: ECDC 2015, map-pa sulla diffusione della malattia in Europa, ultimo aggiornamento del 27 Agosto 2015). WN_News_2015_03.pdf
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Struttura Il Citomegalovirus è un genere di virus appartenente alla famiglia degli Herpesviridae. Il virione è rivestito da un envelope che gli conferisce una forma pressoché sferica, con diametro di 120-200 nm. Il capside è a simmetria icosaedrica ed ha un diametro di 100-110 nm. È costituito da 162 capsomeri tegumento proteico amorfo. circondato da un Il rivestimento lipidico include complessi glicoproteici. Il genoma non è segmentato ed è costituito da un'unica molecola lineare di DNA a doppio filamento, lunga complessivamente 200 kbp. Contiene sequenze ripetute alle estremità e all'interno della molecola stessa. Il suo contenuto in guanina+citosina è del 56%.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Replicazione virale Il virus colpisce diversi tipi cellulari. Una volta in contatto con i recettori della cellula ospite viene internalizzato per endocitosi o per fusione dell'envelope con la membrana plasmatica e trasportato, col capside intero, attraverso i pori nucleari all'interno del nucleo cellulare, dove il DNA viene rilasciato. I geni precoci vengono trascritti dalla RNA polimerasi dell'ospite, e gli mrna prodotti vengono trasportati nel citoplasma dove sono tradotti in proteine che vengono riportate indietro nel nucleo.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Tali proteine consentono la replicazione del DNA virale. Vengono prodotte numerose copie del genoma virale dalla DNA polimerasi DNA-dipendente del virus e vengono trascritti i geni tardivi dalla RNA polimerasi dell'ospite. Questi geni codificano per le proteine strutturali. L'assemblaggio dei nuovi virus avviene all'interno della membrana nucleare, che viene modificata dall'inserimento di glicoproteine virali. Il virus viene infine rilasciato nell'ambiente esterno attraverso la membrana cellulare.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Trasmissione L uomo è l unico serbatoio di infezione del CMV, la cui trasmissione avviene da persona a persona tramite i fluidi del corpo, tra cui sangue, saliva, urina, liquidi seminali, secrezioni vaginali e latte. Il contagio può avvenire per contatto persona-persona (per esempio tramite rapporti sessuali, baci sulla bocca, contatto della bocca con mani sporche di urina o saliva), per trasmissione madre-feto durante la gravidanza o madre-figlio durante l allattamento, per trasfusioni e trapianti di organi infetti. Il virus può essere eliminato dall organismo infetto anche per mesi o anni dopo la prima infezione, specialmente nei bambini piccoli.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone I bambini possono addirittura diffonderlo per 5-6 anni dopo la nascita. La maggior parte degli individui sani, adulti o bambini, che contraggono la malattia non manifesta sintomi e non si accorge dell infezione, mentre alcuni soggetti sviluppano una forma leggera della malattia con febbre, mal di gola, affaticamento e ingrossamento dei linfonodi.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Dopo il primo contatto persiste in uno stato latente per tutta la vita. Da qui l importanza di ridurre al minimo il rischio di trasmettere l infezione da CMV mediante trasfusione di emoderivati. In particolari condizioni l infezione latente del CMV può riattivarsi, nei soggetti normali la reazione del sistema immune controlla efficacemente la riattivazione dell infezione, mentre nei soggetti immunocompromessi o immunologicamente immaturi, questo evento rappresenta un serio pericolo e costituisce la principale complicanza di tipo infettivo dopo SOT( solid organ trasplant).
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Epidemiologia Il CMV è diffuso in tutto il mondo e in tutti gli strati sociali della popolazione, ma in generale ha una diffusione maggiore nei Paesi in via di sviluppo e nelle aree caratterizzate da scarse condizioni socioeconomiche. Si calcola che la percentuale della popolazione mondiale entrata in contatto con il CMV si colloca fra il 60 e il 90%. Nella popolazione femminile in età fertile la prevalenza dell infezione oscilla dal 35 al 90% ed è influenzata dalla professione, dall attività sessuale e dall età.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Nell America del Nord (40-60%) e in Gran Bretagna (circa 50%) la sieroprevalenza è bassa, mentre in Italia, come nella maggior parte degli altri Paesi europei, si aggira intorno all 80%. La maggior parte delle donne europee ha quindi già contratto un infezione primaria. Le persone che per lavoro (operatori in scuole materne e nidi) o legami familiari sono a stretto contatto con i bambini, soprattutto se di età inferiore ai tre anni, sono a maggior rischio di infezione e mostrano un tasso di sieroconversione annuale del 10-20%. Si stima, infatti, che nel 10-40% dei casi i bambini piccoli hanno il CMV nelle urine e nella saliva. Il tasso di sieroconversione nelle donne in gravidanza è stimato intorno all 1-2%, ma varia a seconda delle popolazioni. Da qui l esigenza di condurre uno studio sulla popolazione di donatori del Crotonese.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Detto studio vuole evidenziare: Eventuale presenza di infezione da CMV nella popolazione potenzialmente sana. Dall 1/01/2015 abbiamo esaminato 3971 campioni di donatori di cui 3007 maschi e 964 femmine, ricercando su questi le IgG/IgM del virus Dall 1/3/2015 abbiamo ampliato lo studio con la ricerca del DNA del virus, prendendo in esame soltanto quei campioni risultati positivi alle IgG del CMV, in totale circa 441. I dosaggi sono stati eseguiti sia su donatori che hanno effettuato le donazioni presso il nostro centro e sia su quelli che hanno donato nei punti di raccolta della provincia. I donatori inclusi nello studio appartengono a tutte le fasce di età comprese tra i 20/60 anni circa.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Popolazione Maschile Decade Donatori testati IgM positive IgG positive CMV DNA positivo 20-30 anni 503 0 30-40anni 748 0 40-50anni 1050 0 50-60anni 706 0 Totale 3007 0 48 9.54 % 65 8.68% 80 7.61% 72 10.19% 265 8.81% 0 0 0 0 0
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Popolazione Femminile Decade Donatori testati IgM positive IgG positive 20-30 anni 156 0 21 13.4% 30-40anni 232 0 40 17.24% 40-50anni 293 0 60 20.4% 50-60anni 283 0 55 19.43% Totale 964 0 176 18.25% CMV DNA positivo 0 0 0 0 0
Studio dell infezione da C M V tra i donatori della Provincia di Crotone Il nostro studio fino ad oggi, non ha rilevato alcuna positività per il DNA del CMV.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Anche in questo caso i nostri donatori sono stati esaminati con la Tecnologia Roche Real Time PCR (Piattaforma TAQMAN 48) Test Qualitativo su campione singolo.
Studio dell infezione da CMV tra i donatori della Provincia di Crotone Attualmente non abbiamo molti dati a disposizione in quanto lo studio è iniziato solo nei primi mesi dell anno in corso ma sarà protratto ancora per altri 2 anni.