REGIONE LIGURIA ASSESSORATO AGRICOLTURA E TURISMO Trasferimento e dimostrazione nella realtà operativa dell uso di saggi diagnostici rapidi per l'applicazione di adeguate strategia di difesa contro le infezioni di tospovirus (TSWV e INSV) e tobamovirus (ToMV) su specie ornamentali e orticole Regolamento CE n. 1257/1999 Misura c (3) Formazione Professionale - sottomisura 3.3 Progetti dimostrativi RELAZIONE SECONDO ANNO ANNO 2002
Introduzione Le produzioni floricole e orticole appaiono oggi di fondamentale importanza nella realtà produttiva ed economica Ligure. Numerosi, però, possono essere gli ostacoli di tipo tecnico che la loro coltivazione incontra. Il rischio di presenza di infezioni virali è, a tale riguardo, di grave attualità, causando, spesso, danni non solo in fase avanzata di produzione, ma già a partire dal materiale propagativo che può risultate infetto già in vivaio o nelle prime fasi di coltivazione in campo. In tali condizioni operative appare di grande importanza poter disporre di metodi diagnostici rapidi e efficienti in grado di permettere una rapida conoscenza dello stato fitosanitario della coltura almeno per quanto riguarda la presenza di virus. Con il presente progetto si intende, pertanto, trasferire nell'uso pratico un sistema diagnostico rapido in grado di permettere il rapido riconoscimento di infezioni di due temibili e diffusi tospovirus (TSWV e INSV) e di ToMV, anch'esso dannoso e diffuso sulle colture liguri. Occorre, infatti, rammentare che ad oggi contro i virus delle specie vegetali estremamente limitati sono i sistemi di lotta applicabili. Ad esclusione, infatti, di alcuni esempi di utilizzo di mezzi genetici di lotta (ovvero impiego di selezioni resistenti di specie vegetali, peraltro di complessa se non impossibile applicazione nei settori della floricoltura ligure a causa della elevata variabilità di specie vegetali utilizzate e della orticoltura ligure a causa dell'impiego di selezioni orticole locali di ridotta importanza nel panorama cultivarietale nazionale), la difesa nei confronti delle virosi si basa essenzialmente su attività di tipo preventivo a cui il sistema oggetto dell'attività di progetto appartiene. Sempre più pressanti e generalizzate appaiono, peraltro, le richieste del mercato delle specie da orticole e floricole prodotte con tecniche a basso impatto ambientale e, in particolare, realizzate con un ridotto e ragionato impiego di mezzi di difesa chimici. La lotta a numerosi virus, purtroppo, viene spesso effettuata mediante una lotta talora non troppo ragionata verso potenziali vettori animali. Certamente, però, il riconoscimento delle infezioni virali nelle prime fasi potrebbe permettere non tanto la razionalizzazione degli eventuali interventi, quanto, soprattutto, una
migliore attività preventiva basata su strategie agronomiche che tendano ad escludere il rischio infettivo. In particolare, il riferimento non è solo alla adozione di tecniche che permettano la eliminazione degli ospiti infetti man mano che essi si rendono manifesti, ma soprattutto è riferito alla possibilità di controllo del materiale propagativo che potrebbe essere effettuato in fase preliminare rispetto alla messa a dimora in campo. Partire da materiale sano, infatti, è la prima preoccupazione che il coltivatore dovrebbe avere al fine di garantire il buon esito della coltura. In particolare il riferimento è a molte specie vegetali auto prodotte dai coltivatori (dimorfoteca, agatea, margherita, crisantemo, alcune selezioni locali di pomodoro, etc.) in condizioni di sanità non sempre eccellente per quanto riguarda i virus. Successivi controlli sulla sanità delle piante in coltura, comunque, appaiono determinanti soprattutto in quei casi ove determinante è questo tipo di conoscenza per decidere sulla tecnica di gestione agronomica generale da mantenere o sulla convenienza alla eliminazione o al mantenimento della coltura stessa. per quei virus caratterizzati. In tale panorama il rischio connesso alla presenza di infezioni dei tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) e Impatiens necrotic spot virus (INSV) e del tobamovirus Tomato mosaic virus (ToMV) appare spesso particolarmente grave. I due tospovirus sono stati ritrovati in Liguria agli inizi degli anni 90 e l elenco di specie orticole ed ornamentali ritrovate infette è estremamente elevato, interessando la maggior parte delle specie coltivate. La loro pericolosità deriva dalla loro vastissima gamma di piante ospiti che include circa 1000 specie appartenenti ad almeno 70 famiglie e dall elevata efficienza di trasmissione del loro principale vettore, il tripide Frankliniella occidentalis, estremamente polifago e di difficile controllo con insetticidi. Gravi danni continuano a verificarsi in specie orticole quali il peperone e il pomodoro e in svariate specie ornamentali quali crisantemo, gerbera, ciclamino e come riportato recentemente anche in margherita. Questi virus sono inoltre soggetti alla specifica normativa di legge che impone severi controlli per il materiale vivaistico prodotto dalle aziende. Discorso a parte è quello relativo al tobamovirus ToMV. Si tratta di un virus che nelle condizioni naturali infetta soltanto il pomodoro producendo gravi danni quali riduzione dello sviluppo delle
piante, maculature e necrosi dei frutti. ToMV non ha artropodi vettori noti eccetto una trasmissione in pomodoro con insetti impollinatori ma è altamente infettivo per cui viene diffuso con estrema facilità durante le operazioni colturali, rimane nel suolo per lungo tempo e può contaminare le strutture delle serre. In pomodoro è inoltre trasmesso per seme. Tale virus rappresentava uno dei maggiori problemi virologici del pomodoro negli anni 70, superato in parte con l uso di cv resistenti anche se sono stati successivamente ritrovati nuovi patotipi in grado di infettare le piante resistenti. Negli ultimi anni il Liguria si è nuovamente diffusa la coltura di selezioni locali di pomodoro estremamente pregiate e redditizie tipo Cuore di bue ma anche molto suscettibili al virus. Sempre più frequenti sono i danni prodotti dal virus, tali da rendere non più commerciabili i frutti. Parallelamente si è diffusa la pratica dell innesto per ovviare a problemi di patogeni tellurici; alcuni dei portainnesti più validi sono resistenti al virus e fenomeni di collasso delle piante potrebbero essere dovuti all infezione del virus. Al fine di verificare la sanità delle colture la semplice analisi visiva della sintomatologia non è sufficiente in quanto le infezioni virali possono essere confuse con altre patologie o fattori abiotici. Una diagnosi accurata è pertanto necessaria. Per questi tre differenti virus sono oggi utilizzati saggi diagnostici di laboratorio, essenzialmente di tipo sierologico come la tecnica immunoenzimatica ELISA. Tale tecnica richiede una discreta attrezzatura di laboratorio, oltre a personale sufficientemente addestrato. I risultati si ottengono generalmente dopo due giorni dal ricevimento del campione in laboratorio. Tale tecnica è stata utilizzata ampiamente presso l Istituto di Fitovirologia Applicata nel corso delle indagini effettuate in Liguria, valutando accuratamente la validità degli antisieri utilizzati, anche prodotti specificamente con isolati locali dei virus. Sulla base delle informazioni sopra riportate appare, quindi, evidente che i tempi di attesa e gli aspetti prettamente logistici delle verifiche diagnostiche (prelevamento del campione, conservazione, spedizione al laboratorio, etc..) sono fortemente limitanti e penalizzanti, anche in termini di costi finali. Con questo progetto dimostrativo si è voluto illustrare, pertanto, agli agricoltori una innovazione assoluta nel settore della diagnosi "di campo" dei tre virus sopra citati.
Si tratta di sistemi diagnostici rapidi messi a punto dall'istituto di Fitovirologia Applicata del C.N.R. di Torino in grado di azzerare, o comunque di ridurre fortemente, tutte quelle fasi precedentemente indicate (prelevamento del campione, conservazione, spedizione al laboratorio, ritorno in azienda per comunicare, etc..). Questo tipo di test, introdotto per la prima volta nel 1988 per la diagnosi di stati di gravidanza, è ora usato per la determinazione di moltissimi analiti in clinica umana e veterinaria (ormoni, microrganismi, virus, marcatori tumorali e di stati d infarto, droghe d abuso). Diversa la situazione in campo vegetale. I primi lavori su patogeni delle piante furono pubblicati nel 1992, seguiti nel 1997 da un applicazione degli stessi metodi su virus delle orchidee. Nessuno di questi test venne mai messo in commercio ma furono usati solo per scopi di ricerca. Nel 2000 fu introdotto sul mercato un kit prodotto dal CSL, il laboratorio del Ministero dell Agricoltura inglese, aprendo una nuova strada alla diagnostica vegetale. Attualmente gli unici produttori di kit per i più importanti virus vegetali sono lo stesso CSL e la ditta americana AGDIA. Il vantaggio principale di tali saggi risiede nella loro estrema semplicità d uso che non richiede assolutamente attrezzature di laboratorio e nella rapidità della risposta, ottenuta dopo pochi minuti. Per i virus delle piante solo una ditta americana ed una inglese hanno proposto questo tipo di saggio, che tuttavia non è stato sufficientemente confrontato con altre metodiche ed inoltre è stato prodotto con anticorpi specifici per patogeni che potrebbero essere differenti da quelli presenti in Liguria. Altro fattore limitante è il prezzo estremamente elevato di vendita in Italia. L uso di un saggio di questo tipo ma prodotto con anticorpi di cui è nota la reattività verso i patogeni locali crea la premessa indispensabile al suo uso, dopo opportuna verifica dell affidabilità in confronto a metodiche tradizionali. Presso l IFA sono stati studiati questi saggi di tipo immunocromatografico e prodotti artigianalmente. Sono stati utilizzati per il rilevamento di TSWV, INSV e ToMV in poche specie di piante infettate sperimentalmente dimostrando la loro validità in termini di sensibilità rispetto al tradizionale metodo ELISA. Premessa indispensabile al loro uso da parte di operatori non specializzati del settore è la verifica della loro affidabilità in condizioni di campo in confronto al
rilevamento dei virus con la tecnica ELISA e l istruzione del personale.. In particolare con i tospovirus è da verificare il loro rilevamento in specie vegetali differenti. L'attività dimostrativa, quindi, ha permesso una validazione delle possibilità applicative di tale sistema diagnostico rapido innovativo permettendo di porre a confronto il sistema in oggetto con il metodo ELISA, ordinariamente adottato a fini diagnostici, ma spesso troppo dispendioso e, soprattutto, non applicabile direttamente in condizioni di campo. Tale attività di validazione è stata effettuata sulla base delle esperienze di ricerca maturate dall'ifa e direttamente con l' apporto tecnico e scientifico di tale struttura. Accanto al processo di validazione, è avvenuta la progressiva diffusione della conoscenza della disponibilità di questi test; tale disponibilità, per due anni, quindi, gratuita per agricoltori e tecnici, è stata particolarmente apprezzata dagli uni e dagli altri, contribuendo a individuare problemi e situazioni a rischio, favorendone la tempestiva soluzione. In questi termini il progetto ha avuto pieno successo e pieno sostegno da parte delle imprese e dei professionisti operanti nel settore agrario. Risultati conseguiti I risultati conseguiti sono stati essenzialmente la diffusione della conoscenza e, quindi, l uso di questo tipo di tecnica diagnostica, attraverso la dimostrazione dell'applicabilità, la verifica della affidabilità del risultato e l'illustrazione delle metodologie che devono essere adottate direttamente a tecnici e coltivatori. Questa iniziativa, unica in ambito regionale, ha rappresentato un momento di trasferimento dell innovazione da sfruttare per aumentare gli strumenti tecnici che i coltivatori possono impiegare per la buona riuscita delle proprie coltivazioni, per il mantenimento della propria competitività sul mercato europeo e per la riduzione dell'impatto ambientale anche in agricoltura convenzionale. Le attività si sono basate sull esecuzione e sulla dimostrazione pratica, in condizioni operative ordinarie, di tecniche diagnostiche rapide applicate in parallelo a tecniche diagnostiche classiche (ELISA), ma più complesse.
Sono stati invitati gli agricoltori e i tecnici, oltre che a partecipare agli incontri programmati, a portare al laboratorio fitopatologico del CeRSAA campioni di piante sospettate di essere infette da virus per poterle sottoporre a verifica rapida presso il laboratorio fitopatologico del CeRSAA stesso e, successivamente, anche da quello virologico dell IFA CNR di Torino. La raccolta dei dati ottenuti su campioni analizzati secondo tali due tecniche ha permesso di stabilire il grado di confidenza dei test rapidi oggetto dell'attività dimostrativa, garantendo, pertanto, il ragionato trasferimento. Il vantaggio indubbio è poter disporre di una tecnica direttamente applicabile nelle condizioni operative riducendo al minimo i tempi di attesa precedentemente necessari per l'esecuzione dell'analisi di laboratorio classica (ELISA).
La realizzazione di un protocollo operativo standard con il quale procedere alla verifica di analisi con test rapido appare come procedura necessaria al fine di ridurre rischi di errori durante l'applicazione del test. Viste le caratteristiche del sistema rapido di diagnosi, i tempi di esecuzione estremamente contenuti, la possibilità di applicazione diretta in condizioni di campo anche preventivamente alla manifestazione dei primi sintomi delle citate alterazioni virali, detto sistema rapido si configura non semplicemente come un sistema di diagnosi, ma anche quale fondamentale supporto decisionale per la scelta della corretta strategia di difesa e gestione della coltura già a partire dalla fase di vivaio. Tutta questa serie di conoscenze permetterà di poter sfruttare a pieno questi test rapidi oggi in fase di iniziale commercializzazione, permettendo, inoltre, di sviluppare tra tecnici e coltivatori conoscenze e capacità tecniche sull'uso di sistemi diagnostici di campo oggi non disponibili. In sintesi, la tecnologia conosciuta come lateral flow, di tipo immunocromatografico, presenta alcuni vantaggi di primaria importanza: la semplicità di esecuzione, che ne fa un sistema alla portata di tutti e utilizzabile in qualunque contesto; i risultati sono immediati e di facile lettura; i test sono stabili anche se conservati nelle condizioni più diverse; i costi di produzione sono relativamente bassi. Il procedimento produttivo Il lateral-flow è un metodo immunocromatografico omogeneo e qualitativo: anticorpi virus specifici sono immobilizzati su una membrana di nitrocellulosa a formare una linea perpendicolare alla direzione di flusso; un reagente rivelatore (formato dagli stessi anticorpi coniugati su lattice o su un metallo colloidale), è depositato ed essiccato su una fibra di vetro chiamata conjugate pad.
Quando il campione è deposto sull apposito sample pad, rapidamente viene bagnato anche il conjugate pad sottostante. Il rivelatore viene risolubilizzato e comincia a diffondere lungo la membrana per capillarità. Se l analita è presente, allora verrà legato dagli anticorpi specifici del rivelatore, e appena il complesso passa sulla linea degli anticorpi di cattura immobilizzati, verrà trattenuto secondo uno schema a sandwich. Il colore si sviluppa con intensità proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. L eccesso di particelle continua a migrare fino alla linea di controllo, di anti-anticorpi, e
formerà una seconda banda. Se questa linea non compare, il test non ha funzionato correttamente e va ripetuto. Riassumendo, l interpretazione dei risultati è estremamente facile: due linee colorate corrispondono un campione positivo, una sola linea indica un campione negativo per quel virus specifico. Campione positivo Campione negativo Presso l Istituto di Virologia Vegetale (IVV) del CNR di Torino, è stato sviluppato, inizialmente, kit per la ricerca di Tomato mosaic virus (ToMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Pepino mosaic virus (PepMV) e Impatiens necrotic spot virus (INSV). I due Tospovirus TSWV e INSV sono diffusi su tutto il territorio ligure e tra le centinaia di piante ospiti segnalate a livello mondiale, quelle di maggior interesse per la Liguria sono la margherita, il ciclamino, il crisantemo, la dimorfoteca, la gerbera, l agatea, il peperone, il pomodoro e altre. Il pomodoro, soprattutto la pregiata varietà Cuore di bue, è molto colpito da infezioni di ToMV. Il
PepMV non è invece stato ancora segnalato, ma una nota del Ministero dell Agricoltura ne impone il controllo. Questi quattro virus sono stati oggetto delle attività all interno del progetto dimostrativo, costituito da due aspetti principali: la validazione della diagnosi e l esposizione al pubblico. Per quel che riguarda la prima parte, il lavoro è stato così organizzato: presso il CeRSAA di Albenga venivano effettuate su campioni di campo le analisi con i test prodotti dal CNR per ToMV, INSV, TSWV e PepMV. I risultati e i campioni stessi venivano poi inviati all IVV, dove si provvedeva ad eseguire sullo stesso materiale il saggio ELISA, scelto come metodo di riferimento. I risultati ottenuti in questo modo sono stati assunti come veri e confrontati con quelli ottenuti con il lateral flow. In alcuni casi dubbi è stato necessario confermare la diagnosi con tecniche di supporto o alternative quali microscopia elettronica o inoculazione su piante indicatrici. In tabella sono riportati i risultati del confronto tra ELISA e lateral flow. Con PD pos si indica la predittività positiva, vale a dire la probabilità che ad un risultato positivo ottenuto con il lateral flow corrisponda un effettivo stato di malattia. In altre parole, l inverso della PD pos è la probabilità di avere un falso positivo. Discorso analogo vale per la PD neg. La sensibilità indica invece quanti campioni positivi sono stati determinati, rispetto al totale dei campioni infetti. Per INSV e PepMV non è stato possibile calcolare alcuni valori per via del numero ridottissimo di campioni positivi. TSWV INSV PepMV ToMV Numero di campioni 238 144 77 207 PD pos 92.2 % Non calcolabile Non calcolabile 98.6 % PD neg 98.9 % 98.6 % 98.7 % 96.3 % Sensibilità 88.7 % Non calcolabile Non calcolabile 93.4 %
Come si vede, l attività ha dato risultati apprezzabili e importanti incentivi per il prosieguo del lavoro. La tecnica lateral flow si è dimostrata precisa e affidabile, oltre che rapida, ed è quindi auspicabile un suo utilizzo sempre più massiccio. I kit valutati in questi due anni sono ora in commercio, mentre la ricerca si è spostata verso lo sviluppo di test per i virus delle Cucurbitacae (ZYMV, WMV-2, PRSV), per CMV, BCMV, per i virus dei fruttiferi (CTV, CPsV, PDV, PPV, ApMV, ACLSV, PNRSV), per TYLCV. Per ognuno di questi sistemi è decisamente auspicabile un analoga validazione rispetto ad altri metodi. Un ulteriore passo avanti potrebbe infine essere rappresentato da un multi-test per la diagnosi simultanea di più virus patogeni. L aspetto divulgativo del progetto dimostrativo si è invece svolto interamente presso la sede del CeRSAA di Albenga ed è consistito nell esecuzione di piccole prove dimostrative di campo e nell esporre a tecnici, coltivatori, ricercatori del settore e studenti delle scuole medie superiori e universitari, i principi teorici della tecnologia e l illustrazione pratica delle modalità d impiego del test. Il riscontro del pubblico è stato positivo: la buona affluenza agli incontri e l interesse partecipe riscontrato in tali occasioni, dimostrano come i vantaggi di questa tecnologia siano innegabili, evidenti e condivisi da tutti. In tal senso, l obiettivo è di poter continuare in questa necessaria opera di promozione, al fine di rendere sempre più comune l utilizzo dei kit rapidi di diagnosi. Concludendo, si può affermare che i vantaggi di questa attività siano biunivoci: da una parte è stato possibile, con una massiccia attività su campioni di campo, confermare il buon funzionamento della tecnica lateral flow, sia in termini di affidabilità che di rapidità; dall altro, gli operatori del settore sono venuti, per la prima volta in Italia, in contatto con questa nuova tecnologia, apprezzandone i pregi e imparandone l utilizzo. Una comunicazione orale su parte di questo lavoro è stata presentata al IX Convegno Nazionale SIPaV, tenutosi a Roma l 1-2 ottobre 2002 sul tema Innovazioni in Patologia Vegetale. Si allega copia del riassunto.
CONFRONTO TRA LATERAL FLOW E ELISA PER LA DIAGNOSI DI TOMATO MOSAIC VIRUS IN POMODORO Alberto Salomone 1, Cinzia Bruzzone 2, Giovanni Minuto 2, Andrea Minuto 3 and Piero Roggero 1,*. 1 Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Str delle Cacce 73, 10135 Torino, Italy; Fax: +39011343809; e-mail p.roggero@ifa.to.cnr.it 2 Ce.R.S.A.A.-C.C.I.A.A di Savona, Albenga (SV), 3 Di,Va.P.R.A. Patologia Vegetale, Università di Torino, Torino. L infezione del tobamovirus Tomato mosaic virus (ToMV) è uno dei più gravi problemi virologici per la coltivazioni di cultivar di pomodoro non resistenti a questo virus. L elevata infettività, la facilità di trasmissione durante le operazioni colturali e per seme, rendono indispensabile una diagnosi tempestiva per ridurre il danno. La sola analisi sintomatologica di foglie e frutti è inaffidabile. Attualmente la tecnica di laboratorio più usata è l ELISA, ma i risultati si ottengono solo dopo alcuni giorni. Il Lateral Flow (LF) è una nuova tecnica rapida e di campo, che permette la diagnosi di un virus in pochi minuti e senza alcuna attrezzatura particolare. Abbiamo messo a punto test LF per ToMV utilizzando anticorpi policlonali coniugati su oro colloidale e per attivare le membrane di nitrocellulosa; successivamente abbiamo confrontato i risultati ottenuti con quelli del test ELISA, analizzando in parallelo gli stessi campioni. Il sistema LF permette il rilevamento del virus in foglie, frutti e semi di pomodoro; il limite di rilevabilità è solo leggermente più elevato dell ELISA. Negli ultimi due anni sono stati analizzati 180 campioni di pomodoro, prima direttamente in campo con LF e dopo in laboratorio con l ELISA: sono stati ottenuti gli stessi risultati su 66 campioni positivi e 109 negativi, mentre in 5 casi si è avuto un risultato positivo in ELISA e negativo in LF. In conclusione, il LF sembra essere un affidabile tecnica di campo per la diagnosi di ToMV in pomodoro, fornendo risultati simili all ELISA ma in tempo reale, permettendo così decisioni più rapide per la coltivazione delle piante.