La metabolomica : che cos è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza

G It Diabetol Metab 2013;33:176-181 Nuovi orizzonti La metabolomica : che cos è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza RIASSUNTO L analisi del metaboloma permette, insieme ad altre valutazioni omiche, cliniche e di imaging, di delineare il fenotipo metabolico individuale. I dati provenienti dalle scienze omiche potrebbero quindi consentirci di disegnare il fenotipo della malattia diabetica, nonché la sua progressione, permettendoci di comprendere perché alcune pazienti sviluppano diabete in gravidanza e altre no; inoltre sarà possibile capire perché alcuni pazienti sviluppano complicanze e quali sono gli indici prognostici di tipo biochimico della malattia diabetica in gravidanza. SUMMARY Metabolomics: what it is and what it can tell us about diabetes in pregnancy Metabolomic analysis, along with other -omics assessments, can outline an individual s metabolic phenotype. The -omics findings could then be used to depict the phenotype of diabetes and its progression. Metabolomics will help us understand why some patients develop diabetes in pregnancy and others do not, and what are the main biochemical prognostic indicators of diabetes in pregnancy. It should also give some ideas why certain patients develop complications. A. Ragusa 1, A. Lapolla 2 1 DPT Ostetricia, AO Ospedale di Niguarda, Milano; 2 DPT Medicina, Università degli Studi di Padova, Padova Corrispondenza: dott. Antonio Ragusa, via Alfieri 9, 20092 Cinisello Balsamo (MI) e-mail: antonio.ragusa@gmail.com G It Diabetol Metab 2013;33:176-181 Pervenuto in Redazione l 11-10-2013 Accettato per la pubblicazione il 15-10-2013 Parole chiave: metabolomica, metabonomica, gravidanza, diabete, fenotipo metabolico Key words: metabolomics, metabonomics, pregnancy, diabetes, metabolic phenotype La metabolomica o metabonomica è una delle più promettenti scienze omiche. Il neologismo metabolomica, derivato dal suffisso inglese omics, designa un comparto delle scienze biologiche in grande sviluppo: metabolomica, genomica, mrna-trascrittomica, proteomica. L Oxford English Dictionary riconosce tre diversi significati al suffisso omic, il terzo significato è quello che ci interessa: all constituents considered collectively, si tratta quindi di una tecnica di tipo olistico, che tende a considerare una serie di fattori complessi, riunendoli in un insieme che afferisce alla cellula e infine all individuo. La metabolomica è in grado di studiare la complessità metabolica delle cellule, dei tessuti, come anche di interi organi-

La metabolomica : che cos è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza 177 National Academy of Sciences, quello che può essere considerato il primo studio metabolomico: Quantitative analysis of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography (1). Tuttavia il termine metabolomica fu usato per la prima volta solo molti anni dopo, da SG Oliver et al. nel 1998 (2). La metabolomica oggi riconosce un enorme diffusione e uno sviluppo applicativo/pratico in vari ambiti come le scienze mediche, la biologia sintetica, la medicina di sistemi microbici e di sistemi animali e le piante; la grande diffusione della metabolomica e la sua applicazione negli ambiti sopra visti dipendono dal fatto che esiste un importante associazione tra il metaboloma e la fisiologia cellulare; se da un lato il genoma trascritto e il proteonoma possono essere visti come una conseguenza dell espressione genica, il metaboloma rappresenta il livello finale di tipo omico, in un sistema biologico, esso riflette quindi anche i cambiamenti della funzione fenotipica (3). In definitiva l analisi del metaboloma permette, insieme ad altre valutazioni omiche, cliniche e di imaging, di delineare il fenotipo metabolico individuale (Fig. 1). La metabolomica si basa sullo studio sistematico di una serie completa di metaboliti in un campione biologico; praticamente quasi tutti i campioni biologici possono essere sottoposti a questa analisi: urine, sangue, tessuti, cellule, pus, liquido amniotico, feci ecc. Questa tecnologia si avvale di due fasi sequenziali principali: 1) una fase sperimentale, basata su analisi effettuate con i metodi spettroscopici di analisi metabolica. I principali metodi spettroscopici sono: la risonanza magnetica nucleare (nuclear magnetic resonance, NMR), progettata per valutare composti a basso peso molecolare, la gascromatografia spettrometrica di massa (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) e la cromatosmi. Le sue applicazioni, presenti e future, in ambito ostetrico sono molteplici. In termini pratici la metabolomica, attraverso l analisi dei metaboliti, permette di analizzare il singolo prodotto finale della attivazione/inattivazione genica, che a sua volta comporta una attivazione/inattivazione del RNA messaggero, che può mettere in moto la potente macchina enzimatica analizzata dal proteoma. Si tratta quindi di valutare il prodotto finale del metabolismo. Questa analisi permette di comprendere ciò che è realmente successo a livello metabolico e non ciò che potrebbe succedere (genomica) o che forse succederà (trascrittomica/proteomica). In pratica qualsiasi piccola molecola con una massa inferiore a 1 kda può essere rivelata dall analisi metabolomica. Essendo il prodotto finale metabolico influenzato dall ambiente, l analisi metabolomica consente un interessante incrocio di informazioni, essa permette di analizzare le relazioni tra genotipo e fenotipo e di correlare queste informazioni tra loro. La malattia diabetica, in gravidanza o no, è caratterizzata da una stretta correlazione tra eventi genotipici (ereditarietà) e comportamento fenotipico (ambiente, esercizio, alimentazione), di conseguenza può trarre dallo studio metabolomico enormi vantaggi conoscitivi e terapeutici. La moderna metabolomica sorge da un intuizione di Arthur Robinson. Nel 1970, mentre lavorava presso il dipartimento di chimica all Università della California di San Diego, somministrando vitamina B6 a esseri umani e analizzando gli esiti dell analisi cromatografica, Robinson si rese conto che nell urina vi erano migliaia di costituenti chimici che contenevano informazioni potenzialmente utili. In realtà Robinson stava cercando di comprendere meglio le conseguenze dell idea di Linus Pauling, che la variabilità biologica possa essere spiegata anche dall analisi nutrizionale. Insieme Robinson e Pauling pubblicarono nel 1971 su Proceedings of the Metodi di misurazione del fenotipo metabolico Tecniche di imaging Clinica Scienze omiche Bioinformatica/ analisi statistica dei dati Fenotipo Genotipo Stato globale di salute Fenotipo metabolico Stile di vita Database Dieta acuta Stato mentale/ emozionale Dieta cronica Microflora intestinale Forma fisica Danni tessutali Figura 1 Il fenotipo metabolico individuale. Fattori che influenzano il fenotipo metabolico Raccolta, analisi e interpretazione dei dati biochimici e molecolari

178 A. Ragusa e A. Lapolla grafia liquida spettrometrica di massa (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS); 2) l analisi multivariata dei dati e la loro interpretazione; quest ultima fase prevede anche la consultazione di apposite librerie di dati (4) (Fig. 2). La spettrometria di massa accoppiata a diverse tecniche di separazione cromatografica, come la liquido o la gascromatografia e la NMR, sono i principali strumenti per analizzare un gran numero di metaboliti contemporaneamente. A causa dell enorme diversità delle strutture chimiche e delle loro grandi varietà e abbondanza, diversi approcci complementari devono essere utilizzati per estrarre, rilevare, quantificare e identificare i molti metaboliti possibili (5,6). Dopo le due fasi sequenziali principali, la fase successiva è rappresentata dall estrazione e dall interpretazione delle informazioni in un contesto biologico complesso, caratterizzato dalla grande quantità di dati prodotta dalle tecno - logie viste sopra. L applicazione di sofisticate tecniche di analisi statistica di tipo uni- e multivariato, che utilizza strumenti, tra cui l analisi dei cluster, la mappatura, le sovrapposizioni comparative e le heatmap, ha rappresentato non solo un emozionante e rapido processo di apprendimento per i biochimici, ma ha anche dimostrato che la modalità di pensiero dominante in biologia deve cambiare, per consentirci di affrontare grandi insiemi di dati e distinguere tra rumore e reali informazioni correlate al campione. Non possiamo più pensare solamente alla singola via metabolica, ma dobbiamo analizzare le interrelazioni complesse tra questa e gli altri sistemi, un chiaro esempio è il rapporto esistente tra il microbiota intestinale, l obesità e l omeostasi glucidica. In definitiva la metabolomica ha permesso di identificare e quantificare migliaia di molecole a basso peso molecolare simultaneamente, permettendoci di avere una fotografia dello stato metabolico globale, a livello sia tessutale sia cellulare dell organismo in toto; questo consente di correlare dinamiche di tipo genetico con dinamiche fenotipiche. I cataboliti, analizzati dalla metabolomica, possono essere considerati come una lingua, uno scambio di segnali tra o da l architettura genetica e l ambiente (7) pertanto, la metabolo- mica consente di fornire una diretta lettura funzionale dello stato fisiologico/patologico di un organismo (8). Esistono almeno tre differenti approcci concettuali in metabolomica: l analisi target (target analysis) il profilo metabolico (metabolite profiling) e l impronta metabolica (meta - bolic fingerprinting): 1) l analisi target è applicata da molto tempo e comprende la determinazione e la quantificazione di un piccolo insieme di metaboliti noti (obiettivi) utilizzando una particolare tecnica analitica specifica; 2) il profilo metabolico mira all analisi di un grande set di composti, sia preidentificato sia sconosciuto rispetto alla loro natura chimica. Questo approccio è stato applicato per molti sistemi biologici diversi, tra cui piante (9), microbi (10), urine (11) e campioni di plasma (8) ; 3) l impronta metabolica, la firma o il profilo di massa del campione di interesse viene generata e quindi confrontata in un ampio campione di popolazione per valutare le differenze tra i dati. Quando i segnali in grado di discriminare in modo significativo i campioni vengono rilevati, i metaboliti sono identificati e la rilevanza biologica di tali composti può essere chiarita notevolmente. L analisi dei metaboliti nei fluidi corporei, soprattutto sangue e urine, è praticata in maniera ordinaria per valutare il rischio di diabete (12,13). La metabolomica è stata utilizzata per valutare le differenze tra il plasma di soggetti sani e quello di soggetti diabetici, con l obiettivo di generare l impronta metabolica e scoprire le differenze tra le due differenti popolazioni. In questo modo sono stati identificati cinque potenziali biomarcatori: glucosio, acido 2-idrssibutirrico, acido linoleico, acido palmitico e fosfato, caratteristici della malattia diabetica. Questi risultati evidenziano come l aumento di concentrazione degli acidi grassi liberi sia un fattore essenziale nella patofisiologia del diabete mellito. I dati riflettono sia le iperglicemie sia la deregolazione del metabolismo degli acidi grassi. Questi marker plasmatici potenziali, sopratutto l acido palmitico, l acido linoleico e l acido 2-idrossibutirrico, potrebbero rivelarsi utili, non solo nella malattia diabetica, ma anche nella gravidanza diabetica, per monitorare l andamento della malattia (14). Campione bilogico: Sangue Feci Intrepretazione e analisi globale dei dati Urine ecc. Acquisizione spettrale del campione Importazione e immagazzinamento dati Analisi statistica Figura 2 Fasi sequenziali dell analisi metabolomica (modificata da Nicholson et al., 2002 (4) ).

La metabolomica : che cos è e che cosa può dirci nel diabete in gravidanza 179 È noto da tempo che i bambini che sviluppano il diabete di tipo 1 possono avere marcatori di rischio già nel sangue del cordone ombelicale. È stato ipotizzato che il rischio di diabete di tipo 1 in età precoce possa essere aumentato se si nasce da una gravidanza patologica e questo potrebbe riflettersi nei metaboliti presenti nel cordone ombelicale alla nascita. Un gruppo di studio della Lund University ha utilizzato la metabolomica per testare se il lipidoma nel sangue del cordone ombelicale è differente nei bambini cui la diagnosi di diabete di tipo 1 era effettuata prima degli otto anni di età. Lo studio caso-controllo ha coinvolto 76 bambini, con diagnosi di diabete di tipo 1 insorto prima di otto anni di età e 76 controlli sani, appaiati per il rischio, HLA, sesso e data di nascita, così come per l età della madre e l età gestazionale alla nascita. Lo studio ha rivelato che la concentrazione delle fosfatidilcoline e delle fosfatidiletanolammine ombelicali erano significativamente diminuite nei bambini cui la diagnosi di diabete di tipo 1 era effettuata prima dei quattro anni di età. Gli autori concludono sostenendo che l analisi metabolomica nel sangue del cordone ombelicale è in grado di identificare i neonati ad aumentato rischio di sviluppare diabete di tipo 1. I bassi livelli di fosfolipidi alla nascita potrebbero rappresentare i mediatori chiave che, attraverso modificazioni del sistema immunitario, determinerebbero la precoce comparsa di autoimmunità pancreatica (15). Questo studio, se confermato, avrà importanti conseguenze, in quanto la capacità di previsione della malattia diabetica è vitale per consentire la messa in atto di strategie preventivo/terapeutiche. Recentemente Connor et al., applicando un sistema integrato di analisi del metaboloma/trascrittoma al diabete di tipo 2, nei topi db/db e db/+ (controlli) ha trovato 24 differenti vie metaboliche correlate con il metabolismo lipidico, inclusa la gluconeogenesi, le disfunzioni mitocondriali, lo stress ossidativo e la sintesi degli aminoacidi; tali vie esprimono significative differenze nei topi in studio rispetto ai topi di controllo (16). Questi dati, se confermati nell uomo e nelle pazienti in gravidanza, potrebbero aiutarci a indirizzare le ricerche su particolari vie metaboliche. Suhre et al., applicando una multipiattaforma metabolomica, che utilizzava anche la risonanza magnetica insieme alla spettrometria di massa, su campioni di plasma di soggetti diabetici e di controllo, ha identificato 420 metaboliti presenti nel siero. Gli autori hanno trovato differenze significative soprattutto nelle vie metaboliche che afferivano al funzionamento renale, al metabolismo lipidico e interessanti interazioni della microflora intestinale residente che passano attraverso il ciclo degli acidi biliari (17).Questo studio è molto promettente poiché, come sostengono gli autori: Al di là della moltitudine di metaboliti misurati, quello che emerge dal nostro studio è una visione olistica delle differenze che riflettono le variazioni globali nella fisiopatologia della malattia. Gli studi sulla microflora intestinale sono particolarmente promettenti se pensiamo alla gravidanza; potrebbero permettere di mo - dificare l alimentazione per contribuire sia alla riduzione della prevalenza del diabete in gravidanza, come anche l im - postazione di diete specifiche, personalizzate e mirate alla modificazione della microflora intestinale. Da quanto detto finora appare chiaro che la metabolomica può essere utilizzata nella malattia diabetica e in particolare nel diabete in gravidanza sia per acquisire conoscenze sui meccanismi patogenetici della malattia sia per trovare biomarcatori che possano essere utilizzati a fini diagnostici, e per valutare gli effetti terapeutici dei farmaci e/o degli alimenti. La gravidanza complicata da diabete pregestazionale è gravata da una serie di complicanze materne e fetali che possono essere ridotte se il controllo glicemico è ottimale (18-20). Anche nelle pazienti affette da diabete gestazionale (gestational diabetes mellitus, GDM), la cui prevalenza è notevolmente aumentata negli ultimi anni in relazione all aumento dell obesità nelle donne in età fertile (21), il trattamento si è dimostrato utile nel prevenire gli esiti avversi (22). Il GDM inoltre, determina, per la madre, un notevole aumento del rischio di sviluppare un diabete di tipo 2 dopo il parto, e nel nascituro un aumento del rischio di obesità e alterazioni della tolleranza ai carboidrati in età adulta (23). In due gruppi di pazienti gravide che hanno partecipato all HAPO study, l analisi metabolomica del siero di queste pazienti eseguita con due differenti metodiche, la spettrometria di massa per la misurazione degli aminoacidi e la gascromatografia, ha rivelato che le pazienti con elevata glicemia plasmatica a digiuno (> 90 percentile) rispetto alle pazienti con bassi livelli glicemici a digiuno (< 10 percentile) avevano un profilo metabolico coerente con l insulino-resistenza: alti livelli di trigliceridi, 3-idrossibutirrato e aminoacidi, inclusi alanina, prolina e aminoacidi a catena ramificata. In sostanza l analisi metabolomica ha rivelato importanti alterazioni nel metabolismo dei principali macronutrienti e degli aminoacidi nelle madri con livelli di glucosio elevati a digiuno (24). Il GDM è associato, inoltre, a una serie di modifiche del tessuto placentare quali l aumento di peso, determinato da un aumento della cellularità, l aumento della vascolarizzazione e dei livelli di insulina fetale, tutte cause ben note di ipossia fetale. Recentemente la spettrometria di massa associata a elettroforesi bidimensionale in gel è stata utilizzata per va - lutare l espres sione proteica della placenta di donne affette da GDM (25). I risultati dello studio hanno evidenziato un au - mentata espressione a livello placentare di 15 proteine associate a insulino-resistenza, al trasporto transplacentare del glucosio, alla coagulazione e alla fibrinolisi. In un successivo lavoro, utilizzando un approccio di spettrometria di massa MALDI associato a elettroforesi bidimensionale in gel, l espressione proteica placentare è stata studiata in donne affette da GDM in buon controllo glicemico (26). I risultati dello studio hanno evidenziato modeste alterazioni dell espressione di alcune proteine, suggerendo che se il GDM è ben controllato il proteoma placentare è poco compromesso. Un recente lavoro ha confrontato il profilo metabolico dei neonati di madri affette da diabete gestazionale trattate in modo intensivo, con quello dei nati da madri sane. I risultati dello studio hanno evidenziato che i neonati da madri affette da GDM hanno livelli di glucosio più bassi e più alti livelli di piruvato, istidina, alanina, valina, metionina, arginina, lisina, ipoxantina, lipoproteine e lipidi rispetto ai controlli, suggerendo che una prolungata esposizione del feto all iperglicemia, durante la gravidanza, può cambiare il suo profilo metabolico alla nascita (27). Nell ottica della prevenzione è lo studio di Diaz et al. (28) ; essi

180 A. Ragusa e A. Lapolla Genetic data Gene set enrichment analysis Metabolomics data MetScape Compound network Compound - Reaction network Compound - Reaction enzyme - Gene network Gene - Compound network Figura 3 Funzionamento di MetScape. hanno dimostrato che le urine di donne che successivamente svilupperanno diabete gestazionale presentano elevati livelli di 3-idrossiisovalerato e 2-idrossiisobutirrato, probabilmente a causa dello stato alterato della biotina e degli aminoacidi e/o del metabolismo intestinale (quest ultimo forse in relazione ai valori di BMI più elevati trovati in queste pazienti). I dati provenienti dalle scienze omiche potrebbero quindi consentirci di disegnare il fenotipo della malattia diabetica, nonché la sua progressione, consentendoci di comprendere perché alcune pazienti sviluppano diabete in gravidanza e altre no; inoltre sarà possibile comprendere perché alcuni pazienti sviluppano complicanze e quali sono gli indici prognostici di tipo biochimico della malattia diabetica in gravidanza. La sfida per il prossimo futuro consiste nel combinare strategie per identificare e quantificare i metaboliti cellulari e sistemici, utilizzando le sofisticate tecnologie analitiche sopradescritte, applicando successivamente, ai dati ottenuti, le tecniche della statistica uni- e multivariata, utilizzando infine metodi per l estrazione di informazioni e l interpretazione dei dati. Con questo obiettivo in mente, sono state create delle piattaforme bioinformatiche come il Plugin MetScape per Cytoscape che fornisce gli strumenti di bioinformatica per la visualizzazione e l interpretazione dei dati metabolomici e inserisce questi dati nel contesto del metabolismo umano. Questa piattaforma, gratuita, consente agli utenti di creare e analizzare le reti di geni e di composti, individuare percorsi arricchiti da dati di profili di espressione e di visualizzare le modifiche nei dati del metabolita (Fig. 3) (29-31). La speranza è che, utilizzando questi strumenti, i ricercatori possano generare ipotesi sulle reti metaboliche principali utilizzate dalla malattia diabetica, reti che rispondano a partico- lari tipi di intervento che possono successivamente essere testati per il loro valore terapeutico (32). Conflitto di interessi Nessuno. Bibliografia 1. Pauling L, Robinson AB, Teranishi R, Cary P. Quantitative analysis of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography. Proc Natl Acad Sci USA 1971;68(10):2374-6. 2. Oliver SG, Winson MK, Kell DB, Baganz F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol 1998;16:373-8. 3. Ryan D, Robards K. Metabolomics: The greatest omics of them all? Anal Chem 2006;78:7954-8. 4. Nicholson JK, Connelly J, Lindon JC, Holmes E. Metabono - mics: A platform for studying drug toxicity and gene function. Nat Rev Drug Discov 2002;1(2):153-61. 5. Roessner U, Beckles DM. Metabolite measurements. In: Schwender J, ed. Plant metabolic networks. New York: Springer 2009. 6. Villas-Bôas SG, Roessner U, Hansen M, Smedsgaard J, Nielsen J. Metabolome analysis: An introduction. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons Inc. 2007. 7. Jewett MC, Hofmann G, Nielsen J. Fungal metabolite analysis in genomics and phenomics. Curr Opin Biotechnol 2006;17:191-7. 8. Gieger C, Geistlinger L, Altmaier E, Hrabé de Angelis M, Kronenberg F, Meitinger T et al. Genetics meets metabolomics:

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