STUDIO DELLA FLORA MICROBICA INTESTINALE F Agnese Miranda, Raffaella Zagaria, Antonietta G. Gravina, Marco Romano Dipartimento Medico Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale - Gastroenterologia ed Azienda Ospedaliera Universitaria, Seconda Università di Napoli INTRODUZIONE Il microbiota intestinale è l insieme di microorganismi che popolano il nostro intestino. Quest ultimo è uno degli ecosistemi microbici con la maggiore densità di popolazione. Il microbiota intestinale umano ha un carico elevato di microorganismi ed è pari ad un peso di circa 1 kg. La maggior parte di questi microorganismi è localizzata nel colon. Inoltre il microbiota intestinale umano, spesso indicato come a forgotten organ of the human body, contiene un numero di geni almeno 100 volte superiore rispetto al genoma umano. Alla luce di ciò possiamo affermare che l uomo può essere considerato un superorganismo costituito da cellule umane e microbiche, il cui corredo genetico è rappresentato dall insieme dei geni presenti nel genoma umano e nel genoma del microbiota intestinale (microbioma). La microflora intestinale è costituita da un insieme di microorganismi presenti nel lume intestinale, i quali, se convivono in un determinato equilibrio, contribuiscono allo stato di salute dell ospite. Il corpo umano è costituito da circa 10.000 miliardi di cellule e ospita una popolazione batterica di circa 100.000 miliardi di cellule, in rapporto di 1:10. Attualmente sono stati identificati circa 400 specie di batteri della microflora intestinale e, di questi, circa 30 specie sono pressoché sempre presenti in ciascun singolo individuo. In particolare, i bifidobatteri rappresentano il 90% della flora intestinale dei neonati; percentuale che si riduce attorno al 50% negli individui adulti. Specie e ceppi autoctoni di batteri vengono selezionati da ciascun individuo, secondo le proprie abitudini alimentari e la propria fisiologia. Alcuni batteri sono benefici, ma dopo una mutazione possono divenire dannosi liberando tossine. La maggior parte dei microorganismi che coabitano con l uomo si trova nel tratto gastrointestinale (apparato digerente). La loro distribuzione varia grandemente lungo la superficie di circa 350 m 2, in cui si svolge la digestione dei cibi, grazie a pliche, villi, microvilli e cripte che sono posizionati sulla parete del tubo digerente. Il mantenimento di questo ordine microbatterico è fondamentale per il buon funzionamento dell intestino, la salute complessiva dell organismo umano e la completa maturazione del sistema immunitario. COMPOSIZIONE E LOCALIZZAZIONE Il microbiota intestinale è composto principalmente da batteri anaerobi (95%) e solo in minima misura da batteri aerobi (5%). Lattobacilli, bifidobatteri, batterioidi ed enterococchi sono le specie batteriche che sono state studiate più diffusamente, mentre le funzioni di clostridi, lieviti ed altri sono ancora oggetto di valutazione. Nel piccolo intestino i batteri commensali sono prevalentemente gram-positivi, mentre nel grosso intestino stazionano batteri gram-negativi. La prima parte del colon ospita germi deputati alla fermentazione dei carboidrati, il secondo tratto invece ospita germi deputati alla metabolizzazione di proteine e aminoacidi. La proliferazione batterica è rapida nel colon ascendente, dove il ph è acido, più lenta nel tratto discendente dove il ph tende alla neutralità. Nel lume intestinale il mantenimento e/o le variazioni del ph risultano essere un efficace meccanismo di controllo della crescita batterica. Con il progredire dell età, varia la composizione batterica: durante l allattamento l intestino dell infante viene colonizzato da batteri ambientali e di provenienza materna (provenienti cioè dal latte, dalla suzione e dal contatto fisico). L allattamento al seno provoca un abbassamento del ph e quindi un ambiente favorevole ai bifidobatteri che stimolano le funzioni immunitarie. Al contrario il ph intestinale dei bambini allattati artificialmente risulta più elevato, ne consegue che le enterobatteriacee (e fra queste anche i germi patogeni) conoscono una crescita più spiccata a scapito dei bifidobatteri. Con lo svezzamento e l introduzione di cibi solidi la composizione della microflora diventa simile a quella degli adulti. Sulla base del comportamento dei microorganismi nei riguardi dell ospite (uomo) i batteri intestinali vengono classificati in potenzialmente dannosi (come proteus, candida, clostridi, staphylococcus), indifferenti come (bacteroides, enterococcos) e benefici (come lactobacillus, eubacterium, bifidobacterium). FUNZIONI Il microbiota intestinale svolge una serie di funzioni essenziali per il benessere del nostro organismo: corretta maturazione morfologica e funzionale del tratto digerente; attività dei processi digestivi; metabolizzazione (di proteine di zuccheri e lipidi; di acidi biliari e ormoni steroidei); controllo quali- quantitativo dei gas intestinali; produzione di vitamine (vit. K e complesso B) e utilizzazione di vitamine esogene; metabolizzazione di diversi farmaci; rappresenta una vera e propria barriera di protezione nei confronti delle aggressioni da batteri nocivi o da agenti dannosi di natura alimentare o virale. Maturazione morfologica Studi condotti su animali privati della flora intestinale hanno evidenziato la presenza di villi più sottili con una diminuzione della profondità delle
cripte e un ridotto spessore della mucosa. Sono rilevabili, inoltre, anche anomalie del sistema immunitario locale. I batteri svolgono, dunque, un ruolo indispensabile per un corretto sviluppo e un adeguata funzionalità del sistema immunocompetente proprio a livello dell intestino, dove la risposta immunitaria è scarsa e viene a mancare una valida protezione delle mucose dall invasione dei microorganismi patogeni. Metabolizzazione zuccheri e proteine Nell ambito dei processi digestivi possiamo fare una distinzione di massima tra flora fermentativa in grado di digerire amido e altri polisaccaridi e flora putrefattiva per la digestione delle proteine, localizzate per lo più a livello del colon. Metabolizzazione acidi biliari L acido colico e chenodesossicolico (acidi biliari primari) sintetizzati a livello epatico e secreti con la bile, vengono trasformati a livello intestinale rispettivamente in desossicolico e litocolico (acidi biliari secondari), vengono quindi sequestrati all interno del lume intestinale e resi non disponibili per il circolo enteroepatico. Produzione gas intestinali Fondamentale è il ruolo svolto nel controllo della produzione quali-quantitativa dei gas intestinali. Essi infatti derivano dai processi di metabolizzazione da parte dei microorganismi di sostanze endogene (muco e cellule di sfaldamento) ed esogene (alimenti). Produzione vitamine La popolazione batterica è responsabile della sintesi di numerose vitamine: vit. K, complesso B, acido folico, biotina, acido pantotenico e vitamina C. Essa inoltre è in grado di utilizzare vitamine introdotte con la dieta. È noto infatti come la somministrazione di alcuni farmaci, soprattutto antibiotici e sulfamidici, in grado di alterare la normale flora batterica intestinale, possa determinare una situazione di disvitaminosi. Metabolizzazione dei farmaci Tra le sostanze esogene prendiamo in considerazione anche i farmaci che la microflora è in grado di metabolizzare dando origine ad una molteplicità di composti che possono risultare farmacologicamente attivi, inattivi o addirittura tossici. Per questa e tutte le altre funzioni sopracitate risulta quindi evidente come il mantenimento dell equilibrio dell ecosistema intestinale sia fondamentale al fine di preservare lo stato di salute e di benessere di ogni individuo. RUOLO DELLA FLORA BATTERICA NELLA PREVENZIONE DELLE INFEZIONI La flora batterica ha un ruolo nella prevenzione delle infezioni tramite attraverso antagonismo diretto; produzione di batteriocine, produzione di sostanze ad attività antibatterica verso alcuni ceppi di batteri grampositivi e gram-negativi; competizione per i nutrienti; competizioni per i recettori cellulari; capacità di aderire alle cellule mucose intestinali, sottraendo spazio ai batteri patogeni (Lattobacilli in particolare); stimolazione dell immunità e capacità di attivare una risposta immunitaria aspecifica, aumentando l attività macrofagica e la produzione di Ig-IFN, di IgGA e di peptidi a basso PM, capaci di interferire nelle risposta immunitaria. L equilibrio della flora batterica intestinale può essere facilmente compromesso dai seguenti fattori: alimentazione non equilibrata, eccessivo stress, terapie con antibiotici ed episodi di diarrea. Uno squilibrio della flora batterica intestinale può manifestarsi con disturbi gastrointestinali, gonfiore addominale, cattiva digestione, acne, seborrea e pelle impura. MICROBIOTA E ALTERAZIONI DEL TRATTO GASTROINTESTINALE MICROBIOTA ED INFIAMMAZIONE INTESTINALE IN SALUTE ED IN MALATTIA All interno del tratto GI, i batteri hanno un rapporto di reciproco beneficio con il loro ospite, necessario al mantenimento della normale funzione immunitaria della mucosa, dell integrità della barriera epiteliale, della motilità ed all assorbimento dei nutrienti. La rottura di questo rapporto altera la funzione gastrointestinale predisponendo automaticamente alla malattia. Gli studi sugli animali suggeriscono che le perturbazioni comportamentali derivanti da stimoli esterni, come ad esempio lo stress, possono determinare importanti cambiamenti nella composizione del pattern del microbiota intestinale. Tali cambiamenti sono associati ad un aumento della sensibilità a stimoli pro-infiammatori nel tratto GI. I meccanismi che sottendono queste alterazioni possono comportare modifiche nella normale fisiologia del tratto GI responsabili del- l alterazione dell habitat dei batteri enterici. Inoltre, è stato visto come la perturbazione sperimentale del microbiota può alterare il comportamento, inducendo nei topi germ-free linee comportamentali diverse da quelle dei topi colonizzati. Ottenere una migliore comprensione del rapporto tra comportamento e il microbiota intestinale può fornire la comprensione della patogenesi dei disturbi intestinali funzionali e delle patologie infiammatorie. MICROBIOTA E IBIS La sindrome del colon irritabile (IBS) è il risultato di alterazioni della funzione motoria e secretiva gastrointestinale, delle sensazioni viscerali, ma anche dell attività del sistema nervoso centrale e del sistema nervoso autonomo variamente associate tra loro. La predisposizione genetica e il profilo psicologico concorrono con stimoli ambientali, psicosociali ed endoluminali allo sviluppo dell IBS. Inoltre vi è un aumentata eterogeneità del microbiota intestinale rispetto ai pazienti sani in particolare riguardo ai firmicutes, batteri gram-positivi non coltivabili e di cui non si conoscono le funzioni, che abitano normalmente nel colon umano e sono naturali ospiti della flora microbica normale. MALATTIE INFIAMMATORIE DELL INTESTINO L alterazione della flora batterica intestinale sembra giocare un ruolo patogenetico importante nelle malattie infiammatorie dell intestino (i.e. Colite Ulcerosa e morbo di Crohn). In particolare, numerosi casi di colite ulcerosa e morbo di Crohn sembrerebbero dipendere proprio
dalla scarsa produzione intestinale di IgA e IgG, la cui riduzione sarebbe causata proprio da un alterazione della microflora batterica. Di conseguenza, l intestino ha difficoltà a proteggersi dall aggressione di agenti nocivi, batteri e sostanze sfuggite alla digestione e mette in azione particolari automatismi cellulari di risposta infiammatoria tesi all eliminazione del fatto-re aggressivo; questi meccanismi, alla lunga, potrebbero contribuire all instaurarsi di una condizione infiammatoria cronica dell intestino. INTEGRAZIONE DEL MICROBIOTA NELL ASSE INTESTINO-CERVELLO Nonostante siano molte le conoscenze sulla fitta rete di comunicazione esistente tra il tratto gastrointestinale (GI) e il sistema nervoso centrale, la capacità del sistema nervoso centrale di influenzare il microbiota e viceversa risulta scarsamente studiata. Mentre le interazioni bidirezionali cervello-intestino sono dei meccanismi ben noti ormai da tempo, il ruolo della flora enterica in tale interazione (includendo in questa sia gli organismi commensali che quelli patogeni) è stato messo in evidenza soltanto negli ultimi anni. Il cervello può influenzare il microbiota intestinale in maniera indiretta, attraverso cambiamenti della motilità, secrezione e permeabilità intestinale, oppure in maniera diretta, attraverso molecole di signaling cellulare rilasciate nel lume intestinale dalle cellule della lamina propria (cellule enterocromaffini, neuroni, cellule del sistema immunitario). La comunicazione tra il microbiota intestinale e l ospite può avvenire attraverso molteplici meccanismi: in condizioni fisiologiche il signaling recettore-mediato dalle cellule epiteliali, allorché sussista un aumentata permeabilità intestinale, determina la stimolazione diretta delle cellule ospiti nella lamina propria. Le cellule enterocromaffini sono importanti trasduttori bidirezionali che regolano la comunicazione tra il lume intestinale e il sistema nervoso. L innervazione afferente vagale delle cellule enterocromaffini fornisce un pathway diretto per il signaling dalle cellule enterocromaffini alle cellule neuronali, collegamento che potrebbe avere un ruolo importante nella modulazione del dolore e della risposta immunitaria, nel controllo del background emozionale e di altre funzioni omeostatiche. La persistenza di perturbazioni delle interazioni bidirezionali tra il microbiota intestinale ed il sistema nervoso potrebbe rappresentare un passaggio fondamentale nella fisiopatologia di malattie gastrointestinali acute e croniche, come ad esempio i disturbi intestinali funzionali e le patologie infiammatorie. STUDIO DEL MICROBIOTA INTESTINALE Metodiche Coltura Dipendenti Il microbiota si identifica in base alle forme specifiche e alle variazioni morfologiche (di forma) che esso può auto-indurre in funzione del luogo o terreno dell ospite, nel quale si trova a vivere. Le metodiche culturadipendenti sono quindi basate su caratterizzazioni fenotipiche quali la morfologia, richieste nutrizionali, profili fermentativi. Tale metodiche hanno dei limiti come la difficoltà ad ottenere campioni rappresentativi dalle differenti niches intestinali per mancanza di mezzi di coltura realmente selettivi; scarsa riproducibilità; basso potere discriminatorio; ambiguità di risultati. High-Throughput Culturing Metodica utilizzata per isolare le specie microbiche da ambienti non di origine laboratoristica tramite l uso di micro-beads o di superfici solide con multiplex. Tale tecnica permette di coltivare migliaia di batteri simultaneamente. Il limite di tale metodica è costituito dal fatto che i microbi del tratto GI hanno stabilito nel corso dell evoluzione relazioni con l ospite o altri microbi che li rendono dipendenti dall attività metabolica dell ecosistema in cui vivono. Pertanto, è difficile coltivarli al di fuori del loro ecosistema. Utilizzo della Biologia Molecolare La biologia molecolare grazie ai suoi costi relativamente bassi, alla sempre maggiore rapidità del sequenziamento del DNA ed ai progressi compiuti negli approcci computazionali per l analisi di complessi dataset ha permesso la transizione dalla fenotipizzazione batterica convenzionale alla genotipizzazione e all approccio molecolare. Le tecniche di biologia molecolare si basano sullo studio della small subunit ribosomal RNA (16S rrna). L RNA ribosomiale è la tipologia più abbondante di RNA presente nella cellula. Non codifica direttamente le proteine, ma è il componente essenziale (circa i due terzi) dei ribosomi, macchine catalitiche che provvedono all assemblaggio delle proteine, presenti in tutte le cellule viventi. Consiste di circa 1.5 kb, dimensione ragionevole per analisi di sequenza comparativa, ha un numero sufficiente di regioni ipervariabili che riflettono la divergenza nell evoluzione di specie differenti; il suo sequenziamento è un metodo utile per identificare e classificare sul piano filogenetico batteri intestinali.attualmente oltre 600.000 sequenze del gene 16S rrna sono disponibili in GeneBank. Le sequenze di rrna possono essere clusterizzate in gruppi correlati sulla base della % di identità della sequenza stessa. Sono stati stabiliti i cut-off del 95% e 98% per delimitare, rispettivamente, genere e specie batterica. Per filotipo si intende un gruppo filogenetico di microbi, con un cluster di sequenze del gene 16S rrna caratterizzate da un identità di sequenze 97%. La Tabella 1 indica le principali tecniche di biologia molecolare adoperate per lo studio del microbiota intestinale. La clonazione e successivo sequenziamento del gene 16srRNA è utilizzata principalmente per ottenere approfondite informazioni sul piano filogenetico. Il fingerprinting permette il confronto di diverse comunità microbiche e il monitoraggio della loro dinamica. La FISH permette di quantizzare e localizzare specifiche comunità microbiche. Nel loro complesso tali metodiche hanno contribuito ad aumentare le nostre conoscenze filogenetiche del microbiota intestinale e di comprendere l impatto di ospite d ambiente sulla struttura e dinamica del microbiota stesso. Tabella 1. Tecniche di studio sulla diversità microbica intestinale. Clonazione e successivo sequenziamento del gene 16S rrna; Fingerprinting del gene 16S rrna mediante elettroforesi con gel a gradiente di denaturazione (DGGE); Fluorescent In Situ Hybridization (FISH); High-throughput Phylogenetic DNA Microarray. Nel corso degli ultimi 10 anni la tipizzazione di batteri intestinali tramite tecniche coltura-dipendenti si è completamente arrestata e come si è assistito ad un aumento drammatico del numero di filotipi GI evidenziati mediante tecniche di biologia molecolare.
Le Figure 1 e 2 indicano in maniera schematica come sia possibi-le identificare e classificare un batterio intestinale coltivabile (Figura 1) e non coltivabile (Figura 2). Nella Figura 3 è invece schematizzata la analisi del microbiota intestinale attraverso sequenziamento ed analisi filogenetica mediante microarray (phylogenetic microarray assay). In breve, le specie batteriche presenti in un determinato campione intestinale potranno essere identificate e quantificate grazie ad ibridazione di RNA trascritto dal DNA estratto da una comunità microbica e successivamente marcato con microchips precostituiti e contenenti migliaia di sequenze geniche batteriche note. La biologia molecolare ci ha permesso di stabilire che il microbiota intestinale umano consiste di un core individuale stabile di microbi (colo- Figura 1. Identificazione dei batteri. nizzatori stabili), circondati da microbi che sono visitatori temporanei, in associazione ad un core di batteri comune a tutta la specie umana. L analisi del microbiota intestinale umano attraverso Phylogenetic Microarray Assay presenta alcuni limiti. In particolare, una volta stabilita una correlazione tra microbiota intestinale ed una determinata condizione patologica intestinale, come possiamo stabilire che esista un rapporto di causa-effetto tra l alterazione del microbiota intestinale e lo specifico quadro di malattia? E, nel caso siamo in grado di stabilire che l alterazione del microbiota intestinale sia la causa di una determinata patologia intestinale, come possiamo definire i meccanismi patogenetici di tale associazione? In questo ci viene in soccorso lo studio della metaomica (Figura 4). Figura 2. Identificazione dei batteri non coltivabili. Figura 3. High-throughput analisi del microbiota GI umano mediante sequenziamento e Phylogenetic Microarray Analysis. Una volta identificata la specie microbica caratteristica di una specifica condizione di malattia, dobbiamo sapere quali RNA della specie identificata vengano trascritti (meta-transcriptomica), quali proteine vengano sintetizzate (meta-proteomica), quali metaboliti vengano prodotti (meta-metabolomica), quale sia il potenziale genetico della specie batterica identificata (meta-genomica). La meta-genomica è lo studio coltura-indipendente, DNA-based, di strut- tura e funzioni delle comunità microbiche di un determinato ecosistema e delle loro interazioni con gli habitats da esse occupati. Si basa sulla estrazione di DNA, clonazione di frammenti di DNA in ospite adatto (E. coli), formazione di una libreria meta-genomica utile per effettuare successivamente un analisi sequence-driven o function-driven. L analisi sequence-driven ci fornisce un istantanea della diversità genetica di un determinato ecosistema. L analisi function-driven attraverso lo
Figura 4. Meta omics. screening di librerie meta-genomiche ci permette di individuare nuovi enzimi o funzioni di particolare interesse (ad es. antibiotico-resistenza), e di identificare il network metabolico di una determinata comunità microbica (meta-metabolomica). RIASSUNTO E PROSPETTIVE FUTURE Il microbiota intestinale in gran parte non è caratterizzabile mediante coltura (the unculturables ). Sviluppo di tecniche coltura-indipendenti con analisi di 16S rrna necessarie. Il microbiota intestinale è individuo- e sede-specifico con enorme diversità. Il Phylogenetic Microarray Assay permette la simultanea analisi di migliaia di microbi per lo studio del microbiota GI in salute e malattia. Il microbiota intestinale fluttua intorno ad un core di colonizzatori stabili e le sue modifiche sono associate ad IBD ed IBS. Le tecniche di biologia molecolare ci permettono di stabilire correlazioni tra microbiota e caratteristiche dell ospite ma non ci consentono l estrapolazione di funzioni microbiche. Meta-genomica e meta omics necessari per informazioni sul potenziale genetico ed attività del microbiota GI umano. Microorganismi che risiedono nel tratto GI costituiscono un importante fattore ambientale che contribuisce allo stato di salute o malattia dell uomo. In futuro dovremo essere in grado: a) di stabilire associazioni statisticamente rilevanti tra filotipi microbici, attività microbiche e stato di salute/malattia; b) di adoperare le nostre conoscenze sulla composizione e la attività del microbiota umano come indice diagnostico e prognostico della salute umana e dovremo sviluppare composti che hanno come bersaglio specifiche linee microbiche, prodotti genici e vie metaboliche, al fine di utilizzarli come potenziali nuovi agenti terapeutici per promuovere lo stato di salute. BIBLIOGRAFIA Camp JG, Kanther M, Semova I, Rawls JF. Patterns and scales in gastrointestinal microbial ecology. Gastroenterology 2009; 136:1989-2002. Collins SM and Bercik P. The relationship between intestinal Microbiota and the central nervous system in normal gastrointestinal function and disease. Gastroenterology 2009; 136:2003-14. Zoetendal EG, Rajilic-Stojanovic M, de Vos WM. High-throughput diversity and functionality analysis of the gastroinestinal tract microbiota. Gut 2008; 57:1605-15.