UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN MEDICINA VETERINARIA DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI, BIOTECNOLOGIE VETERINARIE, QUALITÀ E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI SEZIONE DI BIOCHIMICA VETERINARIA NEOSPORA CANINUM: STUDIO DELLA TRASMISSIONE VERTICALE NELLA VACCA DA LATTE NEOSPORA CANINUM: STUDY OF A VERTICAL TRANSMISSION IN DAM Relatore: Chiar.ma Prof.ssa LAURA HELEN KRAMER Correlatore: Prof.ssa SILVIA CLOTILDE CABASSI Laureanda: ELISA VALERUZ ANNO ACCADEMICO 2006-2007

A Dana Kalikos e Micia. Per il loro amore. - 2 -

Ringraziamenti I miei primissimi ringraziamenti vanno sicuramente alla Prof.ssa Laura Helen Kramer per l infinità disponibilità e l inimitabile professionalità. È solo grazie hai suoi preziosi consigli che questa tesi è diventata realtà. Un grazie anche alla prof.ssa Silvia Clotilde Cabassi, a Francesca Ghedini e Chiara Piancastelli (Istituto di Malattie Infettive) per la disponibilità e per il meticoloso lavoro svolto. Un grazie di cuore ad Antonio Olivieri e alla sua stupenda famiglia, per avermi permesso di approfondire il grande mondo della Neosporosi. Un grazie anche a tutti i loro animali, che hanno dovuto sopportarmi in ogni mio prelievo! Un ringraziamento affettuoso va sicuramente a tutta la mia famiglia. A mamma Margherita, a papà Eugenio e ai miei piccoli grandi fratelli, Giacomo e Gianmatteo. Il loro incoraggiamento ed ammirazione sono stati la forza che mi ha permesso di giungere fino a qui. A mio marito Sandro ed alla nostra splendida bimba Mariavittoria per la pazienza, la fiducia, la grinta e l amore che ogni giorno mi avete donato (ossigeno per il mio cuore e la mia mente!). Sono orgogliosa di voi! A Bruno ed Idelma per la stima e l affetto. Ai miei nonni che da lassù mi vegliano. Un grazie a tutti i medici veterinari (ormai colleghi!) che mi hanno seguita, aiutata e spinta al raggiungimento del mio obiettivo; in particolare il prof. Enrico Parmigiani, il dott. Valentini, il dott. Pretto, il dott. Buniotto, il dott. Brisighella, il dott. Alborali, il dott. Fiocco, il dott. Fanini e il sign. Gabriele Vallani. Grazie infinite per i vostri preziosi insegnamenti. Ed infine, ma non per ultimi, un grazie di cuore a tutti i miei amici di Parma e Verona. Ad Alessia, Alice, Chiara e Sara, per avermi sempre rallegrata nei giorni più tristi, dove tutto sembrava perduto; a Nadia, per le sue preziose traduzioni. Grazie infinite a tutti!! - 3 -

Abstract Neospora caninum is a protozoan parasite that has been identified as a major cause of abortion in dairy and beef cattle. Vertical transmission from mother to fetus is an important mode of maintaining the parasite within a herd. This thesis is aimed at evaluating the frequency of vertical transmission of N. caninum in an Italian dairy herd. Pre-colostral serology in calves showed 100% efficiency in transplacental infection from N. caninum-positive cows. These results confirm those of others and indicate that control and management of N. caninum infection must take into account the high frequency of vertical transmission. - 4 -

INDICE Abbreviazioni................................................ 8 Introduzione................................................. 9 PARTE GENERALE 1 Caratteristiche generali di Neospora Caninum....................15 Tassonomia............................................. 16 Caratteristiche morfologiche e differenziali di N. Caninum........ 20 Stadi morfologici......................................... 24 Stadio di tachizoita................................... 25 Stadio di bradizoita.................................. 29 Stadio di oocista..................................... 32 2 Ciclo vitale di Neospora Caninum.............................. 34 Ospite intermedio......................................... 38 Ospite definitivo.......................................... 42 Ciclo domestico e ciclo selvatico............................. 43 3 Epidemiologia: trasmissione di N. caninum nella vacca da latte...... 46 Trasmissione orizzontale................................... 46 Trasmissione verticale..................................... 48 Altre fonti di trasmissione.................................. 50-5 -

4 Patogenesi e sintomatologia................................... 52 Aborto nella bovina: modelli epidemiologici.................... 56 Aborto endemico.................................... 56 Aborto epidemico.................................... 56 Sintomatologia nel vitello................................... 58 5 Tecniche diagnostiche....................................... 59 DIAGNOSI DIRETTA..................................... 59 Esame istologico..................................... 61 Immunoistochimica.................................. 63 Cultura cellulare e inoculo in animali di laboratorio......... 64 Biologia molecolare.................................. 67 DIAGNOSI INDIRETTA................................... 73 Risposta anticorpale nel bovino......................... 73 Test sierologici...................................... 74 1. IFAT.......................................... 78 2. ELISA......................................... 79 3. Avidity test..................................... 82 4. Immunocromatografia............................ 83 6 Terapia................................................... 85 7 Profilassi.................................................. 88 Igienico-sanitaria......................................... 88 Immunizzante............................................ 91-6 -

PARTE SPERIMENTALE Scopo........................................................ 94 MATERIALI E METODI: Allevamento............................................ 95 Animali................................................ 95 Esami sierologici........................................ 96 IFAT............................................... 96 ELISA.............................................. 98 Risultati................................................ 99 Discussione dei risultati........................................104 Conclusioni................................................ 107 Bibliografia................................................ 109 Siti internet................................................ 123-7 -

ABBREVIAZIONI H. hammondi Hammondia hammondi H. heydorni Hammondia heydorni N. caninum Neospora caninum N. hughesi Neospora hughesi S. neurona Sarcocystis neurona T. gondii Toxoplasma gondii Ac Anticorpo Ac-PC Antibody-Peroxidase Coniugate Ag Antigene BVDV Bovine Viral Diarrhoea Virus CI-ELISA Competitive Inhibition Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA enzyme-linked immunosorbent assay EPM equine protozoal myeloencephalitis ICT Immunochromatographic test IFAT indirect fluorescent antibody test (immunofluorescenza indiretta) Ig immunoglobulina Iscom immunostimulating complex LEB Leukosis Enzootic Bovine LT Linfocita T LTC Linfocita T-citotossico MAb monoclonal antibody Nc Neospora caninum Nh Neospora hughesi pc plasmide combination PCR polymerase chain reaction PBS Phosphate Buffered Solution SAG surface antigen SRS surface-antigen related sequenze - 8 -

INTRODUZIONE Neospora caninum, è un parassita protozooario strettamente correlato con Toxoplasma gondii, responsabile di aborto nella bovina e di patologie nervose nei vitelli. È stato isolato per la prima volta nel 1984 in Norvegia in cani colpiti da encefalite e miosite (Bjerkås, Mohn, Presthus, 1984); successivamente, nel 1988, questa ed altre segnalazioni vennero identificate come causate da un unico agente eziologico, denominato appunto come Neospora caninum (Thilsted et al., 1989; Dubey et al., 1988). Da alcuni studi epidemiologici si ritiene che N. caninum, in alcune zone come ad esempio la California, l Australia, la Nuova Zelanda, l Olanda, il Regno Unito, rappresenta dal 20% al 43% di tutte le cause di aborto (Pfeiffer et al., 1997; Dubey et al., 1999); l infezione potrebbe coinvolgere oltre il 20% degli allevamenti. È stata descritta come importante causa di aborto perfino nelle regioni della Scandinavia (Petersen et al.,1999) (Fig. 1). I danni economici sono legati sostanzialmente all aborto che avviene generalmente tra il IV ed il VII mese di gestazione con la conseguente perdita del vitello e mancata produzione lattea, nonché i conseguenti costi veterinari; - 9 -

è stata osservata anche una diminuzione del 5% della produzione di latte durante la prima lattazione nelle bovine infette che non hanno abortito (French et al., 1999). Fig. 1. Distribuzione geografica dei diversi casi di Neosporosi riscontrati sino ad oggi. (Marquer et al., 1999) Inoltre si hanno sicuramente costi legati alla diagnosi, al ripristino della riproduttività degli animali, che comprende inseminazione artificiale, l acquisto di animali per la rimonta, se necessario, e, infine, il costo per l eventuale eliminazione di bovini sieropositivi e per l acquisto di animali sieronegativi (Dubey et al., 2003). - 10 -

Per quanto concerne una classifica dei costi, la Neosporosi, si pone immediatamente dopo l infezione da virus della diarrea virale bovina (BVDV), ma prima della paratubercolosi e della leucosi bovina enzootica (Chi et al., 2002). Sporadicamente, nei vitelli possono manifestarsi, alla nascita, turbe di tipo neurologico con incoordinazione dei movimenti e paralisi degli arti. Oltre che nel bovino, l esistenza di infezioni da N. caninum è stata individuata in numerose altre specie animali, quali cane, pecora, capra, cavallo, cervo, nonché in camelidi e mammiferi marini (Dubey et al., 2007). Per quanto riguarda la situazione nel Nord Italia, N. caninum appare ampiamente diffusa nell allevamento della vacca da latte con danni ingenti soprattutto negli allevamenti dove l evento aborto assume un andamento epidemico (gli autori anglosassoni utilizzano il termine abortion storm per indicare appunto l improvvisa insorgenza e l intensità del fenomeno) (Dubey et al., 1999; Yaeger et al., 2004;). La via principale di trasmissione dell infezione è quella verticale, tra madre e feto, ma può verificarsi anche per via orizzontale attraverso l ingestione da parte del bovino di oocisti emesse con le feci da cani infetti. - 11 -

È ancora in corso di accertamento l eventuale trasmissione per via sessuale o attraverso il latte (Anderson, Reynolds et al., 1997). Il lavoro che ho effettuato ha avuto l obiettivo di valutare la sieroprevalenza di N. caninum nel sangue precolostrale di vitelli nati nell arco di 15 mesi (03/04-06/05) in un allevamento nel veronese, nel quale è stata più volte riscontrata la presenza di N. caninum come causa dominante di aborto. L obiettivo è stato quindi di confermare ulteriormente come N. caninum venga trasmessa direttamente dalla madre infetta al prodotto del concepimento durante la vita intrauterina (trasmissione verticale), e come questo importante evento possa venir evidenziato attraverso la rilevazione di anticorpi contro N. caninum effettuata sul sangue del vitello, ancora prima che questo abbia assunto colostro dalla madre (prelievo precolostrale). L eventuale riscontro di sieropositivà nel vitello in esame, deriva quindi da un attivazione dell immunità attiva umorale dello stesso vitello, dovuta al passaggio transplacentare dei tachizoiti, e non dall immunità passiva colostrale eventualmente appresa dalla madre sieropositiva. - 12 -

La tesi è stata suddivisa in due parti: Nella prima, di carattere generale, dopo una descrizione delle caratteristiche di N. caninum e del suo ciclo vitale, prendo in considerazione l epidemiologia, la patogenesi e la sintomatologia della Neosporosi nella vacca da latte, nonché le tecniche diagnostiche più utilizzate e quelle ancora in via di sperimentazione ed infine i sistemi di terapia e profilassi che possono venir adottati all interno di un allevamento; nella seconda parte, di carattere sperimentale, descrivo i risultati sierologici ottenuti con la ricerca di anticorpi contro N. caninum attraverso metodica IFAT ed ELISA su un campione di 106 vacche da latte e sui propri vitelli nati nell arco dei 15 mesi, mettendo in evidenza la trasmissione verticale (trasmissione transplacentare) di N. caninum tra le madri ed i rispettivi vitelli. - 13 -

PARTE GENERALE - 14 -

- Capitolo 1 - CARATTERISTICHE GENERALI DI NEOSPORA CANINUM La Neosporosi bovina è una patologia a carattere abortigeno sostenuta da Neospora caninum; è emersa in tutto il mondo come un importante causa di patologia riproduttiva che colpisce sia bovine da latte che da carne (Dubey et al., 1996; Anderson et al., 2000). Neospora caninum è un parassita intracellulare obbligato a prevalente localizzazione intracitoplasmatica, correlato morfologicamente e antigenicamente con Toxoplasma gondii. - 15 -

TASSONOMIA Regno: Protista Phylum: Apicomplexa Classe: Sporozoa Sottoclasse: Coccidia Ordine: Eucoccidiorida Sottordine: Eimeriorina Famiglia: Sarcocystiidae Genere: Neospora Specie: Caninum - 16 -

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La prima descrizione di Neospora caninum risale al 1984, in Norvegia, dove Bjerkås et al. (1991) isolarono un parassita strutturalmente assimilabile a Toxoplasma gondii, dal cervello (Fig. 2) e dal tessuto muscolare di cani affetti da una forma clinica di encefalopatia, senza però che gli animali avessero logicamente anticorpi contro T. gondii. Nel 1988, in USA, si isolò un parassita di caratteristiche simili in 10 cani che soffrivano di alterazioni neurologiche, dimostrando, con l'utilizzo di tecniche sierologiche e immunoistochimiche, che si trattava di un parassita differente a Toxoplasma gondii, e per questo venne dato il nome di Neospora caninum (Dubey et al., 1988). Fig. 2. Encefalite di tipo non purulento da Neospora caninum nel cane. (freccia: cisti contenente bradizoiti). Attraverso studi biologici e molecolari è stata confermata l esistenza di un ulteriore specie di Neospora, isolata esclusivamente negli equini, agente eziologico di turbe a carattere neurologico (mieloencefalite equina; EPM). Marsh et al. (1999) proposero il nome di Neospora Hughesi, parassita molto simile strutturalmente a N. caninum, oltre che a Sarcocystis neurona, altri agenti eziologici di EPM: la loro differenziazione da un punto di vista - 18 -

sierologico è molto difficile, l unico test con alta specificità e sensibilità risulta essere solo la PCR (Fenger et al., 1997; Schock et al., 2001; Dubey et al., 2003). Solo poi con l identificazione e la sequenziazione amminoacidica di particolari antigeni di superficie comuni del genere Neospora, si è potuto comprendere al meglio le differenze specifiche tra N. caninum e N. hughesi. Esiste infatti, tra N. caninum (Nc) e N. hughesi (Nh), fino ad un 6% di variabilità nella sequenza amminoacidica dell antigene di superficie SAG1, proteina antigenica di 29-36 kda, localizzata solo sulla superficie dei tachizoiti, con funzione di adsorbimento durante la penetrazione nella cellula ospite, e fino ad un 9% di differenza tra le due sequenze amminoacidiche di SRS2, un antigene di 35-43 kda esposta sia sulla superficie di tachizoiti che bradizoiti (Dubey et al., 2002). I polimorfismi di questi geni e della loro struttura proteica offrono un ulteriore sistema di differenziazione per distinguere appunto N. caninum da N. hughesi (Marsh et al., 1999). - 19 -

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E DIFFERENZIALI DI N. CANINUM Recenti studi su N. caninum sono stati effettuati per dimostrare le differenze strutturali e morfologiche con Hammondia heydorni, un altro protozoo intestinale del cane, causa di diarrea in animali immunodepressi; l obiettivo era quello di definire come i due parassiti fossero effettivamente due specie differenti (Nishikawa et al., 2002). Fig. 3. Elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti Nc5-PCR amplificati di: 1) H. heydorni; 2) controllo positivo per N. caninum Nc-1; 3) controllo negativo privo di DNA. Le bande di migrazione misurano approssimativamente 337 bp (freccia). È stato inoltre eseguito uno studio con l utilizzo della PCR, alla quale segue un elettroforesi in gel di agarosio che, in caso di positività, permette di evidenziare in maniera amplificata il frammento genomico specifico di N. Caninum (Nc5) (Müller et al., 2001) (Fig. 3). Questa sequenza nucleotidica, specifica del genoma di N. caninum NC-1, è stata però riscontrata anche in H. Heydorni, quindi i due protozoi risulterebbero indistinguibili (Ellis et al., 1999; Mugridge et al., 1999; Schares et al., 2002). Solo nel 2002, Dubey et al., attraverso una nuova descrizione morfologica, ultrastrutturale e genetica, riconobbero i due protozoi come due generi e specie distinte. - 20 -

Il problema epidemiologico e diagnostico permane ancora per quanto riguarda le oocisti di Neospora caninum ritrovate nelle feci di cane, le quali al microscopio risultano morfologicamente e strutturalmente identiche alle oocisti di Hammondia heydorni rinvenute nelle feci di cane (McAllister et al., 1998; Reichel et al., 2007) (Fig. 4). Fig. 4. Oocisti di Neospora caninum (sinistra) ed Hammondia heydorni (destra). Esistono strutturalmente e chimicamente molte analogie tra T. gondii e N. caninum, sostenute da diverse specifiche ricerche. Xiao-lin, Grigg et al. (2002) rilevarono come la superficie di Toxoplasma gondii fosse rivestita da glicosilfosfatidilinositolo, una peculiare proteina di superficie (SRS), di cui SAG1 ne è il prototipo (dimensioni 1.7 Å). Le proteine SRS hanno la funzione di regolare la virulenza del parassita stesso, in quanto modulano il meccanismo dell'adsorbimento a livello di cellule bersaglio: questo è sicuramente un parametro del successo della capacità infettante di T. gondii. Toxoplasma utilizza un vasto repertorio di proteine di superficie d adesione per penetrare nelle cellule bersaglio, responsabili anche dell attivazione della risposta immunitaria dell ospite. - 21 -

Oggigiorno si pensa che la famiglia proteica SRS funzioni come un set di recettori capace di dar luogo ad una cascata di interazioni che permettono appunto l entrata del parassita nelle cellule bersaglio. Ad esempio, durante la malattia acuta, SAG1 e SAG2 sono immunodominanti all'interno della superfamiglia SRS, e in particolare SAG1 ha un ruolo critico per quanto concerne la risposta immunitaria osservata durante le fasi iniziali di infezione. SAG1 probabilmente ha addirittura un duplice ruolo, ossia di adesina e di target per la risposta immunitaria. Fig. 5. Allineamento delle sequenze della superfamiglia SRS (glicosilfosfatidilinositolo: antigene di 35-43 kda). Differenze nella sequenza tra quello di Neospora caninum (NcSAG1; seconda riga) e gli altri geni che appartengono a Toxoplasma gondii. ROSSO: cisteina, legami disolfuro; GIALLO: parti di sequenze geniche maggiormente simili tra N. caninum e T. gondii. - 22 -

Questo è avvalorato dal fatto che i bradizoiti di T. gondii, nei quali manca naturalmente SAG1, non vengono attaccati dal sistema immunitario dell ospite e riescono così a persistere indisturbati all interno delle cisti tessutali nei quali sono contenuti. Per il rilevamento di queste particolari proteine sono stati messi a punto degli anticorpi marcati (mab) che riconoscono nello specifico un epitopo di 36 kda, chiamato appunto P36 (Tomavo et al., 1991). Da allora mab-p36 è usato come marker per la ricerca di bradizoiti di Toxoplasma gondii e nello specifico per la diagnosi differenziale da Neospora caninum, tra le quali strutturalmente vi sono numerose proteine di superficie simili (Chahan et al., 2003) (Fig. 5). - 23 -

STADI MORFOLOGICI Fig. 6. Struttura generale di tachizoita e ciclo generale del Phylum Apicomplexa. Gli Apicomplexa costituiscono un Phylum di protozoi che include alcune migliaia di specie, caratterizzate dall assenza di organi di movimento (ciglia o flagelli). Il ciclo di riproduzione di questi parassiti è costituito dall alternanza di una fase asessuata (schizogonia) e una fase sessuata (gametogonia) che porta alla formazione di forme infettanti dette sporozoiti (Fig. 6). Sono aploidi durante tutto il ciclo vitale, salvo che nella fase di zigote, che comunque è di brevissima durata. N. caninum si presenta in vari stadi evolutivi: 1. stadio di tachizoita; 2. stadio di bradizoita; 3. stadio di oocista. - 24 -

STADIO DI TACHIZOITA I tachizoiti sono di forma allungata o a semiluna, di dimensioni variabili dai 3 ai 7 µm per 1-5 µm (Dubey e Lindsay, 1988) (Fig. 7 e 10). In questo stadio evolutivo di tipo asessuato il parassita è nettamente infettante, si moltiplica rapidamente e quindi invade molti distretti e tessuti dell organismo dell ospite intermedio. Questo fenomeno prende il nome di endodiogenesi e porta alla formazione di due zoiti; consiste sostanzialmente in un processo di gemmazione interna (budding process) col quale si formano appunto 2 cellule figlie (zoiti) all interno della cellula madre (Dubey e Lindsay, 1996). Fig. 8. Vacuolo parassitofori (freccia) con tachizoiti di N. caninum. Fig. 7. Rappresentazione schematica di tachizoiti di N. caninum all interno di una cellula ospite. I tachizoiti di N. caninum sono stati rinvenuti in molte cellule tra le quali: neuroni, macrofagi, miociti, epatociti, fibroblasti, fibrocellule muscolari, nelle cellule degli endoteli vasali e nell epitelio tubulare renale (Dubey e Lindsay, 1999); inoltre hanno la capacità di attraversare la barriera placentare ed essere così un importante causa di infezione del prodotto del concepimento. - 25 -

Il parassita può essere libero nel citoplasma o all interno di vacuoli parassitofori che possono essere anche più di uno in una cellula (Dubey e Lindsay, 1996) (Fig. 8). Una cellula può contenere anche fino a 100 tachizoiti e la penetrazione del tachizoita nella cellula avviene in tempi molto ristretti (Dubey et al., 1996). La struttura microscopica del tachizoita è caratterizzata da: o nucleo; o nucleolo; o un complesso apicale costituito da: 2 anelli polari; rhoptrie; moltissimi micronemi (circa 150); il conoide; o pochissimi granuli di aminopectina (granuli densi); o 22 microtubuli sottopellicolari; o un mitocondrio; o apicoplasto; o il plasmalemma; o il reticolo endoplasmatico denso; o apparato di Golgi (Dubey et al., 1988; Dubey e Lindsay, 1996). - 26 -

Nel processo di invasione della cellula ospite, svolge un ruolo fondamentale il complesso apicale, un insieme di strutture citoscheletriche e vescicolari presente in tutti gli stadi invasivi degli Apicomplexa. La componente citoscheletrica è costituita dal conoide, che è in grado di estroflettersi durante l invasione, mentre la componente vescicolare è costituita dai micronemi e dalle rhoptrie, organelli che secernono il proprio contenuto apicalmente. Le rhoptrie sono strutture elettrondense quindi particolarmente visibili, anche per le loro dimensioni decisamente superiori a quelle di altre strutture interne del tachizoita (Dubey et al., 2002) (Fig. 9). Fig. 9. Struttura schematica di un tachizoite del phylum Apicomplexa (foto sopra). A sinistra la stessa cellula ripresa al microscopio elettronico a trasmissione (C= conoide; DG= granuli densi; MN= micronemi; N= nucleo; R= rhoptrie; barra=1 µm) Il processo di invasione richiede 15-20 secondi, culminando nella formazione di un vacuolo parassitoforo all interno del quale il parassita si moltiplica. - 27 -

I micronemi contengono un corredo di proteine adesive le quali, esposte sulla superficie del tachizoita (SAG1, MIC1, MIC4), contribuiscono alla formazione della cosiddetta giunzione mobile. Questa struttura, che crea un contatto tra la membrana di N. caninum e quella della cellula ospite, dipende dall interazione specifica tra domini adesivi delle proteine dei micronemi e ligandi espressi sulla membrana della cellula bersaglio. La secrezione del contenuto dei micronemi è un processo stimolato dalla mobilizzazione delle riserve di Ca ++ intracellulare del parassita, con conseguente aumento della concentrazione intracellulare di questo ione. Successivamente ai micronemi, sono le rhoptrie a rilasciare il proprio contenuto di proteine (ROP2), per lo più coinvolte nella modificazione del vacuolo parassitofori. L apicoplasto, infine, è un organello da molti considerato come una traccia di un rapporto simbiotico mutualistico atavico tra i parassiti del Phylum Apicomplexa e un alga. Non si conosce ancora del tutto la sua funzione ma molto probabilmente ha un ruolo fondamentale nel metabolismo del parassita (Ajioka et al., 2001). Fig. 10. Tachizoiti di N. caninum al microscopio elettronico (x7500). - 28 -

STADIO DI BRADIZOITA Fig. 11. Cisti tissutali contenenti bradizoiti. Sono la forma latente del parassita e ne permette la notevole e durevole resistenza nell ospite intermedio. Si localizzano all interno di cisti tissutali, le quali si rinvengono soprattutto a livello di sistema nervoso centrale (cervello, midollo spinale, nervi periferici) e di retina (Dubey et al., 1988) (Fig. 11). Una singola eccezione riguarda una cisti solitaria rinvenuta nel muscolo oculare di un puledro (Lindsay et al., 1998). Più recentemente, cisti contenenti bradizoiti sono state osservate anche a livello di muscolo in alcuni bovini (Peters et al., 2001). Le cisti tissutali di N. caninum possono raggiungere un diametro di 107 µm e possono essere di forma ovale o rotonda (Dubey e Lindsay, 1996) e contenere dai 20 ai 100 bradizoiti (Speer et al., 1999); lo spessore della parete può variare dai 0,5 ai 4 µm: lo spessore varia in base all età della cisti stessa (Speer et al., 1999). - 29 -

Mediante l uso dell esame immunoistochimico e del microscopio è possibile distinguere i bradizoiti di Neospora caninum dai tachizoiti (Peters et al., 2001). Infatti i bradizoiti presentano un numero minore di rhoptrie e un numero maggiore di granuli PAS-positivi rispetto ai tachizoiti (Fig. 12). Fig. 12. Confronto tra tachizoiti di N. caninum (A) e bradizoiti (B) coltivati in vitro (Microscopio elettronico). Notare la parete della cisti di spessore maggiore (B) rispetto alla struttura contente tachizoiti (A). (barre: (A)=1,3 µm; (B)=0,8 µm) I bradizoiti hanno dimensioni variabili: 5,2 (±0,6) x 1,6 (±0,3) µm (Peters et al., 2001). Il nucleo lo si può rinvenire nella zona subterminale. (Peters et al. 2001). Possono essere infestanti per via orale sia per l ospite intermedio (Dubey e Lindsay, 1988) che per quello definitivo (McAllister et al., 1998). Nell ospite intermedio, in particolare se parzialmente immunodepresso, in corso ad esempio di una gravidanza, i bradizoiti si riattivano e si trasformano rapidamente in tachizoiti, forma infettante attiva, capace di invadere agevolmente il feto e causare aborto. - 30 -

Nel cane (ospite definitivo), che si infetta ad esempio ingerendo carne infetta contenente bradizoiti, Neospora giunge a livello intestinale dove ha inizio la fase sessuata del ciclo vitale del parassita, attraverso la quale si ha l origine delle oocisti non sporulate che possono venir disseminate nell ambiente esterno attraverso le feci. I bradizoiti si formano a partire dai tachizoiti stessi i quali, nel momento in cui si attiva la risposta immunitaria dell ospite, reagiscono incistandosi. In questo modo il parassita riesce a sottrarsi dall azione del sistema immunitario e può quindi resistere anche degli anni all interno dell organismo (Dubey et al., 2002). - 31 -

STADIO DI OOCISTA Fig. 13. Oocisti di Neospora caninum: (A) oocisti non sporulata; (B) oocisti sporulata (freccia grande: sporocisti; frecce piccole: sporozoiti. Lo stadio di oocisti, è lo stadio in cui il parassita, potenzialmente infettante, viene eliminato dall ospite definitivo. Il cane, infatti, elimina con le feci le oocisti nella forma non sporulata, altamente resistenti nell ambiente esterno (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). Solo all esterno dell ospite definitivo e dalle 24 alle 72 ore dalla loro espulsione, le oocisti di Neospora sporulano, diventando appunto oocisti sporulate, forma infestante, che possono così venir ingerite dall ospite definitivo od intermedio (Lindsay, 1998) (Fig. 13). - 32 -

Ogni oocisti contiene due sporocisti, che a loro volta contengono quattro sporozoiti (Dubey, 1999) (Fig. 14). Le oocisti hanno forma ovoidale o sferica, sono costituite da una doppia parete e le dimensioni variano da 11,3 a 11,7 µm (McAllister et al., 1998; Dubey, 2002). Gli sporocisti contenuti all interno dell oocisti sporulata, sono di forma ellissoidale e possiedono un nucleo posizionato centralmente o nella parte posteriore (Lindsay et al., 1999). Fig. 14. Oocisti di Neospora caninum contenente i due sporocisti. - 33 -

- Capitolo 2 - CICLO VITALE DI NEOSPORA CANINUM Il ciclo vitale di N. caninum richiede la presenza di due ospiti: ospite intermedio; ospite definitivo. Il ciclo ha inizio con l ingestione, da parte di un animale (ospite intermedio o definitivo), delle oocisti sporulate (contenenti 8 sporozoiti) emesse nell ambiente esterno dall ospite definitivo (cane, coyote...) (Fig. 15; 1). Nell ospite definitivo, gli sporozoiti, arrivati a livello intestinale ad esempio con l alimento contaminato, escono dalla spora e penetrano ciascuno in una cellula della mucosa intestinale, utilizzando il complesso apicale (1a). Nella cellula si trasformano in trofozoiti che si nutrono della cellula stessa, aumentando di dimensioni (2). A questo punto prende il via la fase di riproduzione asessuata (schizogonia) caratterizzata dalla moltiplicazione del nucleo dei trofozoiti, senza la contemporanea suddivisione citoplasmatica. Da questo processo deriva una forma multinuleata, denominata schizonte (3). - 34 -

Successivamente segue la divisione cellulare con la formazione di numerosi merozoiti, che escono dalla cellula ospite ormai distrutta e penetrano in altre cellule intestinali vicine per ripetere tutto il processo di schizogonia (4). Il numero di fasi di schizogonia non è conosciuto, molto probabilmente è variabile ed in funzione dell attivazione più o meno immediata della risposta immunitaria dell animale stesso. A questo punto i merozoiti prodotti nell ultimo ciclo di schizogonia, penetrano ulteriormente in un enterocita dando inizio alla fase di riproduzione sessuata di N. caninum. Una parte dei merozoiti dà origine a gameti femminili, singoli, mononucleati ed ancora endocellulari (macrogameti) (5); un altra parte dà invece origine ai gameti maschili, mobili ed extracellulari (microgameti) (6), che individuano le cellule contenti il gamete femminile, vi penetrano fondendosi col macrogamete e dando origine all unica fase diploide (zigote) del parassita (7). Lo zigote quindi comincia a ricoprirsi di una parete di protezione ed abbandona la cellula della mucosa intestinale, cadendo nel lume intestinale e raggiungendo l ambiente esterno con le feci (oocisti non sporulata) (8). All esterno avviene la fase di sporulazione dell oocisti (9), la quale, dopo circa 24-72 ore, si trasforma in una oocisti sporulata costituita al suo interno da due sporocisti contenenti ognuno 4 sporozoiti (10). L ospite definitivo, può inoltre infettarsi attraverso l ingestione di tessuti contenenti cisti parassitarie di N. caninum (12). I bradizoiti, presenti nelle cisti, similmente agli sporozoiti, si liberano nel lume intestinale e si trasformano in tachizoiti i quali danno inizio alla fase di replicazione asessuata, per terminare con la formazione dello zigote e quindi dell oocisti non sporulata (13). - 35 -

Quando invece le oocisti sporulate sono ingerite dall ospite intermedio (bovino, cavallo, ovi-caprini...), i trofozoiti, dopo essersi liberati della parete cistica, vengono rilasciati nel lume intestinale e divengono tachizoiti. I tachizoiti si dividono rapidamente e diffondono in tutto l organismo, invadendo le cellule di numerosi organi (fegato, reni, cuore, polmoni, muscoli, derma e SNC) nelle quali avviene la moltiplicazione asessuata (scissione binaria): lo stadio di tachizoite è associato ad infiammazione e necrosi nel sito d invasione. Nelle bovine gravide, i tachizoiti possono nel giro di poco tempo, invadere il feto passando attraverso la placenta, ed essere così causa di aborto. A seguito della risposta immunitaria dell animale, i tachizoiti si rifugiano all interno di una cisti, trasformandosi in bradizoiti (1b). Le cisti tissutali sono circondate da una parete cistica molto spessa e resistente, e sono reperibili principalmente nei tessuti neuronali (cervello, midollo spinale). I tessuti cistici inducono una reazione infiammatoria minima e possono persistere nel bovino per lunghi periodi di tempo senza manifestazioni cliniche. Si presume che, in corso di una gravidanza, i bradizoiti latenti in queste cisti vengano attivati, e si differenzino nello stadio di tachizoite, infettivo e mobile, che raggiunge, attraverso i tessuti, il sangue e/o sistema linfatico, la placenta e il feto ed essere così causa di aborto (11). Come risultato di questa "riattivazione" dei parassiti, ripetute infezioni fetali possono verificarsi nella stessa madre infetta, nelle gravidanze successive. - 36 -

Fig. 15. Ciclo vitale di Neospora caninum nell ospite definitivo e intermedio. - 37 -

OSPITE INTERMEDIO L ospite intermedio, comprende il bovino, la capra, la pecora, il suino, il cavallo, il cervo, la volpe, i roditori (topi, ratti...) e volatili da cortile (Tabella 1.). In questi animali ha luogo il ciclo asessuato del parassita, che comprende lo stadio di tachizoita e lo stadio di bradizoita (endodiogenesi). Tra gli ospiti intermedi, sono da aggiungere la lontra di mare che vive in Alaska (Enhydra lutris) e il delfino (Tursiops truncatas), nei quali sono stati messi in evidenza anticorpi anti-neospora (Dubey et al., 2007). Inoltre il DNA del protozoo è stato isolato nel lama (Lama glama) e nell alpaca (Vicugna pacos) da un equipe ispano-cilena. La sieroprevalenza in questi due camelidi è importante, varia dal 30 al 40% (Pèreira-Bueno et al., 2000; Serrano-Martìnez et al., 2004). In un recente studio epidemiologico, anche l esposizione a volpi rosse (Vulpes vulpes) e volpi grigie (Urocyon cinereoargenteus) è stata identificata come un fattore di rischio per l infezione da N. caninum per i bovini al pascolo (Barling et al., 2000), ma non è ancora chiaro come, essendo canidi, riescano ad eliminare nell ambiente esterno le oocisti: per questo motivo sono da considerare ancora come ospiti intermedi (Schares et al., 2002). In Belgio e Spagna, anticorpi anti-neospora caninum sono stati dimostrati in più del 17% delle volpi rosse (Vulpes vulpes) testate (Buxton et al., 1997; Almeria et al., 2002), mentre nessuna sieropositività è stata rilevata in Svezia nelle volpi saggiate (Jakubek, 2001). Questi animali sono da considerare anch essi ospiti intermedi. - 38 -

Negli ultimi anni è stata riscontrata una significativa sieroprevalenza da N. caninum anche nel lupo grigio (Canis lupus), nell orso bruno (Ursus arctos) e nel tasso (Meles meles) oltre che in diversi ruminanti selvatici come il cervo a coda bianca (Odocoileus virginianus), il cervo rosso (Cervus elaphus), il capriolo (Capreolus capreolus) e l alce (Alces alces) (Gondim et al., 2004). Tabella 1. Ospiti intermedi di Neospora caninum e loro distribuzione geografica; positività all infezione dimostrata attraverso immunoistochimica (IHC) o PCR. (Dubey et al., 2007) - 39 -

Una importante sorgente di infezione, soprattutto negli allevamenti, potrebbe essere rappresentata dalla potenziale implicazione, nel ciclo domestico, dei roditori (topo, ratto...), attraverso una trasmissione diretta, mediante cioè l ingestione di carne con cisti contenenti bradizoiti. Tuttavia, al momento, l infezione naturale del topo è stata dimostrata solo da un equipe a Taiwan (Huang et al., 2004). Questa rivelazione può essere una solida evidenza di come il ciclo di Neospora caninum possa collegarsi al di fuori dei carnivori e dei ruminanti. Anche se i ratti probabilmente non sono ospite definitivi, essi in ogni modo hanno la potenzialità di trasmettere N. caninum al bestiame!! Basti solo pensare quando vengono effettuati i carichi per costituire l unifeed attraverso i carri trinciamiscelatori. Non è di raro riscontro la presenza tra il fieno, la paglia, i mangimi, gli insilati, della libera circolazione di topi e ratti, i quali possono involontariamente essere caricati assieme agli alimenti, venir frantumati con l unifeed e distribuiti tranquillamente al bestiame in stalla. I roditori, poi, vengono anche cacciati dai canidi (volpi, lupi, cani domestici...) aumentando così indirettamente il rischio di infezione del bestiame (McAllister et al., 2000). Ci sarebbe inoltre necessità di eseguire una più approfondita indagine per valutare l eventuale implicazione nell elenco di ospiti intermedi, degli uccelli (piccioni, galline, anatre...). Due indagini epidemiologiche hanno comunque riscontrato che la presenza di pollame negli allevamenti di vacche da latte, è associata con un incremento del rischio di Neosporosi tra gli animali. - 40 -

Sembrerebbe comunque improbabile che il pollame possa trasmettere Neospora caninum direttamente al bestiame; ma se le galline e altri volatili da cortile sono ospiti intermedi, allora potrebbero trasmettere l organismo agli eventuali cani presenti in allevamento (Otranto et al., 2003). Non è ancora del tutto esclusa la possibilità di trasmissione di N. caninum all uomo. In uno studio condotto in Svezia da Petersen, Lebech, Jensen et al. (1999) su 76 donne (dai 19 ai 41 anni di età) che accusavano ripetuti aborti o morte intrauterina del feto, vennero eseguiti degli esami sierologici per valutare la sieroprevalenza di N. caninum. I test utilizzati (ELISA, IFAT) erano comunque basati su metodi usati per la ricerca anticorpale di T. gondii (agente abortigeno nell uomo): i risultati però esclusero la presenza di Ac-anti N. caninum in queste donne testate. L equipe giunse alla conclusione che molto probabilmente l infezione da N. caninum nell uomo è potenzialmente possibile, soprattutto in quei pazienti più sensibili perché ad esempio immunodepressi. Quello che si deve continuare a fare, è ricercare sicuramente un più valido ed attendibile test per la diagnosi indiretta di N. caninum nell uomo. Tra questi certamente si annovera la PCR e l immunoistochimica, effettuate su biopsie od eventualmente su tessuti prelevati in corso di autopsie di feti abortiti. - 41 -

OSPITE DEFINITIVO Nell ospite definitivo si ha il completamento del ciclo vitale di Neospora caninum, attraverso le fasi della riproduzione sessuata, che porta alla produzione di oocisti non sporulate, che solo nell ambiente esterno, in adatte condizioni di temperatura ed umidità, sporulano e divengono così infettanti. Ancora prima della completa conoscenza del ciclo vitale di Neospora, ci si è resi conto che la presenza di cani in allevamento aumentava il rischio di aborto nelle bovine (Parè et al., 1998; Wouda et al., 1999). Il cane (Canis familiaris), il dingos (Canis dingos) ed il coyote (Canis latrans) eliminano le oocisti nelle feci dopo essersi alimentati con tessuti di bovini o topi infetti da N. caninum; essi sono da considerare quindi come ospiti definitivi di N. caninum (McAllister et al., 1998; Basso et al., 2001; Gondim, Gao, McAllister, 2002). Sino ad ora sono stati riportati tre casi di cani che eliminano naturalmente oocisti di N. caninum. Uno di questi studi però riporta che cani alimentati con feti bovini infetti da N. caninum non hanno eliminato oocisti (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). - 42 -

CICLO DOMESTICO E CICLO SELVATICO Fig. 16. Ciclo selvatico e ciclo domestico di Neospora caninum. - 43 -

La presenza del coyote e del dingos come animali selvatici eliminatori di oocisti di Neospora caninum (ospite definitivo) e dei grandi erbivori selvatici come ospiti intermedi, lascia intravedere un ciclo selvatico autonomo e molto probabilmente interconnesso al ciclo domestico mantenuto dal cane: a sostegno di ciò vi è una dimostrazione di come i giovani coyote (Canis latrans) e i dingos australiani (Canis dingos), possono eliminare oocisti nell ambiente esterno, in seguito a ingestione sperimentale di tessuti contaminati da Neospora caninum (Barling et al., 2000; Ferroglio, Rossi, 2001). In questo ciclo, come in quello domestico, l ospite definitivo elimina le oocisti non sporulate all esterno attraverso le feci, contaminando così l ambiente in cui pascolano i ruminanti selvatici, come cervi, gazzelle, alci... Si è riscontrata, dai prelievi eseguiti, un indice di sieropositività più alto nei cervi a coda bianca, rispetto alle alci. Ciò potrebbe essere il risultato della diversa tipologia di alimentazione. Le alci, infatti, si cibano principalmente di foglie e ramoscelli, mentre i cervi pascolano, mangiando più vicino al suolo dove vi è un maggiore rischio di contaminazione fecale da parte di coyote o cani randagi eventualmente presenti (Gondim et al., 2004). Questi stessi ospiti definitivi selvatici possono essere fonte di infezione anche per gli eventuali bovini domestici presenti al pascolo. D altra parte sarà poi possibile che gli eventuali feti abortiti in corso di Neosporosi al pascolo possono venir ingeriti dai carnivori selvatici, i quali si infettano a loro volta (Fig. 16). La trasmissione fra animali selvatici e domestici è stata rilevata anche attraverso studi sperimentali. - 44 -

Nello specifico si è notato come il coyote sia in grado di eliminare oocisti non sporulata nell ambiente esterno, dopo essere stato alimentato con tessuti infetti di vitello (Gondim et al., 2004), e come lo stesso evento accada in cani alimentati con tessuti infettati da N. caninum di capriolo (Gondim et al., 2002). Questo studio è quindi a sostegno di un effettivo collegamento tra ciclo selvatico e ciclo domestico. - 45 -

- Capitolo 3 - EPIDEMIOLOGIA PIDEMIOLOGIA: trasmissione di Neospora caninum nella vacca da latte I bovini possono acquisire l infezione da N. caninum mediante trasmissione orizzontale (post-natale) o verticale (pre-natale). TRASMISSIONE ORIZZONTALE La trasmissione orizzontale avviene per ingestione di alimenti o acqua contaminati con oocisti eliminate dalle feci dell'ospite definitivo. Diversi studi epidemiologici hanno dimostrato che l infezione post-natale, per via orizzontale, è molto probabilmente responsabile per le c.d. tempeste d aborto (abortion storm). Per esempio, Dijkstra et al. (2002) hanno riportato la sieroconversione per N. caninum di bovine da latte di razza Holstein in un periodo di 6 mesi. - 46 -

In questa mandria, la presenza di anticorpi a bassa avidità (indice di una recente infezione) e la mancanza di correlazione tra lo status sierologico delle figlie e quello delle madri erano compatibili con un infezione primaria per via orizzontale. E interessante rilevare che, l elevata percentuale di sieroconversione non era associata ad un aumento di aborti, indicando che una sieroconversione di massa in mandrie di vacche da latte può passare inosservata (Dijkstra et al., 2002). In mandrie con infezione endemica che sono state testate in modo più esteso, vi è evidenza sierologica che possa verificarsi un livello basso di infezione post-natale da fonti ignote. Questo dato è in accordo con i risultati originati da studi di modelli matematici che suggeriscono che l infezione da N. caninum scomparirebbe col tempo dalle mandrie bovine se la trasmissione orizzontale fosse l'unica via di diffusione dell infezione (Parè et al., 1996; Davison, Otter, Trees, 1999; Hietala, Thurmond, 1999; Bergeron et al., 2001;Schares et al., 2003). - 47 -

TRASMISSIONE VERTICALE La trasmissione verticale comporta la trasmissione transplacentare di tachizoiti dalla madre infetta al feto durante la gravidanza. Si riconoscono 2 tipi di trasmissione verticale nel bovino: 1. trasmissione transplacentare esogena, caratterizzata dall ingestione da parte della vacca in gestazione, di oocisti non sporulate presenti nell ambiente, attraverso l alimento o l acqua da bere; 2. trasmissione transplacentare endogena, caratteristica delle vacche con infezione cronica latente (cisti tessutali) e costituita da una riattivazione e trasformazione dei bradizoiti di N. caninum in tachizoiti, i quali possono attraversare la barriera placentare ed essere causa di aborto; la quota di infezione transplacentare endogena decresce con le gravidanze successive, indicando l attivazione di un immunità protettiva (Anderson et al., 1995; Dijkstra et al., 2003; Romero e Frankena, 2003). Le infezioni latenti, presenti nella vacca in gestazione, possono essere state acquisite attraverso una trasmissione verticale (dalla propria madre) (Anderson et al., 1997) o essere di origine post-natale (orizzontale), per l eventuale presenza in allevamento di cani eliminatori di oocisti (Moen et al., 1998). Il meccanismo col quale queste infezioni latente si riattivano è davvero ancora poco conosciuto. L eventualità che un immunosoppressione, dovuta ad esempio ad infezioni concomitanti o per la presenza di micotossine nell alimento, possa essere la causa di questa recrudescenza dell infezione per la riattivazione dei tachizoiti, è tuttora in discussione e non supportata da dati certi (Wouda et al., 1998; Bartels et al., 1999; Pfeiffer et al., 2002). - 48 -

È di poco tempo fa la rilevazione, ad esempio, di come, con un inoculazione di progesterone durante la gravidanza, si abbia un aumento del rischio di aborto nelle vacche infettate (sieropositive) da N. caninum (Bech-Sabat et al., 2007). La trasmissione verticale sembra essere la via di trasmissione predominante d infezione in Europa e negli Stati Uniti, con una percentuale di efficienza tra l 65 ed il 95%, mentre percentuali più basse (23,5-60%) sono state rilevate in Nuova Zelanda (Parè, Thurmond, Hietala, 1996; Wouda, Moen, Schukken, 1998; Davison, Otter, Trees, 1999; Sanderson et al., 2000). In allevamenti con infezione endemica, la maggioranza dei vitelli nati da vacche sieropositive sono sieropositivi. Inoltre, la percentuale di sieropositività nella mandria non è correlata all'età delle bovine, il che suggerisce che la percentuale d infezione post-natale sia bassa. Per di più, i vitelli congenitamente infetti hanno un'infezione persistente cronica che può essere trasmessa per via transplacentare alla loro discendenza. - 49 -

ALTRE FONTI DI TRASMISSIONE Uggla et al. (1998) hanno riportato che vitelli inoculati per via orale con tachizoiti aggiunti al colostro, sono diventati sieropositivi a circa 5 settimane post-infezione. Tuttavia, non sono state osservate lesioni da N. caninum, ne positività immunoistochimica; il parassita non è stato, inoltre, isolato in seguito all inoculo di tachizoiti in animali da laboratorio. Il DNA di N. caninum è stato però ritrovato nel cervello, attraverso PCR. I dati, confermati anche da Davison et al. (2001), suggeriscono che il colostro potrebbe essere un fonte di infezione post-natale. Moskwa et al. (2003) recentemente hanno descritto il ritrovamento di DNA di N. caninum nel latte prodotto da bovine infette. Se questo evento venisse confermato come fonte di tachizoiti vivi e vitali, sarebbe da considerare un ulteriore pericolosa sorgente di infezione di tipo orizzontale, tra madre e vitello, oltre che per l uomo. Dubey et al (2007) hanno riportato comunque che non esistono segnalazioni in natura dell infezione di N. caninum con colostro, latte, etc. Altri ricercatori hanno ipotizzato, infine, come l ingestione di placenta o liquido amniotico espulso dalle bovine infette fosse un ulteriore fonte di trasmissione orizzontale tra bovini (Ho et al., 1996; Bergeron et al., 2001; Dijkstra, 2001). Questo non è stato finora verificato da Davison et al. (2001). - 50 -

È stata inoltre ipotizzata l eventualità della trasmissione di Neospora caninum per via genitale. Un equipe madrilena (Serrano et al., 2006) ha contaminato, in via sperimentale alcune giovenche, inseminandole con sperma addizionato con 1x10 7 tachizoiti. Le manze hanno subito una sieroconversione e la presenza del parassita è stata dimostrata (il DNA di Neospora caninum è stato riscontrato nel loro sangue). Tuttavia, quando il DNA di N. caninum è stato quantificato nello sperma di tori naturalmente infettati, questi stessi ricercatori hanno ritrovato solo l equivalente di 5-10 parassiti per millimetro di sperma (Caetano da Silva et al., 2004; Ferre et al., 2005; Ortega-Mora et al., 2003). Inoltre, non si conosce ancora del tutto il destino del parassita in caso di congelamento dello sperma, anche se è molto probabile che perda completamente la virulenza (Canada et al., 2006). - 51 -

- Capitolo 4 - PATOGENESI E SINTOMATOLOGIA Nelle vacche che abortiscono in conseguenza dell infezione da N. caninum, non si rilevano segni clinici di malattia. I feti abortiti sono in preda ad autolisi, senza lesioni macroscopiche e di solito non si ha ritenzione placentare (Fig. 17). Fig. 17. Feto mummificato (sinistra) e feto abortito (destra) nati da vacche sieropositive per N. caninum. - 52 -

L aborto può derivare da tre processi patogenetici potenzialmente concomitanti (Dubey et al., 2006): 1. una perturbazione dell equilibrio delle citochine placentari, che determina lo sviluppo di un processo infiammatorio locale; 2. una somma di microscariche di prostaglandine conseguenti al passaggio placentare di Neospora caninum, che determinano una lisi del corpo luteo; 3. un infestazione incontrollata del giovane feto, quindi fatale per il prodotto del concepimento. Fig. 18. Distribuzione temporale delle principali cause di aborto in base allo stadio di gestazione. - 53 -

Gli aborti avvengono a partire dai 3 mesi di gestazione fino alla fine della gravidanza, ma la maggioranza degli aborti da N. caninum avviene nel secondo trimestre di gravidanza. Questo modello che prevede l aborto a metà gestazione è fattore di diagnosi differenziale nei confronti di altre cause diagnosticate di aborto infettivo nelle bovine da latte, che tendono a verificarsi più tardi nel corso della gestazione (Fig. 18). Non è noto se l infezione da N. caninum possa provocare problemi riproduttivi nel primo trimestre di gestazione; comunque sono stati riscontrati casi di mummificazione fetale associati a focolai di Neosporosi (Fig. 17). Gli aborti da N. caninum avvengono durante tutto l'anno e sono stati riportati sia in bovine da latte che da carne. Gli aborti da Neospora caninum si osservano quindi più frequentemente tra il V ei VII mese di gravidanza (Anderson et al., 1991; Thurmond, 1995; Sager, Fischer, Furrer, 2001; Wouda et al., 1997). L influenza della fase di gestazione potrebbe essere legata a una maggiore recettività fetale; si tratta di un ipotesi avvalorata anche da studi istologici e sierologici. In effetti, prima del VI mese di gravidanza, il feto bovino può essere considerato totalmente non immunocompetente. Inoltre, esami istologici hanno evidenziato lesioni più gravi nei feti giovani, rispetto a feti di età maggiore (Ogino et al., 1992). L infezione del feto nel primo trimestre di gravidanza sfocia sistematicamente in aborto, mentre nel corso del secondo trimestre l infezione non causa necessariamente un processo abortivo, poiché il feto è in grado di contrastare l infezione parassitaria. - 54 -

Trees et al. (2002) hanno infatti dimostrato sperimentalmente come l importanza del periodo di gestazione durante il quale avviene la l infezione da N. caninum sia fondamentale. Nello studio, l inoculazione, ad esempio, di una dose di 7x10 5 tachizoiti di Neospora caninum a 70 giorni di gestazione, causa aborto nella totalità delle vacche; se l inoculazione, invece, avviene dopo il 160 giorno di gestazione, le vacche danno alla luce vitelli clinicamente sani, ma sieropositivi. Le manze con infezione congenita possono a loro volta trasmettere l'infezione alla futura progenie. Ricordiamo, infatti, che questo meccanismo di trasmissione verticale è il fattore principale di mantenimento dell infezione da N. caninum nella mandria. Le bovine sieropositive, inoltre, hanno un rischio di aborto aumentato. In uno studio condotto in California, vacche sieropositive con infezione congenita avevano un rischio di aborto aumentato di 7,4 volte nel corso della loro prima gravidanza. Il rischio alla seconda gravidanza era notevolmente più basso, anche se questo dato potrebbe essere stato influenzato, in qualche modo, dall eliminazione selettiva di vacche che hanno abortito alla prima gravidanza (Thurmond e Hietala, 1997). Nei Paesi Bassi, un aumento di 3 volte del rischio di aborto, comparato a quello di fattrici sieronegative, era associato alla presenza di vacche sieropositive (Wouda et al., 1998). Un aumentato rischio di aborto e di nascita di feti morti o disvitali, un elevato tasso di riforma per inefficienza riproduttiva, un ridotto accrescimento postsvezzamento e un ridotto tasso di trasformazione dell alimento è stato riscontrato anche in bovine da carne (Barling et al., 2001). - 55 -

Oltre all aborto ed all infezione congenita, l infezione da N. caninum può provocare una riduzione della produzione di latte ed un accorciamento della vita produttiva, come evidenziato da uno studio nel corso del quale vacche sieropositive hanno prodotto meno latte e sono state eliminate più precocemente delle fattrici sieronegative (Thurmond e Hietala, 1996 e 1997). ABORTO NELLA BOVINA: modelli epidemiologici Sono stati descritti due modelli di aborto da N. caninum nella vacca da latte: l aborto endemico e l aborto epidemico. ABORTO ENDEMICO Nel modello caratterizzato dall aborto endemico, la mandria è colpita da una percentuale di aborto superiore al 5% annuo, percentuale che persiste per anni. Nel corso di indagini effettuate in due allevamenti da latte in California che presentavano aborti endemici da N. caninum, la percentuale di aborto annuale attribuibile alla Neosporosi in questi allevamenti è stata valutata pari al 10,6% e al 17,3% (Thurmond et al., 1995). ABORTO EPIDEMICO Il modello di aborto epidemico è meno comune ed è caratterizzato da aborti in un gran numero di bovine gravide distribuiti su un periodo di tempo relativamente breve. - 56 -

In alcuni casi, più del 30% delle bovine gravide ha abortito per Neosporosi nel giro di alcuni mesi (Thornton et al., 1994). Un insieme di questi modelli può essere osservato in alcune mandrie che hanno sperimentato una storia prolungata di casi sporadici di aborto da N. caninum e focolai occasionali di aborti attribuibili a N. caninum. Infezioni primarie sono molto probabilmente la causa di focolai di aborto indotto da N. caninum nei bovini (Fig. 19), mentre un aumento della percentuale di aborto annuale può essere una conseguenza della trasmissione verticale. In molti casi, le bovine che abortiscono un feto infetto da N. caninum andranno incontro sia ad aborti che a infezioni fetali ulteriori alle gravidanze successive (Barr et al., 1993; Anderson et al., 1995; Dubey et al., 1996). Le conseguenze cliniche in queste gravidanze successive sono variabili, ma una bovina sieropositiva che presenta un aborto, avrà un rischio di aborto aumentato di 5,7 volte alla gravidanza successiva (Thurmond e Hietala, 1997). Fig. 19. Feto abortito. Non sono visibili particolari lesioni. - 57 -

SINTOMATOLOGIA NEL VITELLO Una manifestazione non comune d infezione fetale da N. caninum è la nascita di un vitello a termine clinicamente colpito da infezione, che mostra diversi segni neurologici, che si manifestano come disfunzioni limbiche, che variano da lievi deficit propriocettivi sino alla completa paralisi. Microscopicamente si rileva un encefalomielite multifocale protozoaria, che può essere localizzata in particolare nella materia grigia del midollo spinale (Barr et al., 1993; Dubey et al., 1996) (Fig. 20). La maggioranza dei vitelli che contraggono un'infezione da N. caninum durante la gestazione nasce clinicamente normale. Questi vitelli avranno un titolo anticorpale precolostrale alto per N. caninum, utile per rivelare un infezione uterina. Fig. 20. Feto bovino abortito: miocardio con accumulo di tachizoiti di N. caninum tra le fibrocellule muscolari (sinistra); area di necrosi nel SNC (destra). - 58 -

- Capitolo 5 - TECNICHE DIAGNOSTICHE DIAGNOSI DIRETTA Considerando la sieroprevalenza della Neosporosi in allevamento e l elevato tasso di trasmissione verticale, è importante poter dimostrare l esistenza di lesioni parassitarie (con o senza oggettivazione del parassita) o far ricorso a tecniche in grado di mettere in evidenza le lesioni caratteristiche per confermare che l evento abortivo sia dovuto a N. caninum. I prelievi fetali principali vanno effettuati nel tessuto nervoso centrale e a livello di cuore, fegato e placenta. Le condizioni di consegna al laboratorio variano in base alla tipologia di metodica diagnostica. - 59 -

Una diagnosi accurata dell'aborto da N. caninum si può ottenere se il diagnostico prende in esame, prima di stabilire quale infezione sia la causa di aborto: 1. il periodo di gestazione e le condizioni post-mortem del feto (autolisi); 2. la presenza di lesioni infiammatorie disseminate e compatibili; 3. la presenza di parassiti rilevabili con immunoistochimica o del DNA del parassita con la PCR; 4. l assenza di altri agenti abortivi. La diagnosi diretta di infezione da N. caninum si effettua attraverso metodiche diverse che comprendono l esame istologico ed immunoistochimico, la cultura cellulare e l inoculo in animali da laboratorio e l applicazione di metodiche molecolari, quale la PCR. - 60 -

ESAME ISTOLOGICO L esame istologico è ancora considerato come la tecnica di riferimento (Kramer et al., 2007). Consiste nell osservazione di lesioni di tipo infiammatorio, necrotico non suppurativo. Inoltre, è importante determinare se le lesioni possono essere responsabili della morte del feto e se, per l aborto, va ricercata un altra causa. Alcuni studi riferiscono che le lesioni sono più gravi e più numerose nei feti provenienti da focolai epidemici rispetto a feti provenienti da focolai endemici e nei feti a meno di 6 mesi di gestazione (Collantes-Fernandez et al., 2006). L osservazione di parassiti all interno delle lesioni non è sistematica, tanto più se nel feto sono iniziati fenomeni autolitici e la distribuzione per microrganismo non è omogenea all interno dell organo (Collantes-Fernandez et al., 2006). In tal caso, può essere utile effettuare due serie di sezioni istologiche a diversi livelli del tessuto esaminato. Le lesioni più caratteristiche si trovano a livello di tronco encefalico e peduncoli cerebellari, e consistono in aree di encefalite multifocale di tipo non purulento. Queste aree infiammatori sono caratterizzate da una zona centrale di necrosi che in alcune occasioni si presentano con fenomeni di calcificazione (González et al., 1999). Le altre lesioni istologiche che si rinvengono costantemente includono epicarditi e/o miocarditi non suppurative, miositi focali non suppurative ed epatiti portali non suppurative, frequentemente con necrosi epatica focale e polmonite interstiziale focale non suppurativa. - 61 -

Le lesioni al cuore, fegato e tessuto muscolare scheletrico, normalmente sono di difficili rilevazione per la precoce comparsa di fenomeni autolitici (Anderson et al., 1994; Barr et al., 1991). Le lesioni istopatologiche offrono una diagnosi presuntiva della malattia. L'assenza di lesioni nel cervello non esclude la diagnosi di Neospora; bisogna tenere in considerazione che tale negatività può essere dovuta per l'esame di zone prive di lesioni specifiche o che tali lesioni si trovino in altri organi, ad esempio la placenta. Per confermare la diagnosi istologica si impiegano tecniche di immunoistochimica, che ci permettono di evidenziare la presenza di tachizoiti tra le aree di proliferazione microgliare o nell'infiltrato infiammatorio che circonda la zona necrotica. Grande specificità ma bassa sensibilità, dovuta alla scarsa presenza del parassita nelle lesioni, è la rilevazione e la relativa osservazione delle cisti tessutali contenenti bradizoiti di Neospora caninum (Gonzales et al., 1999). - 62 -

IMMUNOISTOCHIMICA L immunoistochimica, basata sul riconoscimento del parassita grazie ad anticorpi specifici, consente una maggiore sicurezza in termini di identificazione, ma necessita anche dell analisi di diversi campioni e della disponibilità di un laboratorio specializzato. La specificità della tecnica dipende dall anticorpo utilizzato. I sieri iperimmuni, policlonali, possono presentare delle reazioni di cross-reattività con Toxoplasma gondii (Dubey et al., 2007). Con l impiego degli anticorpi monoclonali di topo (mab 6G7) che reagiscono selettivamente contro i tachizoiti di N. caninum (NC-1) alla prova IFAT, Cole et al. (1993) constatarono che questi stessi anticorpi non reagivano con tachizoiti e bradizoiti di T. gondii, H. hammondi, sporozoiti di Isospora suis e merozoiti di Eimeria bovis, schizonti e merozoiti di Sarcocystis cruzi, S. canis, S. neurona, oocisti di Cryptosporidium parvum, amastigoti di Leishmania spp, e molti altri parassiti. Questa osservazione fu un ulteriore conferma dell alta specificità del test immunoistochimico nei confronti di tessuti con lesioni compatibili a Neospora caninum. Infatti, secondo van Maanen et al (2004), ad esempio, l immunoistochimica ha bassa sensibilità (40%), ma altissima specificità (93%) nel confermare la diagnosi di aborto da N. caninum. - 63 -

CULTURA CELLULARE E INOCULO IN ANIMALI DI LABORATORIO Fig. 21. Coltivazione in vitro di oocisti di Neospora caninum (Prof. Dr. Andrew Hemphill, Universität Bern, 2003) Sono state descritte numerose linee cellulari, anche di origine murina (es. linea primaria di astrociti murini) (Figg. 21-22). Queste tecniche attualmente sono riservate ai laboratori di ricerca, in ragione della lunghezza intrinseca della tempistica per la risposta e delle difficoltà di realizzazione, soprattutto con feti in autolisi. Inoltre, considerando il passaggio verticale quasi sistematico nella specie bovina, l isolamento di un ceppo non consente sempre di attribuire l aborto a Neospora caninum. Sarebbe necessario quindi abbinare questa metodica diagnostica all esame istologico. L isolamento di N. caninum in coltura cellulare resta comunque un metodo di diagnosi diretta molto indaginoso e che non trova applicazione routinaria in laboratorio poiché spesso il parassita perde la propria vitalità in seguito all autolisi degli organi fetali. Fig. 22. Tachizoiti di Neospora caninum coltivati in cellule Vero. - 64 -

Ne è prova l esiguo numero di ceppi del protozoo che sono stati finora isolati nel mondo in laboratori specializzati degli Stati Uniti, Svezia, Gran Bretagna, Giappone ed Italia. Hemphill A. e Vonlaufen N. dell Istituto di Parassitologia dell Università di Berna (2005), in molti loro esperimenti, utilizzarono comunque la metodica della cultura su monostrato cellulare di N. caninum, con lo scopo di studiare ed approfondire, ad esempio, la capacità di conversione morfologica da tachizoita a bradizoita, sotto particolari condizioni di stress, condizioni che si possono poi riscontrare nell ospite dove Neospora può albergare. Sotto queste particolari condizioni di stress, si è potuto notare che il parassita ferma di proliferare ed esprime antigeni bradizoiti-specifici che conducono al suo incapsulamento in una cisti tissutale. Gli esperimenti effettuati applicavano alla cultura cellulare varie condizioni di stress: 1. modifiche della temperatura di incubazione; 2. variazione della concentrazione in CO 2 ; 3. variazioni di ph; 4. esposizione ad immunomodulatori come IFN-γ e TNF-α; 5. reazione con anticorpi anti-neospora caninum; 6. trattamento con ossido nitrico (nitroprussito di sodio (SNP). Ad esempio, in un esperimento, una cultura cellulare di cheratinociti epidermici di topo venne infettata con tachizoiti di Neospora caninum, e la cultura infetta fu trattata con una dose elevata (70 µm) di nitroprussito di sodio per 8 giorni. Come stimato da PCR in tempo reale, la proliferazione del parassita nella cultura cellulare sotto particolari condizioni di stress era notevolmente ridotta. - 65 -

Una up-regulation dell'espressione di antigeni bradizoiti-specifici era evidenziabile attraverso un immunofluorescenza diretta (Fig. 23) utilizzando nello specifico anticorpi marcati, diretti contro l'antigene bradizoita-specifico NcBAG1, ed in parallelo, si otteneva una down-regulation dell'espressione di antigeni tachizoiti-specifici come NcSAG1 o NcSRS2. Dopo 8 giorni con trattamento della cultura cellulare con SNP, l'antigene di superficie della cisti di Neospora caninum NcCC2 fu celato dal parassita stesso (Nishikawa et al., 2001; Min Liao et al., 2005). Fig. 23. Conversione in vitro di Neospora caninum analizzate attraverso la doppiaimmunofluorescenza diretta. Notare nella figura C la progressiva down-regulation dell espressione degli Ag NcSAG1 espressi dallo stadio di tachizoita e la progressiva up-regulation degli Ag NcBAG1 espressi dai bradizoiti, dovuta alla reazione di Neospora caninum a particolari condizioni di stress.. Al microscopio elettronico a trasmissione si ottenne la rivelazione che Neospora caninum si era localizzata all interno di compartimenti intracellulari chiamati vacuoli parassitofori, e che la maggioranza dei parassiti presenti all'interno dei vacuoli parassitofori erano in grado di costituire una parete cistica, tipica dello stadio del bradizoita. - 66 -

BIOLOGIA MOLECOLARE Le tecniche di amplificazione genica (PCR) del DNA di Neospora caninum sono sempre più utilizzate. Sono stati descritti e utilizzati numerosi geni bersaglio. Attualmente, si è concordi nell amplificazione del gene pnc-5 presente in tutti gli stipiti, ma la cui funzione non è ancora stata completamente chiarita (Gottstein et al., 1998). Questa metodica può essere impiegata per mettere in evidenza tutte le forme del parassita attualmente descritte: negli organi, nelle feci dell ospite definitivo e nello sperma. Nonostante queste tecniche siano molto sensibili, si raccomanda di estrarre il DNA a partire da un omogenato di tessuto, piuttosto che da un campione di piccole dimensioni, in ragione dell eterogenicità della distribuzione del parassita. Considerando il passaggio verticale di N. caninum, un risultato positivo non consente da solo di concludere sulla reale responsabilità del parassita nell aborto. Tuttavia, uno studio condotto in Svizzera, ha evidenziato una correlazione pari a circa l 85% tra i risultati positivi ottenuti in PCR e le lesioni compatibili con un aborto attribuibile a Neospora caninum. Questa tecnica sembra dunque ben adattarsi a una diagnosi di Neosporosi in prima intenzione (Sager, Fischer, Furrer et al., 2001). La scelta della PCR come metodica routinaria per la diagnosi diretta di infezione è soprattutto per la sua praticità, in quanto l esame può essere eseguito anche su campioni di tessuti fetali congelati o fissati in formalina e consente di disporre di un esito in tempi brevi (l esecuzione completa della prova richiede 2 giorni). - 67 -

I materiali che è opportuno esaminare di preferenza, quelli dove esami immunoistochimici hanno rivelato che più spesso è rinvenibile Neospora caninum, sono il cervello, il cuore, il rene e il fegato. Timothy, Baszler et al. (1999) ottimizzarono la tecnica di PCR per la ricerca e amplificazione del gene pnc-5, utilizzando due coppie di primers: Np4-Np7 e Np6-Np7. Studi preliminari utilizzando sangue e tessuto nervoso bovino mostrarono che la coppia di primers Np4-Np7, quando usata in una procedura standard o quando usata prima della coppia di primers Np6-Np7, fornisce ottimi risultati sui tessuti bovini testati. La coppia di primers Np4-Np7 amplifica un frammento di DNA di 275 bp, mentre la coppia Np6-Np7 amplifica un frammento di 227 bp. La PCR effettuata sfruttando prima la coppia di primers Np4-Np7 seguita dalla coppia Np6-Np7 aumenta notevolmente la sensibilità del test. Per escludere eventuali, ma rari, falsi-negativi, dovuti soprattutto alla scarsa qualità del DNA da testare (tessuti con spiccati fenomeni di autolisi), si può ricorrere alla PCR multipla, che utilizza, oltre alle coppie di primers di N. caninum, una coppia di primers relativa al gene della prolattina bovina (PRL) espresso appunto dalle cellule di origine bovina. La coppia di primers PRL HL033-HL035 amplifica un frammento di 156 bp di DNA (Fig. 26). La sensibilità della PCR è del: 1. 77% per tessuto nervoso fresco (Fig. 24). 2. 100% se effettuata su tessuti fissati in formalina e per quelli allestiti con paraffina (Fig. 25); - 68 -

La specificità, invece, è del: 1. 94% per tessuti fissati in formalina o allestiti con paraffina; 2. 100% per cervello fresco. Un ulteriore metodica PCR allestita è diretta all'amplificazione di una parte del gene che codifica la subunità 18S del ribosoma di N. caninum, un gene del quale è nota la bassa variabilità intraspecifica, con l'intento di poter rilevare qualsiasi ceppo riferibile alla specie N. caninum. Il prodotto della reazione PCR, nel caso di presenza di coccidi nel campione esaminato, è un frammento di DNA che viene rilevato agevolmente mediante una elettroforesi su gel di agarosio. Successivamente all amplificazione, la digestione enzimatica del prodotto della reazione ad opera dell'endonucleasi permette di identificare i protozoi del genere Neospora differenziandoli nel contempo da altri protozoi di interesse veterinario (T. gondii e Sarcocystis spp.) che possono essere rilevati nei feti bovini. - 69 -

Fig. 24. PCR effettuata su DNA di tachizoiti di Neospora caninum isolato da cervello di bovino infetto. Il DNA è stato analizzato con l impiego della coppia di primers Np4-Np7 per l amplificazione del gene pnc-5. È stata quindi effettuata un elettroforesi su gel di agarosio. CAMPIONE 1: massa molecolare conosciuta (100kb); CAMPIONI 2-9: cervello di bovino infettato sperimentalmente con 5000, 500, 50, 40, 30, 20, 10, 0 tachizoiti di N. caninum rispettivamente; CAMPIONE 10: controllo positivo (DNA estratto da tachizoiti di N. caninum coltivati in cultura di cellule Vero; CAMPIONE 11: controllo negativo (acqua distillata); freccia a sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4- Np7 di 275 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 2 al 7 e campione 10. - 70 -

Fig. 25. PCR effettuata su tessuti infetti da Neospora caninum appartenenti a feti abortiti, fissati in formalina e allestiti con paraffina. L amplificazione del gene pnc-5 è stata ottenuta utilizzando la coppia di primers Np4-Np7. CAMPIONE 1: massa molecolare conosciuta (100kb); CAMPIONE 2: controllo positivo (DNA di Neospora caninum); CAMPIONE 3: rene (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 4: cervello (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 5: fegato (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 6: controllo negativo (paraffina); CAMPIONE 7: rene (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 8: polmone (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 9: fegato (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 10: cuore (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 11: cervello (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 12: controllo negativo (paraffina); CAMPIONE 13: tessuto cerebrale (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto abortito per infezione della madre da IBR; CAMPIONE 14: cervello (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 15: cuore (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto; CAMPIONE 16: controllo negativo (acqua distillata). Freccia sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4-Np7 di 275 kb. - 71 -

Fig. 26. PCR multipla effettuata su DNA di tachizoiti di Neospora caninum e PRL di tessuti fetali fissati in formalina ed allestiti con paraffina derivati da feti abortiti. Il DNA è stato analizzato con l impiego della coppia di primers Np4-Np7 per l amplificazione del gene pnc-5 e l impiego della coppia di primers HL033-HL035 per l amplificazione del gene che codifica la PRL bovina. È stata quindi effettuata un elettroforesi su gel di agarosio. CAMPIONE 1: massa molecolare conosciuta (100kb); CAMPIONI 2-4: rispettivamente fegato, cuore e cervello di feti negativi per N. caninum, analizzati solo con primers per PRL; CAMPIONI 5 e 6: rispettivamente cervello e rene di feti negativi per N. caninum e PRL; CAMPIONI 7 e 8: rispettivamente cervello e polmone di feti negativi per N. caninum e PRL; CAMPIONE 9: cervello di feto positivo per Neospora caninum analizzato con primers per DNA Neospora e PRL; CAMPIONI 10-14: controllo negativo per PRL bovina (cultura di cellule Vero infettate da Neospora caninum); CAMPIONI 15 e 16: controllo negativo (acqua distillata); freccia a sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4- Np7 di 275 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 9 al 14 e prodotto della PCR da parte della coppia di primers HL033-HL035 di 156 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 2 al 4 e campione 9. - 72 -

DIAGNOSI INDIRETTA RISPOSTA ANTICORPALE NEL BOVINO Tutti i bovini infettati da Neospora caninum producono specifici anticorpi che, durante la vita dell animale subiscono continue fluttuazioni nel titolo, sia per quanto riguarda animali infettati sperimentalmente che naturalmente. In particolare durante la gravidanza, l interazione tra il sistema immunitario dell ospite e il parassita causa il rapido picco e il progressivo calo del livello anticorpale. Questo evento fa si che la concentrazione sierica anticorpale arrivi ad un livello inferiore al cut-off dei più comuni test sierologici utilizzati (Stenlund et al., 1999; Guy et al., 2001; Sager et al., 2001; Maley et al., 2001; Trees et al., 2002). I vitelli alimentati con colostro proveniente da madri sieropositive ricevono anticorpi colostrali di Neospora caninum. Hietala e Thurmond (1999) mostrarono che, dopo un mese, tale trasmissione passiva di anticorpi può essere ancora rilevata nel 50% dei sieri di vitelli non infettati. Comunque nella maggior parte dei vitelli, anticorpi colostrali non vengono più riscontrati dopo due mesi. - 73 -

TEST SIEROLOGICI Per la diagnosi indiretta della Neosporosi, il sangue o altri liquidi corporei (liquor, versamenti cavitari, latte) degli animali infetti vengono esaminati per ricercarvi anticorpi specifici verso N. caninum. La prima metodica messa a punto è stata l immunofluorescenza indiretta (IFAT), una tecnica caratterizzata da buona sensibilità e specificità e che non rileva anticorpi diretti verso altri protozoi che possono infettare il bovino (Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii); a questa hanno fatto seguito diverse metodiche immunoenzimatiche (ELISA) che si differenziano tra loro per la tecnica di preparazione dell antigene. Tra metodiche ELISA e IFAT si osserva una buona concordanza in termini sia di sensibilità sia di specificità, anche se la prova IFAT appare più affidabile; in ogni caso la praticità delle metodiche ELISA potrebbe farle preferire sempre più in futuro per l applicazione routinaria. Per un significativo risparmio di tempo e di costi di esecuzione e ai fini dell identificazione delle aziende infette, è stato inoltre proposto l utilizzo di una metodica ELISA anche per l esame del latte di massa: in questo caso, la prova riesce a rilevare gli anticorpi nei confronti di N. caninum se alla costituzione del campione esaminato ha concorso il latte di bovine sieropositive in una proporzione di almeno il 10-15% del totale dei soggetti munti (Varcasia et al., 2006). La sierologia comprende un insieme di tecniche diagnostiche i cui principali vantaggi sono: la possibilità di realizzazione ante-mortem e il costo limitato. - 74 -

Nel caso di patologie come la Neosporosi, in cui l agente patogeno permane nell ospite (cisti cerebrali), gli anticorpi persistono. Il titolo anticorpale può tuttavia variare, in particolare in funzione della fase di gravidanza, scendendo anche al di sotto della soglia di rilevamento dei metodi correttamente utilizzati. Inoltre, attualmente, non esiste un test sierologico che consenta di distinguere tra animali con infezione naturale e bovini vaccinati (Reichel et al., 2006). La sierologia può essere utilizzata sulle madri e sui fluidi fetali (Fig. 27), con diverse interpretazioni. Si è ormai concordi sull utilità della sierologia materna come strumento nella diagnosi di aborto. Un risultato sierologici negativo esclude quasi con certezza l ipotesi eziologica di Neospora caninum come causa di aborto. Al contrario, tenendo in considerazione la prevalenza dell infezione in allevamento e la trasmissione verticale del patogeno, un risultato positivo viene interpretato solamente come un sospetto e non consente in alcun caso di stabilire una diagnosi di certezza. In tal caso può essere utile effettuare analisi sierologiche e analisi statistiche negli animali a rischio (vacche in gravidanza), per stimare se gli aborti sono significativamente associati ad animali sieropositivi. L analisi sierologica dei fluidi fetali dà luogo a un interpretazione opposta. Un risultato positivo va considerato come un forte sospetto, mentre un risultato sierologici fetale negativo non consente di escludere un aborto da Neospora caninum. Fig. 27. Feto abortito: prelievo di fluidi fetali dalla cavità cardiaca (prelievo endocardiaco). - 75 -

In effetti, il sistema immunitario del feto bovino è immaturo, soprattutto nei primi 2/3 della gravidanza, e il lasso di tempo tra un infezione fetale e la morte del prodotto del concepimento è breve (Wouda, Dubey, Jenkins, 1997). La sierologia può essere anche utilizzata all atto dell acquisto di un animale o nel quadro di uno screening d allevamento. È necessario in questi casi ricercare la presenza di linee familiari di bovini infetti. Il veterinario di campo non deve esitare nel testare nuovamente un animale caratterizzato da risultati non coerenti rispetto alla genealogia o ai risultati complessivi del gruppo di animali. La valutazione sierologica dell allevamento consente di: 1. stimare l importanza della contaminazione di gruppo; 2. definire la modalità principale di contaminazione (verticale od orizzontale); 3. fornire un aiuto nella scelta delle tecniche da mettere in atto per combattere l infezione (eliminazione selettiva, scelta delle femmine riceventi o da incrociare per far nascere vitelli da carne, ecc.). I test utilizzano tachizoiti di N. caninum o specifici antigeni derivati. I laboratori che utilizzano uno qualsiasi dei test sierologici per N. caninum, dovrebbero stabilire appropriati valori di cut off, utilizzando sieri da bovini infetti e non infetti. Un solo campione di siero, proveniente da una singola bovina, può non riflettere in modo accurato il suo stato d infezione, dato che i titoli degli animali positivi possono fluttuare e possono scendere sotto il valore soglia per un certo periodo di tempo (Björkman, Uggla, 1999). - 76 -

L impiego della sierologia per Neospora caninum è anche un efficace metodo per rilevare elevati livelli di anticorpi nel siero di vitelli con infezione congenita, o in feti infetti abortiti a 6 o più mesi di gestazione (Barr et al., 1995; Wouda et al., 1997). I principali test utilizzati sono: IFAT: indirect-fluorescent antibody test; ELISA: enzyme-linked immunoassay; Avidity test; Immunocromatografia (ICT). - 77 -

1. IFAT L IFAT si basa essenzialmente sull utilizzo di tachizoiti interi di N. caninum fissati su appositi vetrini. Il siero in esame, correttamente diluito, viene applicato sul vetrino ed, in seguito, viene aggiunto un anticorpo anti-igg di bovino coniugato ad un fluorocromo. La positività sierologica è rilevata al microscopio a fluorescenza (Dubey et al., 1996). Fig. 28. IFAT. In verde sono visibili i tachizoiti di Neospora caninum evidenziati attraverso anticorpi marcati con fluorescina. Le principali sostanze utilizzate come fluorocromo, sono la fluorescina, che emette luce verde in caso di positività del test (Fig. 28), e la rodamina che invece emette luce rossa. Uno svantaggio della metodica IFAT è il fatto che il risultato che si ottiene è di tipo soggettivo, in quanto valutato dall occhio più o meno esperto di un tecnico di laboratorio, a differenza del test ELISA, per il quale la risposta si ottiene attraverso una diagnosi strumentale (spettrofotometro) di tipo oggettivo, standardizzabile e quindi costante nel tempo. L approccio che si deve assume in un laboratorio è quindi di far leggere quando possibile allo stesso tecnico addetto i vetrini di IFAT, in modo da ottenere un risultato più coerente possibile. L impiego di IFAT nella sierologia per Neospora caninum è un metodo efficace ed accurato nel rilevare elevati livelli di anticorpi nel siero di vitelli con infezione congenita (esame precolostrale), o in feti infetti abortiti nella seconda metà di gravidanza. - 78 -

Ciò nonostante, un titolo IFAT negativo per N. caninum nei fluidi fetale non esclude la possibilità d infezione, ed un titolo positivo non dimostra che questa infezione fosse l effettiva causa di aborto. Il test IFAT (specificità: 97%; sensibilità: 97%; Wapenaar et al., 2007), si è comunque dimostrato un esame affidabile ed accurato e sicuramente, rispetto al test ELISA, ha una maggiore specificità: IFAT infatti viene molto spesso utilizzato come test di riferimento per la valutazione dell affidabilità di altri test sierologici (golden test). 2. ELISA Il test ELISA può essere utilizzato nella valutazione dello status sierologico della mandria, oltre che nelle indagini di routine nei casi individuali di aborto. A differenza di IFAT, gli antigeni utilizzati in ELISA possono essere diversi: tachizoiti interi; antigene crudo di tachizoiti sonificati; antigeni di superficie, ad esempio una proteina immunodominante di 65 kda (p65) esposta sulla superficie dei tachizoiti di Neospora caninum. L esame viene preparato ponendo l antigene di Neospora caninum sul fondo di particolari pozzetti; viene aggiunto il siero in esame e quindi, in un secondo tempo, gli anticorpi anti-igg di bovino (isotipo IgG 1 ), coniugati con un enzima perossidasi. Successivamente viene aggiunto il substrato per l enzima (perossido di idrogeno) coniugato al cromogeno (tetrametilbenzidine) e si lascia incubare per circa 20 minuti. - 79 -

Si aggiunge quindi la soluzione che blocca la reazione enzimatica (acido fosforico) e si passa immediatamente alla lettura con spettrofotometro dei vari pozzetti occupati dai sieri in esame (specificità: 99%; sensibilità: 96%; VMRD Inc.). Negli ultimi tempi sono state messe a punto nuove metodiche ELISA, come ELISA-competitiva (CI-ELISA) e l ISCOM-ELISA, nel tentativo di aumentare la specificità e la sensibilità. Il primo test utilizza, insieme al siero da analizzare, un anticorpo monoclonale (isotipo IgM), specifico contro la proteina 4A4-2 (65 kda) presente sulla superficie dei tachizoiti di Neospora caninum (questi anticorpi sono specifici in quanto non reagiscono con T. gondii e S. spp.). Il legame specifico tra mab 4A4-2 e gli antigeni presenti sulla superficie dei tachizoiti di Neospora caninum, viene inibito dai sieri dei bovini infetti da N. caninum (siero positivi) e non inibito dai sieri degli animali non infetti (siero negativi). Dunque, il valore di densità ottica in caso di positività sierologica sarà inferiore al valore ottenuto con sieri da animali non infetti. Il vantaggio principale della tecnica è l utilizzo del solo anticorpo secondario anti-topo contro l mab. Dunque, è un test che può essere utilizzato per diverse specie animali (Baszler et al., 2004). L ISCOM-ELISA, invece, utilizza come antigene i tachizoiti di N. caninum sonificati e successivamente incorporati in complessi immunostimolante (ISCOM). Gli Iscom permettono che gli antigeni esposti sul fondo del pozzetto siano per la maggior parte proteine di superficie di N. caninum (Björkman, 1997; Frössling, 2003). - 80 -

In generale, il test ELISA per la ricerca degli anticorpi contro N. caninum offre un semplice, rapido e versatile, ma accurato, metodo per l identificazione dello status di infezione in un allevamento bovino. Oltre che sul siero, il test ELISA può essere utilizzato anche per la ricerca indiretta di Neospora caninum nel latte di eventuali bovine infette (Björkman, Holmdahl, Uggla, 1997; Schares et al., 2004). È particolarmente indicato l utilizzo dell ISCOM-ELISA. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che le vacche con elevati livelli sierici di anticorpi, hanno poi anche una significativa positività al test ELISA effettuato sul latte. Inoltre, lo stesso test può essere effettuato sul latte di massa con buoni risultati (Niskanen et al., 1993; Björkman et al., 1997; Sargeant et al., 1997; Kramps et al., 1999; Nylin, Stroger, Ronsholt, 2000; Beaudeau et al., 2001; Chanlun et al., 2002). In quanto economico e di rapida esecuzione questo test ELISA sul latte di massa può certamente essere considerato un valido esame per controlli programmati negli allevamenti, al fine di valutare la sieroprevalenza e l eventuale circolazione di N. caninum (Frössling et al. 2002; Schares et al., 2003). Tuttavia, nel pool di latte prelevato ed esaminato non sono compresi animali non in lattazione (animali giovani, tori, vacche in asciutta) e vacche per le quali il latte viene escluso, in quanto affette da mastiti o perché sotto terapia farmacologica. Per ovviare a questo problema ciò che si può fare è effettuare ripetuti prelievi nel tempo. Infine, la sensibilità del test ELISA sul latte di massa è ovviamente influenzata dal tasso di infezione dell allevamento. Varcasia et al. (2006) hanno riportato che i casi di siero-prevalenza inferiore a 10-15%, il rischio di falsi negativi non è trascurabile. - 81 -

3. AVIDITY TEST L accertamento dell indice di avidità degli anticorpi contro N. caninum, ha reso possibile differenziare gli eventi abortivi in seguito alle infezioni recenti (bassa avidità) da quelle in seguito alla riattivazione di un infezione cronica (avidità alta). Gli anticorpi prodotti all inizio dell infezione da Neospora caninum, infatti, hanno una bassa affinità (potere legante) rispetto agli anticorpi prodotti più tardi; si possono così differenziare gli animali infettatisi di recente, da bovini che si sono contaminati da tempo. Attraverso opportuni test sierologici (ELISA) si può misurare questa differenza di affinità degli Ac-anti Neospora caninum, definita appunto come avidità (avidity test) (Björkman et al., 1999; Schares et al., 2002; Sager et al., 2001). Björkman et al. (2003), hanno seguito un allevamento di vacche da latte per 3 anni dall insorgenza dell aborto endemico (introduzione di N. caninum per via orizzontale). Gli autori hanno riportato come l avidità delle IgG negli animali sieropositivi aumenti da un valore di 30, all inizio del periodo di osservazione, fino a valori di 74 anche dopo 3 anni. In particolare si è scoperto che il valore dell avidità delle IgG può subire queste variazioni nell arco di tempo: 1. 21-40: periodo immediatamente successivo all introduzione di N. caninum in allevamento (minore avidità); 2. 41-60: dopo 1 anno; 3. 61-80: dopo 2-3 anni (maggiore avidità). - 82 -

Concludendo, l analisi dell avidità di queste specifiche IgG rispecchia la durata dell infezione di N. caninum nei bovini. In particolare, l avidità aumenta durante il corso dell infezione e rimane consistentemente alta negli animali con infezione cronica (Björkman et al., 1999; Björkman et al., 2006). 4. IMMUNOCROMATOGRAFIA Per la rapida ricerca di anticorpi nei bovini infetti da Neospora caninum può essere impiegato il test di immunocromatografia (ICT) che utilizza un antigene ricombinante di superficie di Neospora caninum (NcSAG1). L ICT è utilizzata soprattutto per discriminare i bovini sieropositivi dai bovini sieronegativi al test IFAT. Rispetto ai normali antigeni di superficie, gli antigeni ricombinanti utilizzati per l ICT hanno diversi vantaggi: sono di facile produzione, se ne producono in grande quantità e possono essere facilmente e rapidamente standardizzati per l utilizzo. L antigene NcSAG1 fatto esprimere da Escherichia coli, è risultato un affidabile antigene per la diagnosi indiretta di Neospora caninum, anche se utilizzato con test ELISA. L ELISA rimane comunque un esame laborioso, che richiede materiali ed attrezzature speciali per la sua realizzazione. Al contrario il test ICT, è un test rapido che lo rende adatto alla diagnosi in campo (Dubey, 2003). Xuan, Zhang et al. (2004) sperimentarono questa tecnica mettendo a contatto le strisce ottenute, con siero di animali siero positivi per l infezione da Neospora e con siero di animali positivi per l infezione da T. gondii ma negativi per Neospora caninum. - 83 -

Le strisce si positivizzarono nel primo caso, mentre negli altri sieri testati non si ottenne nessuna banda colorata sulle strisce (Fig. 29). Questi risultati definirono L ICT come un valido test per la ricerca di anticorpi contro N. caninum, ma anche un valido test per discriminare in modo indiretto l infezione da Neospora da quella da Toxoplasma, infezioni che possono naturalmente colpire cani, bovini, pecore, cavalli (Lindsay, Dubey et al., 1999). Fig. 29. ICT: campioni 1, 4 e 6 sono positivi per la ricerca di anticorpi anti-neospora caninum. - 84 -

- Capitolo 6 - TERAPIA E stata osservata in vitro la sensibilità del parassita a diversi principi attivi, fra i quali i sulfamidici potenziati con gli inibitori della diidrofolato reduttasi e alcuni farmaci anticoccidici (ionofori e non); occorre però ricordare che il ciclo vitale del protozoo in vivo prevede lo sviluppo di stadi parassitari (le cisti tissutali) resistenti, dati i loro caratteri fisici, all azione dei farmaci (Magnino et al., 2001). I presidi farmacologici potrebbero dunque rivelarsi efficaci solo nei confronti delle forme circolanti del parassita (tachizoiti), quando esso è in fase di mobilitazione prima di infettare il feto e prima di raggiungere i tessuti nervosi dove si insedierà in forma di cisti; al riguardo, non si dispone però di rilievi oggettivi in base ai quali sia possibile consigliare tempi e durata di un eventuale trattamento preventivo nei riguardi delle manifestazioni cliniche della Neosporosi. - 85 -

Peraltro, nonostante l efficacia in vitro di alcuni farmaci, occorre anche ricordare che il ciclo vitale di N. caninum non è assimilabile a quello dei coccidi intestinali, che colonizzano le sole cellule dell intestino e in quella sola sede esplicano la loro azione patogena. In questo senso, soltanto studi clinici accerteranno se i farmaci utilizzati per la terapia e profilassi delle coccidiosi intestinali siano efficaci anche per il controllo della Neosporosi. L orientamento generale della comunità scientifica è peraltro di pronunciato scetticismo, se non addirittura di radicale opposizione, nei riguardi di ogni ipotesi di trattamento farmacologico della Neosporosi, anche perché non si ritiene che alcun farmaco possa garantire la completa guarigione degli animali infetti. Anche se vari agenti antimicrobici sono stati testati, in vitro, contro N. caninum, non c'è al momento un approccio terapeutico in grado di guarire una bovina infetta. Nel corso di uno studio effettuato da Kritzner, Sager et al. (2002) attraverso l utilizzo di vitelli infettati sperimentalmente con tachizoiti di N. caninum (metà dose per via intravenosa e metà per via sottocutanea) e trattati con Toltrazuril-sulfone (Ponazuril) per 6 giorni consecutivi, a partire dal primo giorno successivo all infezione, si sono ottenuti i seguenti risultati: A) non è stato rilevato DNA del parassita (PCR) in tessuti potenzialmente infettati da N. caninum, in vitelli sacrificati; B) si è avuto un picco febbrile di minor intensità e durata (T max 39,5), rispetto agli animali non trattati nei quali si sono raggiunti anche i 40 di temperatura rettale; C) è stato rilevato un livello significativamente inferiore di anticorpi verso N. caninum, rispetto ai controlli non trattati. - 86 -

Infine, in un ulteriore esperimento, venne valutata la sensibilità in vitro di N. caninum alla Nitazoxanide benzamide (2-acetolyloxy-N-(5-nitro 2-tiazolo) (Esposito et al., 2004). La Nitazoxanide è stata in origine utilizzata soprattutto come antielmintico ad uso veterinario; oggigiorno se ne conosce invece l ampio spettro d azione contro ad esempio parassiti intestinali, parassiti tessutali ed enterobatteri, che possono infettare sia l uomo che gli animali. L applicazione di questo farmaco include il trattamento in pazienti umani affetti in particolare da Criptosporidiosi (Cryptosporidium spp.), parassita di tipo intestinale, appartenente al Phylum Apicomplexa; per questa caratteristica se ne studiò l effetto in altri generi dello stesso Phylum, come Neospora caninum e Toxoplasma gondii. L esperimento iniziò con l infezione in vitro di un monostrato cellulare di fibroblasti umani, inoculandolo con tachizoiti di N. caninum da una parte, e T. gondii dall altra. Venne in un secondo tempo aggiunta la Nitazoxanide; questo trattamento durò per 8 giorni. L effetto del trattamento farmacologico sulla proliferazione dei tachizoiti fu rilevata con PCR in tempo reale; si ebbe la dimostrazione di una distinta inibizione della proliferazione di N. caninum, ma non dei tachizoiti di T. gondii. Il farmaco induceva nello specifico un alterazione ultrastrutturale di N. caninum, dimostrabile attraverso il microscopio elettronico a trasmissione, come un inibizione dell attitudine da parte di N. caninum di penetrare e colonizzare le cellule del monostrato. Il parassita non era infatti più in grado di costituire una membrana intatta a livello di vacuoli parassitofori. L esperimento permise di definire la Nitazoxanide un farmaco ad effettiva azione parassitocida per Neospora caninum. - 87 -

- Capitolo 7- PROFILASSI IGIENICO-SANITARIA Allo stato attuale, non c'è un metodo efficace di controllo della Neosporosi bovina. Occorre, dunque, in definitiva orientarsi a interventi di profilassi diretta quali: a) impedire ogni possibile contatto tra animali esterni o interni all allevamento e feti abortiti, invogli fetali o vitelli morti; b) smaltimento controllato di feti abortiti e invogli fetali; c) divieto di accesso dei cani stessi e a tutti gli altri animali estranei (volpi, lupi, volatili, roditori...) alle aree adibite al deposito degli alimenti per i bovini, per evitarne la contaminazione; d) interventi che si devono comunque associare a quelli miranti alla ricostituzione di un effettivo aziendale non infetto; - 88 -

Il principale modo di trasmissione di N. caninum nella mandria è attraverso l'infezione di feti in bovine cronicamente infette (trasmissione verticale). Queste vacche cronicamente infette possono essere identificate sulla base dei loro titoli sierologici o per una storia precedente di aborto da N. caninum o d infezione congenita (Moen, Wouda, Mul et al., 1998). Sulla base di queste conoscenze, il controllo dell'infezione potrebbe concentrarsi sulla riduzione del numero di vacche infette nella mandria e sulla limitazione dell introduzione di bovine da rimonta infette nella mandria. La decisione di riformare anticipatamente vacche che hanno avuto una diagnosi certa di aborto da N. caninum può essere presa sulla base del dato che c'è un rischio più elevato di aborto ripetuto in questi animali (Thurmond, 1997). Vacche sieropositive hanno anche un maggior rischio di aborto, e vi è una probabilità molto alta d infezione congenita nei vitelli nati da queste vacche (Parè, Thurmond, Hietala, 1996; Waldner et al., 1998; Wouda, Moen, 1998). Inoltre, è stato dimostrato che manze sieropositive hanno una ridotta produzione lattea. Studi epidemiologici condotti in bovine da latte e da carne hanno dimostrato che le bovine sieropositive hanno una più alta percentuale di riforma anticipata per varie ragioni. Tuttavia, la riforma di vacche o manze sieropositive, può essere una pratica economicamente non attuabile in mandrie con elevata sieroprevalenza. Il trasferimento di embrioni (embryo-transfer) in riceventi sieronegative è stato dimostrato un metodo efficace nel prevenire la trasmissione verticale (Baillargeon et al., 2001; Campero et al., 2003). - 89 -

Non sono noti metodi provati ed efficaci per prevenire l infezione post-natale (trasmissione orizzontale). Comunque, sulla base dell'evidenza che il cane e il coyote possano essere ospiti definitivi e della correlazione positiva tra la presenza di cani negli allevamenti e la sieroprevalenza nella mandria, sarebbe prudente prendere misure atte a ridurre il potenziale rischio di questo tipo di trasmissione. Sarebbe consigliabile soprattutto la rimozione dall ambiente dei tessuti potenzialmente infetti, come feti abortiti e placente, che possono fungere da potenziale fonte di infezione per gli ospiti sensibili. Inoltre, dovrebbe essere minimizzata la contaminazione fecale di alimenti e fonti di abbeverata da parte degli altri animali. L obiettivo deve mirare ad ottenere un azienda Neospora-free. - 90 -

IMMUNIZZANTE Per quanto riguarda la profilassi vaccinale, è stato di recente messo a punto un vaccino inattivato, ma non è stata ancora del tutto valutata la sua efficacia nella riduzione delle infezioni fetali e degli aborti in bovine infette, né nella prevenzione dell infezione postnatale di animali non infetti. Bovilis NeoGuard, un vaccino di Neospora caninum, prodotto da Intervet Inc. (Schering- Plough), si è stato dimostrato in grado di ridurre gli aborti in manze gravide sane, infettate con N. caninum (Barajas et al., 2004). Il vaccino contiene tachizoiti inattivati ed è adiuvato in SPUR (Havlogen). Viene somministrato nel primo trimestre di gravidanza per assicurare la massima protezione durante il secondo trimestre di gestazione, nel quale ci sono appunto i maggiori rischi di aborto per N. caninum. - 91 -

Tuttavia, sono scarsi i dati sulla vera efficacia di questo vaccino. Il futuro sviluppo di una strategia immunizzante protettiva nei confronti di N. caninum dipenderà dall identificazione di uno o più antigeni immunodominanti, da produrre in forma ricombinati e da somministrare eventualmente insieme ad opportuni adiuvanti. Numerosi gruppi di ricerca attualmente stanno identificando diversi antigeni di N. caninum potenzialmente immuno-protettivi (Staska et al., 2000; Pinitkiatisakul et al., 2004; Alaeddine et al., 2005; Wikman et al., 2005;). - 92 -

PARTE SPERIMENTALE - 93 -

SCOPO Presso il Dipartimento di Produzioni Animali, con la collaborazione del Dipartimento di Malattie Infettive dell Università di Medicina Veterinaria di Parma, è stato avviato uno studio sierologico riguardo la potenziale attitudine di N. caninum di attraversare la barriera placentare, invadere il prodotto del concepimento e causare quindi aborto o infezione congenita. Lo studio è stato condotto attraverso la ricerca di anticorpi nel siero di sangue prelevato da vitelli appena nati, ancora prima che questi potessero assumere colostro dalla madre (prelievo precolostrale) ed assorbire quindi eventuali anticorpi materni, divenendo di riflesso opportunamente sieropositivi, nel caso di una madre infettata da N. caninum (passaggio immunità passiva colostrale). L eventuale riscontro di sieropositivà nel vitello in esame, deriva quindi da un attivazione dell immunità attiva umorale dello stesso vitello, il quale durante la vita intrauterina è venuto in diretto contatto con i tachizoiti ed essendo in quel momento già immunocompetente ha avuto una propria attiva produzione di anticorpi. Inoltre, abbiamo messo a confronto due diversi esami sierologici, in particolare un esame IFAT e un esame ELISA, col fine di capire quale dei due test fosse più attendibile nel diagnosticare un effettiva sieropositivà nell animale in esame. - 94 -

MATERIALI E METODI Allevamento Il lavoro che ho effettuato ha avuto l obiettivo di valutare la sieroprevalenza di N. caninum nel sangue precolostrale di vitelli nati nell arco di 15 mesi (03/04-06/05) in un allevamento nel veronese, nel quale è stata più volte riscontrata la sieropositività per N. caninum. L allevamento è situato in pianura e non è circondato da altri allevamenti. È costituito da animali vaccinati regolarmente per IBR e per BVD. Vi è inoltre la presenza di 3 cani, che girano liberamente all interno e all esterno dell allevamento, i quali possono venir così in stretto contatto con le vacche presenti. L allevatore non ha escluso la possibilità che i cani possano aver assunto placente o invogli fetali nella loro vita, per il motivo che molte volte le vacche abortivano di notte e l allevatore ne veniva a conoscenza solo il giorno seguente. Non è stato possibile il prelievo di sangue in questi animali. Animali Sono state analizzate un totale di 106 vacche da latte in riproduzione, di età e razza diverse. Inoltre, sono stati eseguiti i prelievi di sangue pre-colostrale da tutti i vitelli nati nell arco di tempo di osservazione dell allevamento. In totale sono stati controllati 46 vitelli. Infine, è stato eseguito un prelievo dei liquidi accumulati nella cavità toracica ed addominale di tutti i feti abortiti. In totale si sono avuti 8 aborti. - 95 -

Esami sierologici All inizio dello studio, tutti gli animali in riproduzione dell allevamento sono stati analizzati per valutare la sieroprevalenza di Neospora caninum. Dopodiché, ogni qualvolta si aveva la nascita di un vitello nell allevamento, si eseguiva il prima possibile: 1. prelievo di sangue al vitello, prima ancora dell assunzione di colostro dalla madre (prelievo precolostrale); 2. prelievo ematico alla madre stessa, per capire se nel frattempo l animale potesse aver subito una sieroconversione; 5 vacche hanno infatti subito una sieroconversione (trasmissione orizzontale). I prelievi sono stati eseguiti attraverso l utilizzo di provette vacutainer senza anticoagulante per permettere la separazione del coagulo dal siero. Nella vacca il prelievo è stato eseguito dalla vena coccigea, nel vitello invece attraverso la vena giugulare. IFAT Le analisi con test IFAT, sono state eseguite presso l Istituto di Malattie Infettive dell Università di Parma. Per l esame si è proceduto in questo modo. In una piastra a fondo piatto si pongono 290 µl di tampone per fluorescenza (PBS) per pozzetto. In ogni pozzetto si aggiungono 10 µl di siero in esame (diluizione 1:30) e dei controlli positivi a 1:300 e un controllo negativo (siero fetale bovino). Si agita e si trasferiscono con una pipetta 10 µl della soluzione ottenuta in precedenza, in una nuova piastra (piastra figlia). Si aggiungono quindi alla piastra figlia 90 µl di PBS, ottenendo così una diluizione del siero 1:300. - 96 -

Si distribuiscono sui vetrini contenenti l antigene (tachizoiti interi di N. caninum), 15 µl di siero diluito 1:300 per pozzetto. Si pongono quindi i vetrini ad incubare in camera umida 1 ora a 37 C, dopodiché si effettua un lavaggio (30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata) e si asciuga. In ogni pozzetto del vetrino asciutto si pongono 15 µl di globulina anti-igg bovina, coniugata con fluorescina (Sigma ), si mette ad incubare in camera umida 1 ora a 37 C dopodiché si effettua un ulteriore lavaggio (30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata) e si asciuga. Si procede infine alla lettura al microscopio a fluorescenza. I sieri risultati positivi (fluorescenza verde) alla diluizione 1:300, vengono testati alla diluizione 1:600 per accertarne la positività sierologica. Si parte dalla diluizione precedentemente operata (1:300). Si prelevano 150 µl della diluizione 1:300 e si pongono su una piastra a fondo piatto, unitamente a 150 µl di PBS (diluizione 1:600). Si agita, e si trasferiscono 15 µl di sospensione così preparata di siero diluito 1:600 nei pozzetti dei vetrini per fluorescenza. Si mette ad incubare il tutto in camera umida (1 ora a 37 C). Si esegue poi un lavaggio (30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata) e si asciuga. In ogni pozzetto del vetrino asciutto si pongono 15 µl di globulina anti-igg bovina coniugata con fluorescina (Sigma ) e si lascia incubare in camera umida 1 ora a 37 C. Si procede quindi ad un lavaggio (30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata), quindi si asciuga e si procede infine alla lettura dei vetrini al microscopio a fluorescenza. - 97 -

ELISA Tutte le analisi sono state eseguite presso il Laboratorio di Immunologia dell Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, nella sede di Padova. Tutti i campioni di siero prelevati, sono stati analizzati per la ricerca di anticorpi verso N. caninum utilizzando il kit ELISA di tipo non competitivo (ISCOM-ELISA). ELISA non competitiva (Neospora caninum ISCOM-ELISA SVANOVIR) Tale reazione utilizza un antigene ottenuto da proteine di membrana di N. caninum, incorporate in un complesso immunostimolante (ISCOM): si tratta di particelle del diametro di circa 40 nm, contenenti saponina, colesterolo e fosfolipidi, che hanno la proprietà di catturare in modo selettivo le proteine anfipatiche, quali quelle della membrana del parassita, riducendo quindi la presenza delle proteine intracellulari, principali responsabili delle reazioni aspecifiche (Björkman et al., 1997). Il test prevede la diluizione 1:100 dei campioni in esame nell apposito tampone diluente. Gli anticorpi verso N. caninum, se presenti, si legano all antigene fissato sul fondo del pozzetto. L anticorpo monoclonale anti-igg di bovino coniugato con l enzima perossidasi, aggiunto successivamente, si lega al complesso antigeneanticorpo determinando, dopo contatto con il substrato enzimatico, lo sviluppo di una reazione colorimetrica quantificabile mediante lettura della OD allo spettrofotometro ad una lunghezza d onda pari a 650 nm. - 98 -

RISULTATI I risultati della valutazione di sieroprevalenza dell azienda sono riportati nelle Figure 30, 31 e 32, e mostrano una sieropositivà all infezione da N. caninum del 23% (24/106). Tra questi animali, nel periodo in cui ho esaminato l allevamento, nacquero 46 vitelli. Nove delle vacche che hanno partorito in questo periodo era sieropositive per N. caninum al primo prelievo effettuato all inizio dello studio (Fig. 30, 33 e 34). Tutti i 9 vitelli sono risultati positivi al prelievo precolostrale all esame IFAT ed all esame ELISA per N. caninum (Fig. 30 e 34). Fig. 30. Diagramma della sieroprevalenza di Neospora caninum nelle vacche testate, sulla loro discendenza e sui feti abortiti. - 99 -

Figura 31: sieroprevalenza da N. caninum nell'allevamento 100 80 60 40 20 0 SIEROPREVALENZA NELL'ALLEVAMENTO VACCHE POSITIVE VACCHE NEGATIVE 24 82 Figura 32: percentuale di sieroprevalenza da N. caninum in allevamento 23% 77% VACCHE POSITIVE VACCHE NEGATIVE - 100 -

Figura 33: relazione sierologica tra madre e vitello VITELLO NEGATIVO VITELLO POSITIVO 40 35 30 25 numero animali 20 15 10 5 0 MADRE POSITIVA MADRE NEGATIVA VITELLO NEGATIVO 0 31 VITELLO POSITIVO 9 6 Figura 34: vitelli nati da MADRE SIEROPOSITIVA all'esame IFAT Figura 35: vitelli nati da MADRE SIERONEGATIVA all'esame IFAT Numero animali 10 8 6 4 2 0 VITELLO VITELLO NEGATIVO POSITIVO Sieroprevalenza dei vitelli nati da madre sieropositiva Numero animali 40 30 20 10 0 VITELLO VITELLO NEGATIVO POSITIVO sieroprevalenza dei vitelli nati da madre - 101 -

Nelle Figure 34 e 35, vengono riportati i risultati riguardanti la trasmissione verticale dell infezione da N. caninum, e dimostrano che: 1. le madri sieropositive che hanno partorito, hanno dato alla luce tutti vitelli sieropositivi (Figura 34 ); 2. le madri sieronegative hanno partorito, invece, soprattutto animali sieronegativi, ma talvolta anche animali sieropositivi (Figura 35). Infine, è stato eseguito l esame sierologico IFAT sui versamenti toracici ed addominale degli 8 feti abortiti, 5 dei quali nati da madri sieropositive per N. caninum. Le vacche hanno abortito fra i 4 e i 6 mesi di gravidanza. Tutti i campioni testati hanno avuto esito negativo, anche nei casi di madri sieropositive per N. caninum. Per quanto riguarda il confronto tra esame IFAT ed ELISA i risultati che si sono ottenuti sono per lo più concordanti tra loro. La quasi totalità degli animali sieronegativi con IFAT, risultarono sieronegativi anche con test ELISA, mentre alcuni animali sieronegativi con esame IFAT risultavano positivi con ELISA (Fig. 36). Questo risultato è la prova della maggiore sensibilità del test ELISA ma sicuramente della maggior specificità dell esame IFAT. - 102 -

Figura 36: relazione tra risultati ottenuti con esame IFAT ed esame ELISA sul totale delle vacche esaminate numero animali 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ANIMALE POSITIVO IFAT risultati esame IFAT ANIMALE NEGATIVO IFAT ANIMALE NEGATIVO ELISA ANIMALE POSITIVO ELISA - 103 -

DISCUSSIONE DEI RISULTATI In presenza di un eccesso di aborti nell azienda e una volta avanzato più volte il sospetto diagnostico di Neosporosi, sulla base dell anamnesi, dell epidemiologia (presenza di cani in allevamento) e degli aspetti clinici rilevati, sono stati necessari accertamenti specifici di laboratorio sul siero del sangue degli animali presenti in allevamento e sui rispettivi vitelli, ed esami sui feti abortiti. Prima di tutto, lo studio, anche se condotto su un numero esiguo di animali, ha ulteriormente confermato l efficacia della trasmissione verticale di N. caninum, nel nostro caso del 100% (Fig. 30 e 34). Ciò che è inoltre emerso, è la nascita di vitelli sieropositivi all esame precolostrale, nati da madri sieronegative al momento del parto (ma sieropositive al primo prelievo ematico). Questo peculiare evento può essere dovuto ad una caratteristica fluttuazione del titolo anticorpale della vacca nel periodo peri-parto (Pereira-Bueno et al., 2000; Conrad et al., 1993). Questo evento è stato riscontrato anche da numerosi altri ricercatori (Davison et al., 1999; Sager et al., 2001). Questa osservazione può venir rilevata anche durante la gravidanza (Dannatt et al., 1998; Parè et al., 1997), durante un aborto (Guy et al., 2001; Schares et al., 1999; Wouda et al., 1998) o appunto immediatamente dopo il parto (Stenlund et al., 1999). - 104 -

Il livello anticorpale può quindi scendere al di sotto del limite di sensibilità del test sierologico utilizzato (cut-off) e può essere così causa di falsi-negativi (Dannatt et al., 1998; Dijkstra et al., 2003; Wouda et al., 1998). Le bovine sieronegative all esame IFAT ed ELISA e gravide portavano invece a termine regolarmente la gravidanza, con la nascita di vitelli a loro volta sieronegativi. Tra la totalità degli animali testati, erano presenti anche 7 figlie di vacche ancora presenti in allevamento: 3 di queste figlie testate (sangue non precolostrale) sono risultate sieropositive, appoggiando la potenziale implicazione di una trasmissione orizzontale di N. caninum in allevamento, dovuta appunto alla presenza di cani (e/o topi?). Nel complesso, durante il periodo dello studio, si sono avuti 8 aborti. Solo 5 di questi erano di vacche sieropositive per N. caninum all esame sierologico. Le altre 3 bovine sono invece risultate sieronegative. Questo potrebbe far pensare alla presenza di un ulteriore agente eziologico (infettivo od alimentare) in allevamento. Dai feti abortiti, inoltre, è stato fatto un prelievo dei versamenti toracico ed addominale fetale e su questi materiali è stata eseguita una titolazione anticorpale. La sieronegatività è stata rilevata in tutti i campioni in esame. Questo risultato deve comunque essere interpretato con attenzione, poiché il feto è immunocompetente a partire dai 4-5 mesi di vita endouterina: i feti abortiti quindi prima di questa età possono risultare sieronegativi anche se infetti. - 105 -

Ugualmente gli anticorpi non saranno rilevabili nel caso che il decorso dell infezione sia breve e porti rapidamente a morte il feto. Un ulteriore evenienza di falsa sieronegatività dei feti è dovuta alla degradazione degli anticorpi in rapporto all autolisi del feto, suffragata dal fatto che molte volte i feti abortiti durante la notte, venivano prelevati dall allevatore la mattina. Comunque, un titolo IFAT negativo per N. caninum nel feto non esclude la possibilità d infezione, ed un titolo positivo non dimostra che questa infezione sia l effettiva causa dell'aborto. Per quanto riguarda, infine, il raffronto dei risultati ottenuti testando gli animali con esame IFAT ed ELISA, ciò che si è ottenuto è che la quasi totalità degli animali sieronegativi con IFAT, sono risultati sieronegativi anche con test ELISA. Solo 12 animali su 106 sono risultati sieropositivi al test ELISA in disaccordo con il risultato del test IFAT (Fig. 36). Inoltre, ciò che ho riscontrato dal confronto dei risultati ottenuti con i due test, è che 4 vitelli all esame precolostrale sono risultati positivi al test ELISA (ma sieronegativi al test IFAT), sebbene nati da madri sieronegative con entrambi i test. Questo risultato è la prova della maggiore sensibilità del test ELISA ma sicuramente della maggior specificità dell esame IFAT. - 106 -

CONCLUSIONI La Neosporosi Bovina è un importante malattia protozoaria responsabile di aborto nell allevamento bovino. Il peso economico è ingente, sia per quanto concerne le conseguenze sanitarie, sia per quanto riguarda i mezzi di controllo da mettere in atto. Oggigiorno è difficile applicare un protocollo univoco per la gestione sanitaria ed economica della Neosporosi. Una migliore conoscenza delle modalità di infezione e di trasmissione di Neospora caninum, unitamente all implicazione delle conoscenze sui potenziali vaccini ed eventuale chemioprofilassi, potranno consentire di combattere in maniera migliore questa patologia. Per poter far ciò, sicuramente la prima cosa da mettere in atto è quella dell esatta formulazione di una diagnosi di certezza che, spesso, passa attraverso un lavoro unitario tra diversi soggetti dell allevamento. È consigliabile, comunque, utilizzare l esame sierologico per una diagnosi aziendale piuttosto che limitarlo a singoli animali, prelevando quindi anche campioni di sangue da soggetti non coinvolti nell episodio di aborto ma potenzialmente recettivi: il confronto dei risultati degli esami eseguiti, permetterà di giudicare al meglio se N. caninum è veramente coinvolto nell episodio di malattia osservato. Tutto deve essere accompagnato da un bagaglio di conoscenze sulle diverse metodiche diagnostiche utilizzabili, per sapere quali sono i pregi ma anche gli eventuali limiti applicativi. - 107 -

Per il momento, la combinazione dell'esame sierologico e della ricerca diretta del parassita si è dimostrata una strategia utile per identificare gli allevamenti infetti e ha permesso di rivelare l'ampia diffusione di N. caninum nelle aziende bovine italiane; questi strumenti applicati su larga scala potranno permettere di definire ancor meglio la prevalenza della Neosporosi bovina nel patrimonio zootecnico del nostro Paese e offriranno il necessario supporto diagnostico per il controllo dell'infezione una volta che ci si orienti al risanamento delle aziende. - 108 -

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