UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN MEDICINA VETERINARIA DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI, BIOTECNOLOGIE VETERINARIE, QUALITÀ E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI SEZIONE DI BIOCHIMICA VETERINARIA NEOSPORA CANINUM: STUDIO DELLA TRASMISSIONE VERTICALE NELLA VACCA DA LATTE NEOSPORA CANINUM: STUDY OF A VERTICAL TRANSMISSION IN DAM Relatore: Chiar.ma Prof.ssa LAURA HELEN KRAMER Correlatore: Prof.ssa SILVIA CLOTILDE CABASSI Laureanda: ELISA VALERUZ ANNO ACCADEMICO 2006-2007

A Dana Kalikos e Micia. Per il loro amore. - 2 -

Ringraziamenti I miei primissimi ringraziamenti vanno sicuramente alla Prof.ssa Laura Helen Kramer per l infinità disponibilità e l inimitabile professionalità. È solo grazie hai suoi preziosi consigli che questa tesi è diventata realtà. Un grazie anche alla prof.ssa Silvia Clotilde Cabassi, a Francesca Ghedini e Chiara Piancastelli (Istituto di Malattie Infettive) per la disponibilità e per il meticoloso lavoro svolto. Un grazie di cuore ad Antonio Olivieri e alla sua stupenda famiglia, per avermi permesso di approfondire il grande mondo della Neosporosi. Un grazie anche a tutti i loro animali, che hanno dovuto sopportarmi in ogni mio prelievo! Un ringraziamento affettuoso va sicuramente a tutta la mia famiglia. A mamma Margherita, a papà Eugenio e ai miei piccoli grandi fratelli, Giacomo e Gianmatteo. Il loro incoraggiamento ed ammirazione sono stati la forza che mi ha permesso di giungere fino a qui. A mio marito Sandro ed alla nostra splendida bimba Mariavittoria per la pazienza, la fiducia, la grinta e l amore che ogni giorno mi avete donato (ossigeno per il mio cuore e la mia mente!). Sono orgogliosa di voi! A Bruno ed Idelma per la stima e l affetto. Ai miei nonni che da lassù mi vegliano. Un grazie a tutti i medici veterinari (ormai colleghi!) che mi hanno seguita, aiutata e spinta al raggiungimento del mio obiettivo; in particolare il prof. Enrico Parmigiani, il dott. Valentini, il dott. Pretto, il dott. Buniotto, il dott. Brisighella, il dott. Alborali, il dott. Fiocco, il dott. Fanini e il sign. Gabriele Vallani. Grazie infinite per i vostri preziosi insegnamenti. Ed infine, ma non per ultimi, un grazie di cuore a tutti i miei amici di Parma e Verona. Ad Alessia, Alice, Chiara e Sara, per avermi sempre rallegrata nei giorni più tristi, dove tutto sembrava perduto; a Nadia, per le sue preziose traduzioni. Grazie infinite a tutti!! - 3 -

Abstract Neospora caninum is a protozoan parasite that has been identified as a major cause of abortion in dairy and beef cattle. Vertical transmission from mother to fetus is an important mode of maintaining the parasite within a herd. This thesis is aimed at evaluating the frequency of vertical transmission of N. caninum in an Italian dairy herd. Pre-colostral serology in calves showed 100% efficiency in transplacental infection from N. caninum-positive cows. These results confirm those of others and indicate that control and management of N. caninum infection must take into account the high frequency of vertical transmission. - 4 -

INDICE Abbreviazioni................................................ 8 Introduzione................................................. 9 PARTE GENERALE 1 Caratteristiche generali di Neospora Caninum....................15 Tassonomia............................................. 16 Caratteristiche morfologiche e differenziali di N. Caninum........ 20 Stadi morfologici......................................... 24 Stadio di tachizoita................................... 25 Stadio di bradizoita.................................. 29 Stadio di oocista..................................... 32 2 Ciclo vitale di Neospora Caninum.............................. 34 Ospite intermedio......................................... 38 Ospite definitivo.......................................... 42 Ciclo domestico e ciclo selvatico............................. 43 3 Epidemiologia: trasmissione di N. caninum nella vacca da latte...... 46 Trasmissione orizzontale................................... 46 Trasmissione verticale..................................... 48 Altre fonti di trasmissione.................................. 50-5 -

4 Patogenesi e sintomatologia................................... 52 Aborto nella bovina: modelli epidemiologici.................... 56 Aborto endemico.................................... 56 Aborto epidemico.................................... 56 Sintomatologia nel vitello................................... 58 5 Tecniche diagnostiche....................................... 59 DIAGNOSI DIRETTA..................................... 59 Esame istologico..................................... 61 Immunoistochimica.................................. 63 Cultura cellulare e inoculo in animali di laboratorio......... 64 Biologia molecolare.................................. 67 DIAGNOSI INDIRETTA................................... 73 Risposta anticorpale nel bovino......................... 73 Test sierologici...................................... 74 1. IFAT.......................................... 78 2. ELISA......................................... 79 3. Avidity test..................................... 82 4. Immunocromatografia............................ 83 6 Terapia................................................... 85 7 Profilassi.................................................. 88 Igienico-sanitaria......................................... 88 Immunizzante............................................ 91-6 -

PARTE SPERIMENTALE Scopo........................................................ 94 MATERIALI E METODI: Allevamento............................................ 95 Animali................................................ 95 Esami sierologici........................................ 96 IFAT............................................... 96 ELISA.............................................. 98 Risultati................................................ 99 Discussione dei risultati........................................104 Conclusioni................................................ 107 Bibliografia................................................ 109 Siti internet................................................ 123-7 -

ABBREVIAZIONI H. hammondi Hammondia hammondi H. heydorni Hammondia heydorni N. caninum Neospora caninum N. hughesi Neospora hughesi S. neurona Sarcocystis neurona T. gondii Toxoplasma gondii Ac Anticorpo Ac-PC Antibody-Peroxidase Coniugate Ag Antigene BVDV Bovine Viral Diarrhoea Virus CI-ELISA Competitive Inhibition Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA enzyme-linked immunosorbent assay EPM equine protozoal myeloencephalitis ICT Immunochromatographic test IFAT indirect fluorescent antibody test (immunofluorescenza indiretta) Ig immunoglobulina Iscom immunostimulating complex LEB Leukosis Enzootic Bovine LT Linfocita T LTC Linfocita T-citotossico MAb monoclonal antibody Nc Neospora caninum Nh Neospora hughesi pc plasmide combination PCR polymerase chain reaction PBS Phosphate Buffered Solution SAG surface antigen SRS surface-antigen related sequenze - 8 -

INTRODUZIONE Neospora caninum, è un parassita protozooario strettamente correlato con Toxoplasma gondii, responsabile di aborto nella bovina e di patologie nervose nei vitelli. È stato isolato per la prima volta nel 1984 in Norvegia in cani colpiti da encefalite e miosite (Bjerkås, Mohn, Presthus, 1984); successivamente, nel 1988, questa ed altre segnalazioni vennero identificate come causate da un unico agente eziologico, denominato appunto come Neospora caninum (Thilsted et al., 1989; Dubey et al., 1988). Da alcuni studi epidemiologici si ritiene che N. caninum, in alcune zone come ad esempio la California, l Australia, la Nuova Zelanda, l Olanda, il Regno Unito, rappresenta dal 20% al 43% di tutte le cause di aborto (Pfeiffer et al., 1997; Dubey et al., 1999); l infezione potrebbe coinvolgere oltre il 20% degli allevamenti. È stata descritta come importante causa di aborto perfino nelle regioni della Scandinavia (Petersen et al.,1999) (Fig. 1). I danni economici sono legati sostanzialmente all aborto che avviene generalmente tra il IV ed il VII mese di gestazione con la conseguente perdita del vitello e mancata produzione lattea, nonché i conseguenti costi veterinari; - 9 -

è stata osservata anche una diminuzione del 5% della produzione di latte durante la prima lattazione nelle bovine infette che non hanno abortito (French et al., 1999). Fig. 1. Distribuzione geografica dei diversi casi di Neosporosi riscontrati sino ad oggi. (Marquer et al., 1999) Inoltre si hanno sicuramente costi legati alla diagnosi, al ripristino della riproduttività degli animali, che comprende inseminazione artificiale, l acquisto di animali per la rimonta, se necessario, e, infine, il costo per l eventuale eliminazione di bovini sieropositivi e per l acquisto di animali sieronegativi (Dubey et al., 2003). - 10 -

Per quanto concerne una classifica dei costi, la Neosporosi, si pone immediatamente dopo l infezione da virus della diarrea virale bovina (BVDV), ma prima della paratubercolosi e della leucosi bovina enzootica (Chi et al., 2002). Sporadicamente, nei vitelli possono manifestarsi, alla nascita, turbe di tipo neurologico con incoordinazione dei movimenti e paralisi degli arti. Oltre che nel bovino, l esistenza di infezioni da N. caninum è stata individuata in numerose altre specie animali, quali cane, pecora, capra, cavallo, cervo, nonché in camelidi e mammiferi marini (Dubey et al., 2007). Per quanto riguarda la situazione nel Nord Italia, N. caninum appare ampiamente diffusa nell allevamento della vacca da latte con danni ingenti soprattutto negli allevamenti dove l evento aborto assume un andamento epidemico (gli autori anglosassoni utilizzano il termine abortion storm per indicare appunto l improvvisa insorgenza e l intensità del fenomeno) (Dubey et al., 1999; Yaeger et al., 2004;). La via principale di trasmissione dell infezione è quella verticale, tra madre e feto, ma può verificarsi anche per via orizzontale attraverso l ingestione da parte del bovino di oocisti emesse con le feci da cani infetti. - 11 -

È ancora in corso di accertamento l eventuale trasmissione per via sessuale o attraverso il latte (Anderson, Reynolds et al., 1997). Il lavoro che ho effettuato ha avuto l obiettivo di valutare la sieroprevalenza di N. caninum nel sangue precolostrale di vitelli nati nell arco di 15 mesi (03/04-06/05) in un allevamento nel veronese, nel quale è stata più volte riscontrata la presenza di N. caninum come causa dominante di aborto. L obiettivo è stato quindi di confermare ulteriormente come N. caninum venga trasmessa direttamente dalla madre infetta al prodotto del concepimento durante la vita intrauterina (trasmissione verticale), e come questo importante evento possa venir evidenziato attraverso la rilevazione di anticorpi contro N. caninum effettuata sul sangue del vitello, ancora prima che questo abbia assunto colostro dalla madre (prelievo precolostrale). L eventuale riscontro di sieropositivà nel vitello in esame, deriva quindi da un attivazione dell immunità attiva umorale dello stesso vitello, dovuta al passaggio transplacentare dei tachizoiti, e non dall immunità passiva colostrale eventualmente appresa dalla madre sieropositiva. - 12 -

La tesi è stata suddivisa in due parti: Nella prima, di carattere generale, dopo una descrizione delle caratteristiche di N. caninum e del suo ciclo vitale, prendo in considerazione l epidemiologia, la patogenesi e la sintomatologia della Neosporosi nella vacca da latte, nonché le tecniche diagnostiche più utilizzate e quelle ancora in via di sperimentazione ed infine i sistemi di terapia e profilassi che possono venir adottati all interno di un allevamento; nella seconda parte, di carattere sperimentale, descrivo i risultati sierologici ottenuti con la ricerca di anticorpi contro N. caninum attraverso metodica IFAT ed ELISA su un campione di 106 vacche da latte e sui propri vitelli nati nell arco dei 15 mesi, mettendo in evidenza la trasmissione verticale (trasmissione transplacentare) di N. caninum tra le madri ed i rispettivi vitelli. - 13 -

PARTE GENERALE - 14 -

- Capitolo 1 - CARATTERISTICHE GENERALI DI NEOSPORA CANINUM La Neosporosi bovina è una patologia a carattere abortigeno sostenuta da Neospora caninum; è emersa in tutto il mondo come un importante causa di patologia riproduttiva che colpisce sia bovine da latte che da carne (Dubey et al., 1996; Anderson et al., 2000). Neospora caninum è un parassita intracellulare obbligato a prevalente localizzazione intracitoplasmatica, correlato morfologicamente e antigenicamente con Toxoplasma gondii. - 15 -

TASSONOMIA Regno: Protista Phylum: Apicomplexa Classe: Sporozoa Sottoclasse: Coccidia Ordine: Eucoccidiorida Sottordine: Eimeriorina Famiglia: Sarcocystiidae Genere: Neospora Specie: Caninum - 16 -

- 17 -

La prima descrizione di Neospora caninum risale al 1984, in Norvegia, dove Bjerkås et al. (1991) isolarono un parassita strutturalmente assimilabile a Toxoplasma gondii, dal cervello (Fig. 2) e dal tessuto muscolare di cani affetti da una forma clinica di encefalopatia, senza però che gli animali avessero logicamente anticorpi contro T. gondii. Nel 1988, in USA, si isolò un parassita di caratteristiche simili in 10 cani che soffrivano di alterazioni neurologiche, dimostrando, con l'utilizzo di tecniche sierologiche e immunoistochimiche, che si trattava di un parassita differente a Toxoplasma gondii, e per questo venne dato il nome di Neospora caninum (Dubey et al., 1988). Fig. 2. Encefalite di tipo non purulento da Neospora caninum nel cane. (freccia: cisti contenente bradizoiti). Attraverso studi biologici e molecolari è stata confermata l esistenza di un ulteriore specie di Neospora, isolata esclusivamente negli equini, agente eziologico di turbe a carattere neurologico (mieloencefalite equina; EPM). Marsh et al. (1999) proposero il nome di Neospora Hughesi, parassita molto simile strutturalmente a N. caninum, oltre che a Sarcocystis neurona, altri agenti eziologici di EPM: la loro differenziazione da un punto di vista - 18 -

sierologico è molto difficile, l unico test con alta specificità e sensibilità risulta essere solo la PCR (Fenger et al., 1997; Schock et al., 2001; Dubey et al., 2003). Solo poi con l identificazione e la sequenziazione amminoacidica di particolari antigeni di superficie comuni del genere Neospora, si è potuto comprendere al meglio le differenze specifiche tra N. caninum e N. hughesi. Esiste infatti, tra N. caninum (Nc) e N. hughesi (Nh), fino ad un 6% di variabilità nella sequenza amminoacidica dell antigene di superficie SAG1, proteina antigenica di 29-36 kda, localizzata solo sulla superficie dei tachizoiti, con funzione di adsorbimento durante la penetrazione nella cellula ospite, e fino ad un 9% di differenza tra le due sequenze amminoacidiche di SRS2, un antigene di 35-43 kda esposta sia sulla superficie di tachizoiti che bradizoiti (Dubey et al., 2002). I polimorfismi di questi geni e della loro struttura proteica offrono un ulteriore sistema di differenziazione per distinguere appunto N. caninum da N. hughesi (Marsh et al., 1999). - 19 -

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E DIFFERENZIALI DI N. CANINUM Recenti studi su N. caninum sono stati effettuati per dimostrare le differenze strutturali e morfologiche con Hammondia heydorni, un altro protozoo intestinale del cane, causa di diarrea in animali immunodepressi; l obiettivo era quello di definire come i due parassiti fossero effettivamente due specie differenti (Nishikawa et al., 2002). Fig. 3. Elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti Nc5-PCR amplificati di: 1) H. heydorni; 2) controllo positivo per N. caninum Nc-1; 3) controllo negativo privo di DNA. Le bande di migrazione misurano approssimativamente 337 bp (freccia). È stato inoltre eseguito uno studio con l utilizzo della PCR, alla quale segue un elettroforesi in gel di agarosio che, in caso di positività, permette di evidenziare in maniera amplificata il frammento genomico specifico di N. Caninum (Nc5) (Müller et al., 2001) (Fig. 3). Questa sequenza nucleotidica, specifica del genoma di N. caninum NC-1, è stata però riscontrata anche in H. Heydorni, quindi i due protozoi risulterebbero indistinguibili (Ellis et al., 1999; Mugridge et al., 1999; Schares et al., 2002). Solo nel 2002, Dubey et al., attraverso una nuova descrizione morfologica, ultrastrutturale e genetica, riconobbero i due protozoi come due generi e specie distinte. - 20 -

Il problema epidemiologico e diagnostico permane ancora per quanto riguarda le oocisti di Neospora caninum ritrovate nelle feci di cane, le quali al microscopio risultano morfologicamente e strutturalmente identiche alle oocisti di Hammondia heydorni rinvenute nelle feci di cane (McAllister et al., 1998; Reichel et al., 2007) (Fig. 4). Fig. 4. Oocisti di Neospora caninum (sinistra) ed Hammondia heydorni (destra). Esistono strutturalmente e chimicamente molte analogie tra T. gondii e N. caninum, sostenute da diverse specifiche ricerche. Xiao-lin, Grigg et al. (2002) rilevarono come la superficie di Toxoplasma gondii fosse rivestita da glicosilfosfatidilinositolo, una peculiare proteina di superficie (SRS), di cui SAG1 ne è il prototipo (dimensioni 1.7 Å). Le proteine SRS hanno la funzione di regolare la virulenza del parassita stesso, in quanto modulano il meccanismo dell'adsorbimento a livello di cellule bersaglio: questo è sicuramente un parametro del successo della capacità infettante di T. gondii. Toxoplasma utilizza un vasto repertorio di proteine di superficie d adesione per penetrare nelle cellule bersaglio, responsabili anche dell attivazione della risposta immunitaria dell ospite. - 21 -

Oggigiorno si pensa che la famiglia proteica SRS funzioni come un set di recettori capace di dar luogo ad una cascata di interazioni che permettono appunto l entrata del parassita nelle cellule bersaglio. Ad esempio, durante la malattia acuta, SAG1 e SAG2 sono immunodominanti all'interno della superfamiglia SRS, e in particolare SAG1 ha un ruolo critico per quanto concerne la risposta immunitaria osservata durante le fasi iniziali di infezione. SAG1 probabilmente ha addirittura un duplice ruolo, ossia di adesina e di target per la risposta immunitaria. Fig. 5. Allineamento delle sequenze della superfamiglia SRS (glicosilfosfatidilinositolo: antigene di 35-43 kda). Differenze nella sequenza tra quello di Neospora caninum (NcSAG1; seconda riga) e gli altri geni che appartengono a Toxoplasma gondii. ROSSO: cisteina, legami disolfuro; GIALLO: parti di sequenze geniche maggiormente simili tra N. caninum e T. gondii. - 22 -

Questo è avvalorato dal fatto che i bradizoiti di T. gondii, nei quali manca naturalmente SAG1, non vengono attaccati dal sistema immunitario dell ospite e riescono così a persistere indisturbati all interno delle cisti tessutali nei quali sono contenuti. Per il rilevamento di queste particolari proteine sono stati messi a punto degli anticorpi marcati (mab) che riconoscono nello specifico un epitopo di 36 kda, chiamato appunto P36 (Tomavo et al., 1991). Da allora mab-p36 è usato come marker per la ricerca di bradizoiti di Toxoplasma gondii e nello specifico per la diagnosi differenziale da Neospora caninum, tra le quali strutturalmente vi sono numerose proteine di superficie simili (Chahan et al., 2003) (Fig. 5). - 23 -

STADI MORFOLOGICI Fig. 6. Struttura generale di tachizoita e ciclo generale del Phylum Apicomplexa. Gli Apicomplexa costituiscono un Phylum di protozoi che include alcune migliaia di specie, caratterizzate dall assenza di organi di movimento (ciglia o flagelli). Il ciclo di riproduzione di questi parassiti è costituito dall alternanza di una fase asessuata (schizogonia) e una fase sessuata (gametogonia) che porta alla formazione di forme infettanti dette sporozoiti (Fig. 6). Sono aploidi durante tutto il ciclo vitale, salvo che nella fase di zigote, che comunque è di brevissima durata. N. caninum si presenta in vari stadi evolutivi: 1. stadio di tachizoita; 2. stadio di bradizoita; 3. stadio di oocista. - 24 -

STADIO DI TACHIZOITA I tachizoiti sono di forma allungata o a semiluna, di dimensioni variabili dai 3 ai 7 µm per 1-5 µm (Dubey e Lindsay, 1988) (Fig. 7 e 10). In questo stadio evolutivo di tipo asessuato il parassita è nettamente infettante, si moltiplica rapidamente e quindi invade molti distretti e tessuti dell organismo dell ospite intermedio. Questo fenomeno prende il nome di endodiogenesi e porta alla formazione di due zoiti; consiste sostanzialmente in un processo di gemmazione interna (budding process) col quale si formano appunto 2 cellule figlie (zoiti) all interno della cellula madre (Dubey e Lindsay, 1996). Fig. 8. Vacuolo parassitofori (freccia) con tachizoiti di N. caninum. Fig. 7. Rappresentazione schematica di tachizoiti di N. caninum all interno di una cellula ospite. I tachizoiti di N. caninum sono stati rinvenuti in molte cellule tra le quali: neuroni, macrofagi, miociti, epatociti, fibroblasti, fibrocellule muscolari, nelle cellule degli endoteli vasali e nell epitelio tubulare renale (Dubey e Lindsay, 1999); inoltre hanno la capacità di attraversare la barriera placentare ed essere così un importante causa di infezione del prodotto del concepimento. - 25 -

Il parassita può essere libero nel citoplasma o all interno di vacuoli parassitofori che possono essere anche più di uno in una cellula (Dubey e Lindsay, 1996) (Fig. 8). Una cellula può contenere anche fino a 100 tachizoiti e la penetrazione del tachizoita nella cellula avviene in tempi molto ristretti (Dubey et al., 1996). La struttura microscopica del tachizoita è caratterizzata da: o nucleo; o nucleolo; o un complesso apicale costituito da: 2 anelli polari; rhoptrie; moltissimi micronemi (circa 150); il conoide; o pochissimi granuli di aminopectina (granuli densi); o 22 microtubuli sottopellicolari; o un mitocondrio; o apicoplasto; o il plasmalemma; o il reticolo endoplasmatico denso; o apparato di Golgi (Dubey et al., 1988; Dubey e Lindsay, 1996). - 26 -

Nel processo di invasione della cellula ospite, svolge un ruolo fondamentale il complesso apicale, un insieme di strutture citoscheletriche e vescicolari presente in tutti gli stadi invasivi degli Apicomplexa. La componente citoscheletrica è costituita dal conoide, che è in grado di estroflettersi durante l invasione, mentre la componente vescicolare è costituita dai micronemi e dalle rhoptrie, organelli che secernono il proprio contenuto apicalmente. Le rhoptrie sono strutture elettrondense quindi particolarmente visibili, anche per le loro dimensioni decisamente superiori a quelle di altre strutture interne del tachizoita (Dubey et al., 2002) (Fig. 9). Fig. 9. Struttura schematica di un tachizoite del phylum Apicomplexa (foto sopra). A sinistra la stessa cellula ripresa al microscopio elettronico a trasmissione (C= conoide; DG= granuli densi; MN= micronemi; N= nucleo; R= rhoptrie; barra=1 µm) Il processo di invasione richiede 15-20 secondi, culminando nella formazione di un vacuolo parassitoforo all interno del quale il parassita si moltiplica. - 27 -

I micronemi contengono un corredo di proteine adesive le quali, esposte sulla superficie del tachizoita (SAG1, MIC1, MIC4), contribuiscono alla formazione della cosiddetta giunzione mobile. Questa struttura, che crea un contatto tra la membrana di N. caninum e quella della cellula ospite, dipende dall interazione specifica tra domini adesivi delle proteine dei micronemi e ligandi espressi sulla membrana della cellula bersaglio. La secrezione del contenuto dei micronemi è un processo stimolato dalla mobilizzazione delle riserve di Ca ++ intracellulare del parassita, con conseguente aumento della concentrazione intracellulare di questo ione. Successivamente ai micronemi, sono le rhoptrie a rilasciare il proprio contenuto di proteine (ROP2), per lo più coinvolte nella modificazione del vacuolo parassitofori. L apicoplasto, infine, è un organello da molti considerato come una traccia di un rapporto simbiotico mutualistico atavico tra i parassiti del Phylum Apicomplexa e un alga. Non si conosce ancora del tutto la sua funzione ma molto probabilmente ha un ruolo fondamentale nel metabolismo del parassita (Ajioka et al., 2001). Fig. 10. Tachizoiti di N. caninum al microscopio elettronico (x7500). - 28 -

STADIO DI BRADIZOITA Fig. 11. Cisti tissutali contenenti bradizoiti. Sono la forma latente del parassita e ne permette la notevole e durevole resistenza nell ospite intermedio. Si localizzano all interno di cisti tissutali, le quali si rinvengono soprattutto a livello di sistema nervoso centrale (cervello, midollo spinale, nervi periferici) e di retina (Dubey et al., 1988) (Fig. 11). Una singola eccezione riguarda una cisti solitaria rinvenuta nel muscolo oculare di un puledro (Lindsay et al., 1998). Più recentemente, cisti contenenti bradizoiti sono state osservate anche a livello di muscolo in alcuni bovini (Peters et al., 2001). Le cisti tissutali di N. caninum possono raggiungere un diametro di 107 µm e possono essere di forma ovale o rotonda (Dubey e Lindsay, 1996) e contenere dai 20 ai 100 bradizoiti (Speer et al., 1999); lo spessore della parete può variare dai 0,5 ai 4 µm: lo spessore varia in base all età della cisti stessa (Speer et al., 1999). - 29 -

Mediante l uso dell esame immunoistochimico e del microscopio è possibile distinguere i bradizoiti di Neospora caninum dai tachizoiti (Peters et al., 2001). Infatti i bradizoiti presentano un numero minore di rhoptrie e un numero maggiore di granuli PAS-positivi rispetto ai tachizoiti (Fig. 12). Fig. 12. Confronto tra tachizoiti di N. caninum (A) e bradizoiti (B) coltivati in vitro (Microscopio elettronico). Notare la parete della cisti di spessore maggiore (B) rispetto alla struttura contente tachizoiti (A). (barre: (A)=1,3 µm; (B)=0,8 µm) I bradizoiti hanno dimensioni variabili: 5,2 (±0,6) x 1,6 (±0,3) µm (Peters et al., 2001). Il nucleo lo si può rinvenire nella zona subterminale. (Peters et al. 2001). Possono essere infestanti per via orale sia per l ospite intermedio (Dubey e Lindsay, 1988) che per quello definitivo (McAllister et al., 1998). Nell ospite intermedio, in particolare se parzialmente immunodepresso, in corso ad esempio di una gravidanza, i bradizoiti si riattivano e si trasformano rapidamente in tachizoiti, forma infettante attiva, capace di invadere agevolmente il feto e causare aborto. - 30 -

Nel cane (ospite definitivo), che si infetta ad esempio ingerendo carne infetta contenente bradizoiti, Neospora giunge a livello intestinale dove ha inizio la fase sessuata del ciclo vitale del parassita, attraverso la quale si ha l origine delle oocisti non sporulate che possono venir disseminate nell ambiente esterno attraverso le feci. I bradizoiti si formano a partire dai tachizoiti stessi i quali, nel momento in cui si attiva la risposta immunitaria dell ospite, reagiscono incistandosi. In questo modo il parassita riesce a sottrarsi dall azione del sistema immunitario e può quindi resistere anche degli anni all interno dell organismo (Dubey et al., 2002). - 31 -

STADIO DI OOCISTA Fig. 13. Oocisti di Neospora caninum: (A) oocisti non sporulata; (B) oocisti sporulata (freccia grande: sporocisti; frecce piccole: sporozoiti. Lo stadio di oocisti, è lo stadio in cui il parassita, potenzialmente infettante, viene eliminato dall ospite definitivo. Il cane, infatti, elimina con le feci le oocisti nella forma non sporulata, altamente resistenti nell ambiente esterno (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). Solo all esterno dell ospite definitivo e dalle 24 alle 72 ore dalla loro espulsione, le oocisti di Neospora sporulano, diventando appunto oocisti sporulate, forma infestante, che possono così venir ingerite dall ospite definitivo od intermedio (Lindsay, 1998) (Fig. 13). - 32 -

Ogni oocisti contiene due sporocisti, che a loro volta contengono quattro sporozoiti (Dubey, 1999) (Fig. 14). Le oocisti hanno forma ovoidale o sferica, sono costituite da una doppia parete e le dimensioni variano da 11,3 a 11,7 µm (McAllister et al., 1998; Dubey, 2002). Gli sporocisti contenuti all interno dell oocisti sporulata, sono di forma ellissoidale e possiedono un nucleo posizionato centralmente o nella parte posteriore (Lindsay et al., 1999). Fig. 14. Oocisti di Neospora caninum contenente i due sporocisti. - 33 -

- Capitolo 2 - CICLO VITALE DI NEOSPORA CANINUM Il ciclo vitale di N. caninum richiede la presenza di due ospiti: ospite intermedio; ospite definitivo. Il ciclo ha inizio con l ingestione, da parte di un animale (ospite intermedio o definitivo), delle oocisti sporulate (contenenti 8 sporozoiti) emesse nell ambiente esterno dall ospite definitivo (cane, coyote...) (Fig. 15; 1). Nell ospite definitivo, gli sporozoiti, arrivati a livello intestinale ad esempio con l alimento contaminato, escono dalla spora e penetrano ciascuno in una cellula della mucosa intestinale, utilizzando il complesso apicale (1a). Nella cellula si trasformano in trofozoiti che si nutrono della cellula stessa, aumentando di dimensioni (2). A questo punto prende il via la fase di riproduzione asessuata (schizogonia) caratterizzata dalla moltiplicazione del nucleo dei trofozoiti, senza la contemporanea suddivisione citoplasmatica. Da questo processo deriva una forma multinuleata, denominata schizonte (3). - 34 -

Successivamente segue la divisione cellulare con la formazione di numerosi merozoiti, che escono dalla cellula ospite ormai distrutta e penetrano in altre cellule intestinali vicine per ripetere tutto il processo di schizogonia (4). Il numero di fasi di schizogonia non è conosciuto, molto probabilmente è variabile ed in funzione dell attivazione più o meno immediata della risposta immunitaria dell animale stesso. A questo punto i merozoiti prodotti nell ultimo ciclo di schizogonia, penetrano ulteriormente in un enterocita dando inizio alla fase di riproduzione sessuata di N. caninum. Una parte dei merozoiti dà origine a gameti femminili, singoli, mononucleati ed ancora endocellulari (macrogameti) (5); un altra parte dà invece origine ai gameti maschili, mobili ed extracellulari (microgameti) (6), che individuano le cellule contenti il gamete femminile, vi penetrano fondendosi col macrogamete e dando origine all unica fase diploide (zigote) del parassita (7). Lo zigote quindi comincia a ricoprirsi di una parete di protezione ed abbandona la cellula della mucosa intestinale, cadendo nel lume intestinale e raggiungendo l ambiente esterno con le feci (oocisti non sporulata) (8). All esterno avviene la fase di sporulazione dell oocisti (9), la quale, dopo circa 24-72 ore, si trasforma in una oocisti sporulata costituita al suo interno da due sporocisti contenenti ognuno 4 sporozoiti (10). L ospite definitivo, può inoltre infettarsi attraverso l ingestione di tessuti contenenti cisti parassitarie di N. caninum (12). I bradizoiti, presenti nelle cisti, similmente agli sporozoiti, si liberano nel lume intestinale e si trasformano in tachizoiti i quali danno inizio alla fase di replicazione asessuata, per terminare con la formazione dello zigote e quindi dell oocisti non sporulata (13). - 35 -

Quando invece le oocisti sporulate sono ingerite dall ospite intermedio (bovino, cavallo, ovi-caprini...), i trofozoiti, dopo essersi liberati della parete cistica, vengono rilasciati nel lume intestinale e divengono tachizoiti. I tachizoiti si dividono rapidamente e diffondono in tutto l organismo, invadendo le cellule di numerosi organi (fegato, reni, cuore, polmoni, muscoli, derma e SNC) nelle quali avviene la moltiplicazione asessuata (scissione binaria): lo stadio di tachizoite è associato ad infiammazione e necrosi nel sito d invasione. Nelle bovine gravide, i tachizoiti possono nel giro di poco tempo, invadere il feto passando attraverso la placenta, ed essere così causa di aborto. A seguito della risposta immunitaria dell animale, i tachizoiti si rifugiano all interno di una cisti, trasformandosi in bradizoiti (1b). Le cisti tissutali sono circondate da una parete cistica molto spessa e resistente, e sono reperibili principalmente nei tessuti neuronali (cervello, midollo spinale). I tessuti cistici inducono una reazione infiammatoria minima e possono persistere nel bovino per lunghi periodi di tempo senza manifestazioni cliniche. Si presume che, in corso di una gravidanza, i bradizoiti latenti in queste cisti vengano attivati, e si differenzino nello stadio di tachizoite, infettivo e mobile, che raggiunge, attraverso i tessuti, il sangue e/o sistema linfatico, la placenta e il feto ed essere così causa di aborto (11). Come risultato di questa "riattivazione" dei parassiti, ripetute infezioni fetali possono verificarsi nella stessa madre infetta, nelle gravidanze successive. - 36 -

Fig. 15. Ciclo vitale di Neospora caninum nell ospite definitivo e intermedio. - 37 -

OSPITE INTERMEDIO L ospite intermedio, comprende il bovino, la capra, la pecora, il suino, il cavallo, il cervo, la volpe, i roditori (topi, ratti...) e volatili da cortile (Tabella 1.). In questi animali ha luogo il ciclo asessuato del parassita, che comprende lo stadio di tachizoita e lo stadio di bradizoita (endodiogenesi). Tra gli ospiti intermedi, sono da aggiungere la lontra di mare che vive in Alaska (Enhydra lutris) e il delfino (Tursiops truncatas), nei quali sono stati messi in evidenza anticorpi anti-neospora (Dubey et al., 2007). Inoltre il DNA del protozoo è stato isolato nel lama (Lama glama) e nell alpaca (Vicugna pacos) da un equipe ispano-cilena. La sieroprevalenza in questi due camelidi è importante, varia dal 30 al 40% (Pèreira-Bueno et al., 2000; Serrano-Martìnez et al., 2004). In un recente studio epidemiologico, anche l esposizione a volpi rosse (Vulpes vulpes) e volpi grigie (Urocyon cinereoargenteus) è stata identificata come un fattore di rischio per l infezione da N. caninum per i bovini al pascolo (Barling et al., 2000), ma non è ancora chiaro come, essendo canidi, riescano ad eliminare nell ambiente esterno le oocisti: per questo motivo sono da considerare ancora come ospiti intermedi (Schares et al., 2002). In Belgio e Spagna, anticorpi anti-neospora caninum sono stati dimostrati in più del 17% delle volpi rosse (Vulpes vulpes) testate (Buxton et al., 1997; Almeria et al., 2002), mentre nessuna sieropositività è stata rilevata in Svezia nelle volpi saggiate (Jakubek, 2001). Questi animali sono da considerare anch essi ospiti intermedi. - 38 -

Negli ultimi anni è stata riscontrata una significativa sieroprevalenza da N. caninum anche nel lupo grigio (Canis lupus), nell orso bruno (Ursus arctos) e nel tasso (Meles meles) oltre che in diversi ruminanti selvatici come il cervo a coda bianca (Odocoileus virginianus), il cervo rosso (Cervus elaphus), il capriolo (Capreolus capreolus) e l alce (Alces alces) (Gondim et al., 2004). Tabella 1. Ospiti intermedi di Neospora caninum e loro distribuzione geografica; positività all infezione dimostrata attraverso immunoistochimica (IHC) o PCR. (Dubey et al., 2007) - 39 -

Una importante sorgente di infezione, soprattutto negli allevamenti, potrebbe essere rappresentata dalla potenziale implicazione, nel ciclo domestico, dei roditori (topo, ratto...), attraverso una trasmissione diretta, mediante cioè l ingestione di carne con cisti contenenti bradizoiti. Tuttavia, al momento, l infezione naturale del topo è stata dimostrata solo da un equipe a Taiwan (Huang et al., 2004). Questa rivelazione può essere una solida evidenza di come il ciclo di Neospora caninum possa collegarsi al di fuori dei carnivori e dei ruminanti. Anche se i ratti probabilmente non sono ospite definitivi, essi in ogni modo hanno la potenzialità di trasmettere N. caninum al bestiame!! Basti solo pensare quando vengono effettuati i carichi per costituire l unifeed attraverso i carri trinciamiscelatori. Non è di raro riscontro la presenza tra il fieno, la paglia, i mangimi, gli insilati, della libera circolazione di topi e ratti, i quali possono involontariamente essere caricati assieme agli alimenti, venir frantumati con l unifeed e distribuiti tranquillamente al bestiame in stalla. I roditori, poi, vengono anche cacciati dai canidi (volpi, lupi, cani domestici...) aumentando così indirettamente il rischio di infezione del bestiame (McAllister et al., 2000). Ci sarebbe inoltre necessità di eseguire una più approfondita indagine per valutare l eventuale implicazione nell elenco di ospiti intermedi, degli uccelli (piccioni, galline, anatre...). Due indagini epidemiologiche hanno comunque riscontrato che la presenza di pollame negli allevamenti di vacche da latte, è associata con un incremento del rischio di Neosporosi tra gli animali. - 40 -

Sembrerebbe comunque improbabile che il pollame possa trasmettere Neospora caninum direttamente al bestiame; ma se le galline e altri volatili da cortile sono ospiti intermedi, allora potrebbero trasmettere l organismo agli eventuali cani presenti in allevamento (Otranto et al., 2003). Non è ancora del tutto esclusa la possibilità di trasmissione di N. caninum all uomo. In uno studio condotto in Svezia da Petersen, Lebech, Jensen et al. (1999) su 76 donne (dai 19 ai 41 anni di età) che accusavano ripetuti aborti o morte intrauterina del feto, vennero eseguiti degli esami sierologici per valutare la sieroprevalenza di N. caninum. I test utilizzati (ELISA, IFAT) erano comunque basati su metodi usati per la ricerca anticorpale di T. gondii (agente abortigeno nell uomo): i risultati però esclusero la presenza di Ac-anti N. caninum in queste donne testate. L equipe giunse alla conclusione che molto probabilmente l infezione da N. caninum nell uomo è potenzialmente possibile, soprattutto in quei pazienti più sensibili perché ad esempio immunodepressi. Quello che si deve continuare a fare, è ricercare sicuramente un più valido ed attendibile test per la diagnosi indiretta di N. caninum nell uomo. Tra questi certamente si annovera la PCR e l immunoistochimica, effettuate su biopsie od eventualmente su tessuti prelevati in corso di autopsie di feti abortiti. - 41 -

OSPITE DEFINITIVO Nell ospite definitivo si ha il completamento del ciclo vitale di Neospora caninum, attraverso le fasi della riproduzione sessuata, che porta alla produzione di oocisti non sporulate, che solo nell ambiente esterno, in adatte condizioni di temperatura ed umidità, sporulano e divengono così infettanti. Ancora prima della completa conoscenza del ciclo vitale di Neospora, ci si è resi conto che la presenza di cani in allevamento aumentava il rischio di aborto nelle bovine (Parè et al., 1998; Wouda et al., 1999). Il cane (Canis familiaris), il dingos (Canis dingos) ed il coyote (Canis latrans) eliminano le oocisti nelle feci dopo essersi alimentati con tessuti di bovini o topi infetti da N. caninum; essi sono da considerare quindi come ospiti definitivi di N. caninum (McAllister et al., 1998; Basso et al., 2001; Gondim, Gao, McAllister, 2002). Sino ad ora sono stati riportati tre casi di cani che eliminano naturalmente oocisti di N. caninum. Uno di questi studi però riporta che cani alimentati con feti bovini infetti da N. caninum non hanno eliminato oocisti (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). - 42 -

CICLO DOMESTICO E CICLO SELVATICO Fig. 16. Ciclo selvatico e ciclo domestico di Neospora caninum. - 43 -

La presenza del coyote e del dingos come animali selvatici eliminatori di oocisti di Neospora caninum (ospite definitivo) e dei grandi erbivori selvatici come ospiti intermedi, lascia intravedere un ciclo selvatico autonomo e molto probabilmente interconnesso al ciclo domestico mantenuto dal cane: a sostegno di ciò vi è una dimostrazione di come i giovani coyote (Canis latrans) e i dingos australiani (Canis dingos), possono eliminare oocisti nell ambiente esterno, in seguito a ingestione sperimentale di tessuti contaminati da Neospora caninum (Barling et al., 2000; Ferroglio, Rossi, 2001). In questo ciclo, come in quello domestico, l ospite definitivo elimina le oocisti non sporulate all esterno attraverso le feci, contaminando così l ambiente in cui pascolano i ruminanti selvatici, come cervi, gazzelle, alci... Si è riscontrata, dai prelievi eseguiti, un indice di sieropositività più alto nei cervi a coda bianca, rispetto alle alci. Ciò potrebbe essere il risultato della diversa tipologia di alimentazione. Le alci, infatti, si cibano principalmente di foglie e ramoscelli, mentre i cervi pascolano, mangiando più vicino al suolo dove vi è un maggiore rischio di contaminazione fecale da parte di coyote o cani randagi eventualmente presenti (Gondim et al., 2004). Questi stessi ospiti definitivi selvatici possono essere fonte di infezione anche per gli eventuali bovini domestici presenti al pascolo. D altra parte sarà poi possibile che gli eventuali feti abortiti in corso di Neosporosi al pascolo possono venir ingeriti dai carnivori selvatici, i quali si infettano a loro volta (Fig. 16). La trasmissione fra animali selvatici e domestici è stata rilevata anche attraverso studi sperimentali. - 44 -

Nello specifico si è notato come il coyote sia in grado di eliminare oocisti non sporulata nell ambiente esterno, dopo essere stato alimentato con tessuti infetti di vitello (Gondim et al., 2004), e come lo stesso evento accada in cani alimentati con tessuti infettati da N. caninum di capriolo (Gondim et al., 2002). Questo studio è quindi a sostegno di un effettivo collegamento tra ciclo selvatico e ciclo domestico. - 45 -

- Capitolo 3 - EPIDEMIOLOGIA PIDEMIOLOGIA: trasmissione di Neospora caninum nella vacca da latte I bovini possono acquisire l infezione da N. caninum mediante trasmissione orizzontale (post-natale) o verticale (pre-natale). TRASMISSIONE ORIZZONTALE La trasmissione orizzontale avviene per ingestione di alimenti o acqua contaminati con oocisti eliminate dalle feci dell'ospite definitivo. Diversi studi epidemiologici hanno dimostrato che l infezione post-natale, per via orizzontale, è molto probabilmente responsabile per le c.d. tempeste d aborto (abortion storm). Per esempio, Dijkstra et al. (2002) hanno riportato la sieroconversione per N. caninum di bovine da latte di razza Holstein in un periodo di 6 mesi. - 46 -

In questa mandria, la presenza di anticorpi a bassa avidità (indice di una recente infezione) e la mancanza di correlazione tra lo status sierologico delle figlie e quello delle madri erano compatibili con un infezione primaria per via orizzontale. E interessante rilevare che, l elevata percentuale di sieroconversione non era associata ad un aumento di aborti, indicando che una sieroconversione di massa in mandrie di vacche da latte può passare inosservata (Dijkstra et al., 2002). In mandrie con infezione endemica che sono state testate in modo più esteso, vi è evidenza sierologica che possa verificarsi un livello basso di infezione post-natale da fonti ignote. Questo dato è in accordo con i risultati originati da studi di modelli matematici che suggeriscono che l infezione da N. caninum scomparirebbe col tempo dalle mandrie bovine se la trasmissione orizzontale fosse l'unica via di diffusione dell infezione (Parè et al., 1996; Davison, Otter, Trees, 1999; Hietala, Thurmond, 1999; Bergeron et al., 2001;Schares et al., 2003). - 47 -

TRASMISSIONE VERTICALE La trasmissione verticale comporta la trasmissione transplacentare di tachizoiti dalla madre infetta al feto durante la gravidanza. Si riconoscono 2 tipi di trasmissione verticale nel bovino: 1. trasmissione transplacentare esogena, caratterizzata dall ingestione da parte della vacca in gestazione, di oocisti non sporulate presenti nell ambiente, attraverso l alimento o l acqua da bere; 2. trasmissione transplacentare endogena, caratteristica delle vacche con infezione cronica latente (cisti tessutali) e costituita da una riattivazione e trasformazione dei bradizoiti di N. caninum in tachizoiti, i quali possono attraversare la barriera placentare ed essere causa di aborto; la quota di infezione transplacentare endogena decresce con le gravidanze successive, indicando l attivazione di un immunità protettiva (Anderson et al., 1995; Dijkstra et al., 2003; Romero e Frankena, 2003). Le infezioni latenti, presenti nella vacca in gestazione, possono essere state acquisite attraverso una trasmissione verticale (dalla propria madre) (Anderson et al., 1997) o essere di origine post-natale (orizzontale), per l eventuale presenza in allevamento di cani eliminatori di oocisti (Moen et al., 1998). Il meccanismo col quale queste infezioni latente si riattivano è davvero ancora poco conosciuto. L eventualità che un immunosoppressione, dovuta ad esempio ad infezioni concomitanti o per la presenza di micotossine nell alimento, possa essere la causa di questa recrudescenza dell infezione per la riattivazione dei tachizoiti, è tuttora in discussione e non supportata da dati certi (Wouda et al., 1998; Bartels et al., 1999; Pfeiffer et al., 2002). - 48 -

È di poco tempo fa la rilevazione, ad esempio, di come, con un inoculazione di progesterone durante la gravidanza, si abbia un aumento del rischio di aborto nelle vacche infettate (sieropositive) da N. caninum (Bech-Sabat et al., 2007). La trasmissione verticale sembra essere la via di trasmissione predominante d infezione in Europa e negli Stati Uniti, con una percentuale di efficienza tra l 65 ed il 95%, mentre percentuali più basse (23,5-60%) sono state rilevate in Nuova Zelanda (Parè, Thurmond, Hietala, 1996; Wouda, Moen, Schukken, 1998; Davison, Otter, Trees, 1999; Sanderson et al., 2000). In allevamenti con infezione endemica, la maggioranza dei vitelli nati da vacche sieropositive sono sieropositivi. Inoltre, la percentuale di sieropositività nella mandria non è correlata all'età delle bovine, il che suggerisce che la percentuale d infezione post-natale sia bassa. Per di più, i vitelli congenitamente infetti hanno un'infezione persistente cronica che può essere trasmessa per via transplacentare alla loro discendenza. - 49 -

ALTRE FONTI DI TRASMISSIONE Uggla et al. (1998) hanno riportato che vitelli inoculati per via orale con tachizoiti aggiunti al colostro, sono diventati sieropositivi a circa 5 settimane post-infezione. Tuttavia, non sono state osservate lesioni da N. caninum, ne positività immunoistochimica; il parassita non è stato, inoltre, isolato in seguito all inoculo di tachizoiti in animali da laboratorio. Il DNA di N. caninum è stato però ritrovato nel cervello, attraverso PCR. I dati, confermati anche da Davison et al. (2001), suggeriscono che il colostro potrebbe essere un fonte di infezione post-natale. Moskwa et al. (2003) recentemente hanno descritto il ritrovamento di DNA di N. caninum nel latte prodotto da bovine infette. Se questo evento venisse confermato come fonte di tachizoiti vivi e vitali, sarebbe da considerare un ulteriore pericolosa sorgente di infezione di tipo orizzontale, tra madre e vitello, oltre che per l uomo. Dubey et al (2007) hanno riportato comunque che non esistono segnalazioni in natura dell infezione di N. caninum con colostro, latte, etc. Altri ricercatori hanno ipotizzato, infine, come l ingestione di placenta o liquido amniotico espulso dalle bovine infette fosse un ulteriore fonte di trasmissione orizzontale tra bovini (Ho et al., 1996; Bergeron et al., 2001; Dijkstra, 2001). Questo non è stato finora verificato da Davison et al. (2001). - 50 -

È stata inoltre ipotizzata l eventualità della trasmissione di Neospora caninum per via genitale. Un equipe madrilena (Serrano et al., 2006) ha contaminato, in via sperimentale alcune giovenche, inseminandole con sperma addizionato con 1x10 7 tachizoiti. Le manze hanno subito una sieroconversione e la presenza del parassita è stata dimostrata (il DNA di Neospora caninum è stato riscontrato nel loro sangue). Tuttavia, quando il DNA di N. caninum è stato quantificato nello sperma di tori naturalmente infettati, questi stessi ricercatori hanno ritrovato solo l equivalente di 5-10 parassiti per millimetro di sperma (Caetano da Silva et al., 2004; Ferre et al., 2005; Ortega-Mora et al., 2003). Inoltre, non si conosce ancora del tutto il destino del parassita in caso di congelamento dello sperma, anche se è molto probabile che perda completamente la virulenza (Canada et al., 2006). - 51 -

- Capitolo 4 - PATOGENESI E SINTOMATOLOGIA Nelle vacche che abortiscono in conseguenza dell infezione da N. caninum, non si rilevano segni clinici di malattia. I feti abortiti sono in preda ad autolisi, senza lesioni macroscopiche e di solito non si ha ritenzione placentare (Fig. 17). Fig. 17. Feto mummificato (sinistra) e feto abortito (destra) nati da vacche sieropositive per N. caninum. - 52 -

L aborto può derivare da tre processi patogenetici potenzialmente concomitanti (Dubey et al., 2006): 1. una perturbazione dell equilibrio delle citochine placentari, che determina lo sviluppo di un processo infiammatorio locale; 2. una somma di microscariche di prostaglandine conseguenti al passaggio placentare di Neospora caninum, che determinano una lisi del corpo luteo; 3. un infestazione incontrollata del giovane feto, quindi fatale per il prodotto del concepimento. Fig. 18. Distribuzione temporale delle principali cause di aborto in base allo stadio di gestazione. - 53 -

Gli aborti avvengono a partire dai 3 mesi di gestazione fino alla fine della gravidanza, ma la maggioranza degli aborti da N. caninum avviene nel secondo trimestre di gravidanza. Questo modello che prevede l aborto a metà gestazione è fattore di diagnosi differenziale nei confronti di altre cause diagnosticate di aborto infettivo nelle bovine da latte, che tendono a verificarsi più tardi nel corso della gestazione (Fig. 18). Non è noto se l infezione da N. caninum possa provocare problemi riproduttivi nel primo trimestre di gestazione; comunque sono stati riscontrati casi di mummificazione fetale associati a focolai di Neosporosi (Fig. 17). Gli aborti da N. caninum avvengono durante tutto l'anno e sono stati riportati sia in bovine da latte che da carne. Gli aborti da Neospora caninum si osservano quindi più frequentemente tra il V ei VII mese di gravidanza (Anderson et al., 1991; Thurmond, 1995; Sager, Fischer, Furrer, 2001; Wouda et al., 1997). L influenza della fase di gestazione potrebbe essere legata a una maggiore recettività fetale; si tratta di un ipotesi avvalorata anche da studi istologici e sierologici. In effetti, prima del VI mese di gravidanza, il feto bovino può essere considerato totalmente non immunocompetente. Inoltre, esami istologici hanno evidenziato lesioni più gravi nei feti giovani, rispetto a feti di età maggiore (Ogino et al., 1992). L infezione del feto nel primo trimestre di gravidanza sfocia sistematicamente in aborto, mentre nel corso del secondo trimestre l infezione non causa necessariamente un processo abortivo, poiché il feto è in grado di contrastare l infezione parassitaria. - 54 -