Basi cellulari e molecolari della vita Prof. Dr. Stefano Martellucci
Il corso Il corso di Genetica, facente parte dell'insegnamento di Basi Cellulari e Molecolari della Vita, ha lo scopo di fornire conoscenze di base della genetica formale e molecolare e quindi dei principi relativi alla trasmissione dell informazione genetica, mostrando come questi mantengano la loro validità nei diversi sistemi biologici ma facendo contemporaneamente risaltare le peculiarità le specificità e le eccezioni che testimoniano la forza dei processi evolutivi che li hanno plasmati conservando e diversificando gli organismi sotto la pressione della selezione. L approccio metodologico prevede una ricostruzione storica del progredire delle conoscenze accompagnata da una puntuale analisi del processo logico/intuitivo che ha guidato la sperimentazione e che ha portato alla comprensione dei meccanismi della trasmissione dei caratteri ereditari. Prof. Dr. Stefano Martellucci s.martellucci@sabinauniversitas.it Programma 1. DNA, Trascrizione e Traduzione; 2. Ciclo cellulare, Mitosi e Meiosi; 3. Il cromosoma eucariotico; 4. L ereditarietà. Materiale didattico Slides caricate sul portale - http://www.sabinauniversitas.net/cloud/ - sull applicazione itunes University del proprio dispositivo mobile Apple inserire il codice: EYW-TEK-HFL Biologia molecolare della cellula, B. ALberts, IV Edizione, Zanichelli Editore; Biotecnologie Molecolari, Terry A. Brown, II Edizione. Zanichelli Editore;
Esperimento di Griffith del 1928 Streptococcus pneumoniae causa la polmonite ed è di solito letale nel topo. Griffith usò due ceppi batterici diversi distinguibili in base all aspetto delle colonie su agar: il ceppo virulento ha una capsula polisaccaridica e forma colonie dall aspetto liscio (S); l altro ceppo non virulento manca della capsula polisaccaridica e forma colonie rugose. Gli esperimenti A, B, e C dimostrarono che i batteri dovevano essere vivi ed avere l involucro polisaccaridi per poter essere letali L esperimento D portò Griffith a concludere che vi fosse una proteina trasformante (principio trasformante)
Esperimento di Avery (1944) Oswald Avery e i suoi colleghi ripresero gli esperimenti di Griffith e cercarono di identificare il fattore trasformante studiando in provetta i batteri R ed S. Il gruppo di ricerca distrusse chimicamente uno alla volta i tipi di sostanza presenti nella miscela (lipidi, proteine, acidi nucleici) nell estratto di cellule S morte.
La miscela perdeva la capacità di trasformare solo quando era trattata con nucleasi (enzimi che degradano selettivamente gli acidi nucleici): RNasi: il principio trasformante era presente DNasi: il principio trasformante spariva Il DNA contiene il materiale genetico, frammenti del DNA trasformante che conferisce virulenza entrano nel cromosoma batterico e sostituiscono la loro parte corrispondente che non conferisce virulenza
Esperimento di Hershey e Chase (1952) Studio condotto sul batteriofago T2, virus che infetta i batteri costituito da DNA e proteine: quale delle due componenti riprogramma la cellula ospite per farle produrre nuovi fagi?
Il DNA era trasferito alle cellule batteriche mentre le proteine erano rimaste all esterno: il DNA modificava il programma genetico dei batteri che si trasformano in fabbriche di batteriofagi
Studio della struttura molecolare del DNA DNA: polimero costituito dai nucleotidi (moneri) Nucleotide Gruppo fosfato Pentoso (zucchero a 5 atomi di C) Base azotata
Zucchero I due gruppi differiscono per i gruppi sostituenti legati al Carbonio 2: gruppo ossidrilico (OH) nel Ribosio gruppo idrogeno (H) nel Desossiribosio
Basi azotate Strutture a singolo anello formate da 6 atomi Strutture a doppio anello formate da 9 atomi N.B. L Uracile è presente solo nel RNA
Nucleoside (Zucchero + Base azotata) Sia nel DNA che nel RNA le basi azotate sono sempre legate all atomo di Carbonio 1 del Pentoso da un legame covalente. Le purine (A, G) sono legate a livello dell N9 Le pirimidine (C, T) si legano a livello dell N1
Nucleotide (Zucchero + Base azotata + Gruppo fosfato) Sia nel DNA che nel RNA il gruppo fosfato è legato a livello del C5 e le basi azotate sono sempre legate all atomo di Carbonio 1 del Pentoso da un legame covalente. Le purine (A, G) sono legate a livello dell N9 Le pirimidine (C, T) si legano a livello dell N1
Polinucleotide (Nucleotide + Nucleotide) I nucleotidi sono uniti da un legame covalente tra il gruppo fosfato di un nucleotide ed il C3 del pentoso del nucleotide successivo. Il legame fosfato 5-3 viene chiamato legame fosfodiesterico (relativamente forte). La struttura ripetuta zucchero-fosfato zucchero-fosfato costituisce l ossatura del DNA.
Quale è la struttura di questa molecola? Numerosi dati sperimentali furono cruciali per la costruzione del modello della doppia elica
Chargaff idrolizzò il DNA tramite trattamento chimico quantificando le purine e le piramidine rilasciate Rosalind Franklin utilizzò la cristallografia a raggi X per studiare la struttura atomica della molecola La posizione degli atomi in una sostanza purificata può essere dedotta dal quadro di diffrazione dei raggix che la hanno attraversata
L appaiamento delle basi nel DNA una purina con una pirimidina rende perfettamente conto del diametro della doppia elica, la coppia G-C forma tre legami H, la coppia A-T due legami H.
La soluzione del problema relativo alla struttura del DNA si deve a Watson e Crick e alla tecnica di costruzione dei modelli
La molecola di DNA consiste di due catene polinucleotidiche avvolte l una intorno all altra a formare una doppia elica destrorsa; Le due catene sono antiparallele (hanno polarità opposta): un filamento è orientato in direzione 5-3 e l altro in direzione 3-5 ; Gli scheletri di zucchero fosfato si trovano all esterno della doppia elica mentre le basi sono orientate verso l asso centrale; Le basi azotate sono 4: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C), Timina (T). Le due catene sono tenute insieme dall appaiamento tra basi complementari A-T; C-G. Le basi dei filamenti opposti sono unite da legami ad idrogeno (relativamente deboli);
Istoni Proteine basiche cariche positivamente che costituiscono la componente base (80% - 90%) della cromatina. Interagiscono con il DNA carico negativamente formando il Nucleosoma La funzione degli istoni è quella di aggregare e compattare il DNA che altrimenti occuperebbe molto più spazio.
Possibili modelli di replicazione del DNA La struttura a doppia elica suggeriva come il materiale genetico potesse determinare la struttura delle proteine: la sequenza dei nucleotidi dettava la sequenza degli aminoacidi di una proteina letta in un codice detto codice genetico. La struttura del DNA del 1953 suggeriva subito un possibile meccanismo di copia del materiale genetico.
Esperimento di Meselson e Stahl (1958) Venne fatto crescere E. Coli su di un terreno di coltura minimo in cui la sola fonte di N era 15N (isotopo pesante) invece del normale 14N (isotopo leggero).
Esiti previsti secondo i tre modelli replicativi proposti
Modello di replicazione di tipo semiconservativo Le due eliche si separano e ciascuna funge da stampo per la sintesi di un elica complementare in cui siano rispettate le regole di appaiamento di basi complementari.
Le posizioni in cui il DNA comincia ad aprirsi si chiamano origini di replicazione e sono ricche in A-T. Il processo replicativo viene innescato da proteine iniziatrici che si legano al DNA e distanziano le catene rompendo i legami idrogeno. Quella che si forma viene chiamata forca o forcella replicativa.
Al microscopio elettronico si possono vedere le molecole di DNA mentre si replicano e distinguere delle biforcazioni a Y dette forcelle di replicazione
Formazione della Bolla di Replicazione 1. La girasi (un tipo di Topoisomerasi) taglia il DNA superavvolto che si rilassa e si distende cosicché le proteine iniziatrici possano legarsi al DNA nella zona di Origine della replicazione; 2. La DNA elicasi si lega alle proteine iniziatrici e, tale complesso, denatura il filamento utilizzando l energia derivata dall idrolisi dell ATP; 3. L idrolisi dell ATP determina un cambiamento nella struttura dell elicasi la quale può scorrere lungo il filamento stesso procedendo in direzione 5 -> 3.
Formazione della Bolla di Replicazione 4. La DNA primasi (una forma di RNA polimerasi) si lega all elicasi formando un complesso chiamato Primosoma. 5. L Elicasi attiva la DNA primasi e fa si che essa sintetizzi un RNA primer; La DNA polimerasi comincia a sintetizzare il nuovo filamento partendo proprio dal primer.
DNA polimerasi Uno degli enzimi più importanti coinvolti nella replicazione del DNA. Tutte le DNA polimerasi note sintetizzano il neofilmaneto in direzione 5 > 3, hanno bisogno di un primer per cominciare la sintesi del nuovo filamento e, solo alcune, hanno la funzione di proof reading (hanno cioè attività esonucleasica).
Sintesi del nuovo filamento Questo enzima catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico fra il gruppo 3 -OH del desossiribosio dell ultimo nucleotide ed il fosfato in 5 del dntp (generico desossinucleotide trifosfato).
Il meccanismo di polimerizzazione 5 -> 3 pone un problema alla forcella replicativa: i due filamenti di DNA neoformati hanno polarità opposte.
Elica lagging: filamento ritardato che è sintetizzata in modo discontinuo nella direzione opposta a quella della forcella replicativa Elica leading: filamento anticipato che è sintetizzato in modo continuo nella stessa direzione della forcella replicativa
Frammenti di Okazaki Il replisoma (un grosso complesso proteico che coordina tutte le attività in atto nella forcella di replicazione) si stacca ogni qualvolta incontrerà l estremità 5 del frammento di Okazaki neosintetizzato e si riattacca più avanti in 3 nella sequenza aminoacidica formando così tanti frammenti di elica lagging prodotti dal complesso replicato in modo discontinuo. Alla fine, tutti i vsari frammenti di Okazaki verrano messi insieme grazie alla DNA Ligasi ed i due filamenti si riappaieranno.