Università degli Studi di Ferrara Dipartimento di Scienze Mediche Sezione di Medicina di Sanità Pubblica UOL di Medicina Legale e delle Assicurazioni Laboratorio di Tossicologia Forense «LAVORO E USO DI SOSTANZE PSICOTROPE: RISCHI SUL LAVORO E DANNI ALLA SALUTE» 23 maggio 2014 Aspetti medico-legali del monitoraggio dell uso di alcool: esami ematologici di Laboratorio per la rilevazione dell uso/abuso di alcool
INDICE Caratteristiche chimico-fisiche Cinetica Effetti sull organismo Tecniche di rilevazione:
Caratteristiche chimico-fisiche L alcool etilico assoluto è un liquido incolore e limpido Formula CH 3 CH 2 OH; Peso Molecolare 46,07 Da Punto di ebollizione 78,3 C; densità 0,79 g/cm 3
Cinetica L intossicazione acuta avviene prevalentemente per via orale: l alcool viene assorbito molto rapidamente a livello dell intestino tenue; la sua velocità di assorbimento dipende dalla quantità assunta, dalla presenza di alimenti, dall eccitabilità emotiva, l ansia.
Curva di Widmark
La velocità di assorbimento non è costante, di conseguenza la pendenza della curva in salita può assumere diversi valori. Il picco ematico, viene raggiunto circa in 5-10 minuti a stomaco vuoto e in 40 minuti circa a stomaco pieno. Circa 10 minuti dopo il picco ematico la concentrazione di alcool etilico nel canale circolatorio raggiunge un equilibrio tra la concentrazione ematica e parenchimale (cervello, reni, fegato).
Dopo l assorbimento e la distribuzione il 98% dell alcool etilico viene metabolizzato nel fegato ad aldeide acetica da parte dell enzima NAD dipendente alcool deidrogenasi. Solo il 5-10 % dell aldeide acetica viene eliminata come tale, la restante parte subisce ulteriore metabolizzazione ad acetaldeide (ossidazione) che entra nel ciclo di Krebs, e, se in eccesso, nella sintesi del colesterolo e degli acidi grassi. La velocità di smaltimento dipende essenzialmente dal metabolismo del fegato; in media la velocità di smaltimento è di circa 7 grammi/h; di conseguenza l alcolemia diminuisce di 0,15 g/l per ora (da 0,11 a 0,24 g/l/ora).
Effetti sull organismo 0.2 g/l Socievolezza, espansività 0.5 g/l (limite legale per la guida) Diminuzione freni inibitori (azione su corteccia cerebrale) 0.8-1.2 g/l Azione depressiva sui centri motori Perdita autocontrollo Disturbi dell equilibrio 1.5 g/l - 2.5 g/l Ubriachezza Atassia Agrafia 2.5 g/l 4.0 g/l Irascibilità Nausea Vomito Perdita tono muscolare Stato soporoso e comatoso >4.0 g/l Collasso periferico e morte per paralisi dei centri respiratori
DETERMINAZIONE DELL ALCOOL ETILICO Metodo di Widmark Metodo di Winnick Metodo enzimatico Metodo gascromatografico
Metodo di Widmark Si pone il sangue in cestello posto all interno di una beuta chiusa. A 45 C si fa evaporare l alcool che si fa reagire con la soluzione di bicromato di potassio a titolo noto posta sul fondo della beuta. La quantità di bicromato reagita si determina per titolazione con tiosolfato La reazione alla base del metodo è la seguente ossidoriduzione: CH 3 CH 2 OH + 2 K 2 Cr 2 O 7 + 8 H 2 SO 4 3 CH 3 COOH + 2 Cr 2 (SO4) 3 + 2 K 2 SO 4 + 11 H 2 0 Vantaggi: economica e quantitativa Svantaggi: non specifica per l alcool etilico
Metodo di Winnick equivalente al metodo di Widmark a differenza che si utilizza la cella di Conway al posto della beuta di Widmark. Presenta gli stessi vantaggi e svantaggi del metodo di Widmark.
Metodo enzimatico Si basa sulla misura spettrofotometrica a 340 nm del NADH prodotto dalla seguente reazione: CH 3 CH 2 OH + NAD CH 3 CHO + NADH La reazione avviene in presenza dell enzima alcool deidrogenasi (ADH). L enzima ADH trasforma l alcool etilico in acetaldeide. Questa reazione andrebbe all equilibrio in condizioni normali, ma la presenza di semicarbazide permette di sequestrare l acetaldeide e la reazione arriva a completezza. La misura spettrofotometrica del NADH fornisce il dato quantitativo relativo all etanolo (rapporto 1:1) Vantaggi: facile, rapida, quantitativa Svantaggi: non specifica, elevato rischio di cross-reaction, inoltre deve essere effettuato sul SIERO
Metodo gascromatografico con campionamento dello spazio di testa (GC-HS) E la tecnica di elezione per la determinazione dell alcool etilico nel sangue, in quanto, essendo una tecnica separativa permette una misura diretta dell analita. La gascromatografia è una tecnica analitica che si basa sulla ripartizione degli analiti tra una fase stazionaria e una fase mobile gassosa (He, N 2, H 2 ), in base all affinità degli stessi analiti per l una o l altra fase.
Introduzione del campione Campionatore dello spazio di testa Permette di sfruttare la volatilità di alcune sostanze, come gli alcoli. Consiste nell inserire i vial perfettamente sigillati contenenti i campioni da analizzare in un carosello termostatato (intorno ai 60-70 C) per un certo tempo. Durante questo periodo le sostanze volatili come gli alcoli passano dalla fase liquida (ematica) alla fase gassosa: al termine del tempo prestabilito un sistema automatizzato trasferisce la fase gassosa del campione nel gascromatografo.
Iniettore
L iniettore è la «porta di ingresso» del gascromatografo, in quanto permette al campione di raggiungere la colonna e successivamente il detector. E collegato quindi a monte col sistema automatizzato di iniezione e con il gas di trasporto e a valle con il forno del gascromatografo. L iniettore è inoltre termoriscaldato in quanto il campione che raggiunge la colonna deve trovarsi in fase gassosa.
Forno colonne
Forno Il forno del gascromatografo al cui interno è contenuta la colonna è termoprogrammabile, e permette, per le analisi più elementari, di lavorare in condizioni di isotermia (temperatura costante). E tuttavia possibile lavorare anche con le cosidette rampe programmate, ovvero aumentando la temperatura di un certo numero di gradi al minuto. La rampa programmata viene utilizzata in genere per eluire sostanze appartanenti a classi diverse, e che hanno quindi, diverso comportamento gascromatografico.
Colonne Le colonne impaccate sono le più antiche e sono costituite da una serpentina in vetro (lunga al massimo una decina di metri e larga un centimetro circa) contenente al suo interno la fase stazionaria (in genere gel di silice, allumina o carbone) e un liquido non volatile di supporto (oli, grassi, carbowax etc). La scelta del liquido viene effettuata in base ai composti che si deve separare. Le colonne impaccate stanno lasciando il passo alle colonne capillari, che sono sottilissimi tubi cavi di silice fusa (diametro massimo 1,5 mm e lunghi fino a 60 metri) al cui interno è posizionata come un film la fase stazionaria; il film è in genere costituito da metil-silossani (siliconi) sui quali sono presenti gruppi funzionali diversi in base alle sostanze da ricercare.
Detector Il detector più utilizzato per la gascromatografia è il Detector a Ionizzazione di Fiamma (FID). L idrogeno e l aria accendono e mantengono accesa la fiamma. La colonna arriva alla base della fiamma e gli analiti separati durante la fase cromatografica raggiungono il detector con i loro tempi di ritenzione (ovvero il tempo che l analita impiega dal momento dell iniezione al momento dell arrivo al detector): qui vengono pirolizzati dalla fiamma in cationi. Quando i cationi raggiungono l elettrodo negativo quest ultimo cede gli elettroni mancanti: la cessione degli elettroni provoca una differenza di potenziale nel campo elettrico che viene tradotta in un picco gascromatografico dall elaboratore.
Analisi GC-HS dell alcool etilico A 0,5 ml di sangue intero si addizionano 2 ml di alcool isopropilico 0,125 g/l (internal standard) e 1 grammo di NaCl Si tappa il vial con la pinza crimpatrice Incubazione per 25 minuti a 75 C Iniezione di 1 ml di vapore nel sistema gascromatografico
Curva di taratura Curva di taratura ai seguenti punti utilizzando materiali di riferimento certificati (MRC): 0,3 g/l 0,5 g/l 0,8 g/l 1,00 g/l 1,50 g/l 2,00 g/l 3,00 g/l
Analisi con Standard Interno Si addiziona ad ogni campione da analizzare e ai campioni a concentrazione nota (MRC). Deve presentare caratteristiche chimico-fisiche simili all analita da ricercare ma allo stesso tempo deve essere sufficientemente distinto cromatograficamente Alcool iso-propilico (IPA): Peso Molecolare 60,10 Da, densità 0,79 g/cm 3 ; Temperatura di ebollizione 82 C
Esempio di ricalcolo
Vantaggi Analisi qualitativa e quantitativa Specifica per l alcool etilico Permette nei casi di intossicazione acuta aspecifica anche l eventuale presenza di alcool metilico Eseguibile su sangue intero e su tutte le matrici biologiche umane
Svantaggi Strumentazione relativamente costosa (>15 000 Euro) Personale specializzato Tempistica di analisi > immunoenzimatico
Applicazioni Intossicazioni acute (tossicologia clinica d urgenza) Violazioni art. 186 Codice della Strada (guida sotto l influenza dell alcool) Avvelenamenti letali (indagini postmortem)
Consumo cronico di alcool etilico L alcool etilico viene eliminato velocemente dall organismo Nell urina (matrice di accumulo) permane per al massimo 24 ore
Perché? Revisione patente di guida a seguito di violazione art. 186 cds Valutazione lavoratori con mansioni a rischio Recupero sociale (SerT)
Marker di abuso alcolico Enzimi epatici Trasnferina Carboidrato Carente (CdT) Etilglucuronide (EtG)
Enzimi Epatici GLI ENZIMI DEL FEGATO: LE TRANSAMINASI Gli enzimi catalizzano (cioè accelerano) la velocità delle migliaia di reazioni chimiche che, nell'insieme, formano il metabolismo delle cellule...in altre parole, gli enzimi sono dei biocatalizzatori, cioè hanno la proprietà di accelerare la velocità delle reazioni chimiche senza apparire fra i prodotti della reazione alla fine della reazione e possono essere nuovamente utilizzati, cioè non vengono consumati.
Transaminasi Quando lavorano in condizioni di sforzo massimo, come un'automobile che viaggia sempre a tutto gas, le cellule del fegato possono andare in tilt per il troppo lavoro. Tale sovraccarico si traduce, a lungo andare, in una degenerazione cellulare che causa prima l'infiammazione e poi la morte degli epatociti.
Le transaminasi sono enzimi che intervengono nella transamminazione, cioè partecipano alla trasformazione degli aminoacidi in energia, soprattutto se ci si trova di fronte ad uno sforzo fisico lungo ed impegnativo. Esse si trovano in ogni distretto del nostro organismo ma sono particolarmente abbondanti nel fegato e nel muscolo scheletrico striato (quello che si contrae secondo la nostra volontà). Quando le cellule epatiche (epatociti) o quelle dei muscoli (miociti) sono danneggiate e si rompono, le transaminasi fuoriescono e si riversano nel sangue aumentando la loro concentrazione.
Le transaminasi sono: la glutammico-ossalacetica (GOTo AST, aspartato-aminotransferasi, presente in muscoli e miocardio) la glutammicopiruvica (GPT o ALT, alaninaaminotransferasi, presente nelle cellule epatiche); esistono però anche altri enzimi analoghi alle transaminasi e sono tutti indici di grave necrosi epatocellulare, oltre che di altri organi. VAL RIFERIMENT TRIG O L 40-170 GGT 12-70 9-38 AST 10-37 10-31 ALT 10-43 5-36 Questi sono la lattico deidrogenasi (LDH) la gamma-glutamil-transpeptidasi (Gamma-Gt) la fosfatasi alcalina (FA) l'ornitil-carbamil-transferasi (OCT) l'aldolasi.
Cause d'innalzamento delle transaminasi Cause epatiche : alcol, cirrosi, epatite cronica B e C, steatosi/steatoepatite (accumulo di lipidi negli epatociti), farmaci/tossici Cause più rare : epatite autoimmune, emocromatosi Cause non epatiche: celiachia, emolisi, miopatie, ipertiroidismo, esercizio fisico intenso
SPECIFICITA DIAGNOSTICA: VERI NEGATIVI (VERI NEGATIVI + FALSI POSITIVI) SENSIBILITA DIAGNOSTICA: VERI POSITIVI (VERI POSITIVI + FALSI NEGATIVI) TIPO SENSIBILITA SPECIFICITA AST/ALT ~15% Abuso alto rischio ~ 50% Dipendenza ~70-90% GGT ~ 50% Abuso alto rischio ~ 75% Dipendenza ~ 70%
TRANSFERRINA
CDT: Transferrina Carboidrato Carente Una singola catena polipeptidica Due siti indipendenti che legano il ferro metallico Due catene complesse di N- glicani Molecole di acido sialico
Aumento della CdT: L esatto meccanismo mediante il quale il consumo eccessivo di alcool etilico determini l aumento delle glicoforme carboidrato-carenti non è ancora completamente compreso: Si tratta di un processo complesso che coinvolge il trasporto intracellulare di proteine l attività enzimatica della glicosilazione la sintesi della catena proteica
Tecniche per la determinazione della CdT: Elettroforesi capillare (CE) Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC)
Elettroforesi Capillare Pochi microlitri di campione Un sistema di 7 capillari in linea Sistema di complessazione (con soluzione saturante compreso nel kit analitico) e iniezione Rilevazione automatica Identificazione delle isoforme, automatica Calcolo CDT automatico
ELETTROFEROGRAMMA
Etilglucuronide Il 2% dell alcool etilico presente nell organismo segue questa via di metabolizzazione E un marcatore specifico (in quanto metabolita diretto) e sensibile (permane per molto tempo in diversi distretti dell organismo)
Matrici biologiche Urina: permane fino a 80 ore (controllo a BREVE TERMINE) Capelli: permane per tutta la lunghezza dei capelli (Controllo a LUNGO TERMINE)
EtG urina La ricerca di EtG nel campione urinario permette di valutare l eventuale assunzione di alcool etilico negli 2-3 giorni. Il risultato che si ottiene è sempre riferito ad un valore soglia (detto CUT-OFF), in quanto il consumo di alcool etilico non è vietato nel territorio italiano Si deve quindi discriminare tra consumo moderato e abuso
Vantaggi Analisi di screening immunochimico molto veloce Permette di effettuare test «a sorpresa» Non invasivo
Svantaggi Finestra temporale molto breve Difficile correlare il risultato analitico con la quantità di alcool etilico assunta----->difficoltà nell individuare un cut-off universale Il test immunochimico deve comunque essere confermato in GC-MS o LC-MS-MS.
EtG nei capelli l EtG è rilevabile nella matrice cheratinica L accumulo di EtG nei capelli è dose-dipendente, quindi è più facile trovare un valore di cut-off universale L analisi di una certa quantità di capelli può permettere di valutare il consumo di alcool etilico di mesi
Come si analizzano i capelli?
I risultati si esprimono in ng/mg o pg/mg Cut-off per EtG nei capelli A) 30 pg/mg (0,03 ng/mg) per differenziare consumo moderato da abuso B) 4 pg/mg (0,004 ng/mg) per valutare la completa astinenza
Concentrazione di EtG < 4 pg/mg è compatibile con un consumo di alcool etilico inferiore a 30 g/die Concentrazione di EtG compresa tra 4 e 30 pg/mg è compatibile con un consumo di alcool etilico tra i 30 e i 60 g/die Concentrazione di EtG superiore ai 30 pg/mg è compatibile con un consumo superiore a 60 g/die
Strumentazione GC-MS-MS gascromatografiaspettrometria di massa tandem LC-MS-MS (tecnica di elezione) cromatografia liquida ad alta pressione-spettrometria di massa tandem
Capillarys 2 ditta Sebia Sistema Immunochimico Viva Twin ditta Siemens
Grazie per la cortese attenzione