Il più piccolo oggetto che l occhio umano può percepire è quello che interessa almeno 10 cellule sensoriali, però se avviciniamo l oggetto all occhio questo interesserà più cellule e quindi apparirà più grande (dimensioni reali, dimensioni apparenti). Ad occhio nudo non possiamo diminuire illimitatamente la distanza tra l oggetto e l occhio perché a partire da una distanza minima il cristallino non riesce più a mettere a fuoco (250mm). Se vogliamo aumentare l angolo che sottende l oggetto e vederlo ingrandito a maggiori dettagli dobbiamo mettere una lente tra l oggetto e l occhio. La lente trasmette un immagine ingrandita su un piano che possiamo comodamente osservare. Microscopio semplice: formato da una sola lente (obiettivo) Microscopio composto: formato da almeno 2 lenti oltre alla prima detta obiettivo, si usa una seconda lente detta oculare che prende l immagine proiettata dalla prima per ingrandirla ulteriormente.
Microscopia: osservazioni superiori a 30 ingrandimenti STEREOMICROSCOPI Campioni non preparati Generalmente non piatti Effetto 3D Ingrandimenti fino a 200x Alta distanza di lavoro Profondità di fuoco elevata Ampio campo visivo MICROSCOPI OTTICI Ingrandimenti fino a 1500x Elevata correzione ottica Elevata risoluzione Elevata qualità dell immagine Tecniche di osservazione particolari (interferenziale)
STEREOMICROSCOPI MICROSCOPI OTTICI
Lo stereomicroscopio Uno stereomicroscopio trasferisce un immagine profonda di oggetti a tre dimensioni Come nell osservazione comune, ognuno dei due occhi vede l oggetto da una direzione diversa rispetto all altro Il cervello elabora le due immagini e le unisce in una sola immagine stereoscopica
Componenti di uno stereomicroscopio Oculare Tubo binoculare Corpo ottico Supporto Obiettivo Colonna e sistema di messa a fuoco Base
Il microscopio Il microscopio trasferisce un immagine ad alto ingrandimento e ad alta risoluzione Il percorso ottico è singolo e viene sdoppiato solo per rendere più ergonomica la visione Il cervello elabora le due immagini e le unisce in una sola immagine non stereoscopica
Sistema di acquisizione immagini Tubo fotografico Osservatore Stativo Campione Obiettivo Diaframma di apertura Condensatore Specchio Diaframma di campo Filtri
Tecniche di osservazione Campo chiaro Campo oscuro Contrasto di fase Contrasto interferenziale Osservazioni in Luce polarizzata POL Fluorescenza
Il Campo Chiaro La luce passa direttamente attraverso l obiettivo Difrazione, rifrazione e assorbimento della luce formano l immagine microscopica Luminosità, Risoluzione, Contrasto e Profondità di Campo sono i parametri che determinano la qualità dell immagine
Campo Oscuro Con la microscopia in campo oscuro si osservano campioni non visibili in campo chiaro, sia perché trasparenti o perché al di sotto del potere di risoluzione del microscopio. La luce non arriva perpendicolarmente all obiettivo ma viene difratta da un anello che si trova nel condensatore Solo la luce difratta è utilizzata per la formazione dell immagine.
Campo Oscuro Effetti della ossidazione su metallo
Contrasto di Fase La microscopia in Contrasto di Fase consente di osservare oggetti viventi, cellule o tessuti molto sottili oggetti trasparenti e non colorati
Contrasto Interferenziale La microscopia in Contrasto Interferenziale o Nomarski (DIC) viene utilizzato per l osservazione di organismi vivi, oggetti molto sottili non colorati e con minime differenze di indice di rifrazione rispetto al mezzo o tra le loro parti Larva di Riccio di mare Micromanipolazione
Polarizzazione Polarizzazione lineare della luce Birifrangenza Componenti per il contrasto pol Immagini ed esempi
LUCE POLARIZZATA: Fibre Tessili
IMMAGINI PRESE CON I VARI METODI DI CONTRASTO Campo chiaro ICR Campo scuro Luce polarizzata
Campo chiaro METODI DI CONTRASTO Fibre Tessili Luce polarizzata con lamina lambda Luce polarizzata
Potere di Risoluzione Il Potere di Risoluzione è la possibilità di distinguere distintamente 2 punti molto vicini
SEM (Microscopia Elettronica a Scansione) Potente tecnica per l osservazione e la caratterizzazione di superficie di materiali organici ed inorganici eterogenei. Storicamente il SEM è nato come tecnica a sé stante mentre in seguito è stato combinato con l EPA (Electron Probe Analyzer) in un unica apparecchiatura permettendo di ottenere contemporaneamente informazioni topografiche e composizionali della stessa area del polimero strumento sofisticato, ma relativamente semplice da usare l interpretazione dei risultati può essere abbastanza semplice Limitazioni all uso sui polimeri: i polimeri sono in genere cattivi conduttori gli elettroni accelerati possono danneggiare il campione
Gli elettroni vengono in genere generati per emissione termoionica da un filamento di W, ripiegato a V, dalla zona in prossimità della punta. e - convergono nella regione cross over Anodo forato accelera e - (tensione 0-50 kv) Sistema di lenti elettromagnetiche Diaframma finale definisce l apertura del fascio sul campione
Il SEM viene usato sempre in condizioni di vuoto dell ordine di 10-4 mbar con una pompa meccanica più una turbomolecolare Perché? In un ambiente con aria il fascio sarebbe instabile I gas potrebbe reagire con la sorgente causandone la combustione I gas potrebbero ionizzarsi causando scariche Si potrebbero formare composti tra le molecole dell atmosfera e quelle del campione
e - incidenti Fotoni Raggi X e - retrodiffusi (E tra 50 ev e E incidente) e - secondari (E tra 0 e 50 ev) e - Auger e - assorbiti Conducibilità indotta e - trasmessi
e - incidenti Superficie campione 5-50 nm e - secondari 1-2 µm e - retrodiffusi 1 nm e - Auger 2-5 µm raggi X caratteristici raggi X del continuo raggi X di fluorescenza
Composizionale CONTRASTO Composizionale:le rese in elettroni secondari ed elettroni retrodiffusi aumentano all aumentare del numero atomico, ma l effetto è apprezzabile solo se le regioni a diversa composizione hanno confini c netti Topografico: è il più importante visto che la maggior parte delle applicazioni SEM sono volte allo studio della forma dei campioni.. Trae origine dal fatto che il numero e le traiettorie degli e - secondari ed e - retrodiffusi dipende dall angolo tra il fascio e la superficie del campione. Mappa X-rays: Se lo strumento dispone di un detector per raggi X, il segnale caratteristico di un particolare elemento può essere mostrato sullo schermo contemporaneamente alla scansione.
RISOLUZIONE la risoluzione è limitata dalle dimensioni del fascio e quindi dall ottica dello strumento, ma dipende anche da ciò che accade agli elettroni dopo l impatto con il campione dimensioni medie del fascio: 5-105 nm la massima risoluzione sarà maggiore
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Dimensioni variabili, tipicamente ca. 10mm Per i materiali non conduttori (polimeri) è indispensabile ricoprire il campione con uno strato sottile di un conduttore METALLIZZAZIONE: Au, ca. 25 nm (alta resa SEI) lega Au-Pd Al C, strato sottile (bassa resa SEI, indicato per X-rays) analisi di fratture sezioni etching (trattamenti fisici, solventi o miscele di solventi p.es. HMnO 4, HNO 3 )
ARTEFATTI oggetti estranei inglobati accidentalmente modificazioni intervenute durante la preparazione del campione o durante l analisi Decomposizione Aumento di temperatura Scissioni di catena
CONDIZIONI OPERATIVE per l uso su polimeri Potenziale: Corrente un potenziale più elevato garantisce una migliore risoluzione, ma aumenta il rischio di artefatti e il campione si carica in misura maggiore Corrente: un elevata corrente aumenta la produzione di artefatti ed acuisce il problema della carica, ma la corrente minima è determinata dall esigenza di mantenere un buon rapporto segnale-rumore e dipende quindi dalle prestazioni del detector Ingrandimento Ingrandimento: ad ingrandimenti elevati aumenta l intensità di corrente per unità di area, aumentando quindi il rischio di danneggiare il campione
UHMWPE caricato con sferette di vetro
Adesione di macrofagi su film di poletilene
Fibre di poli(vinilalcol vinilalcol)
Retine in polipropilene per il sostentamento della parete addominale nuova espiantata 14 mesi
Retine in poli(etilentereftalato) per il sostentamento della parete addominale nuova espiantata 50 mesi