Analisi avanzata del materiale seminale ASMA system (Automated sperm morphometry analysis system) Microscopio a contrasto di fase con obiettivo 100X Videocamere Computer per digitalizzare le immagini Valori misurati sono 13 Per la taglia dell acrosoma: Altezza (L,in µm) Larghezza (W, in µm) Area (A, in µm2) Perimetro (P, in µm) Per la forma dell acrosoma: Ellitticità = (L/W) Rugosità = (4πA/P2) Allungamento = ((L-W)/(L+W)) Regolarità = (πlw/4a) 1
Per il tratto intermedio: Larghezza (w, in µm) Area (a, in µm) Distanza (d, in µm) (tra l asse dello spermatozoo e l ipotetico asse verticale dello stesso) Angolo ( ) (divergenza tra asse dello spermatozoo e ipotetico asse verticale dello stesso) Incompatibilità con alcune colorazioni: Papanicolau Tripan blue Giemsa Compatibilità con alcune colorazioni: Diff-Quik Hemacolor Harri s Haematoxilin precisa analisi degli spermatozoi 2
Percentuale di corrette valutazioni di spermatozoi (n=2420) effettuate su materiale seminale appartenente a 6 stalloni differenti con 3 diverse metodiche di colorazione CV= coefficiente di variazione (%) La citofluorimetria a flusso Vantaggi Valutazione di molte cellule Analisi quantitativa Indagini multiparametriche Svantaggi Costi Non di facile utilizzo 24 Novembre 2012 Teramo, Facoltà di Medicina Veterinaria 3
Principi di citofluorimetria a flusso 24 Novembre 2012 Teramo, Facoltà di Medicina Veterinaria 4
Integrità della membrana citoplasmatica Colorazione classica (eosina/nigrosina) Colorazioni in fluorescenza CFDA; SYBR-14 PI; Hoechst 33258; etidio omodimero; Calcein AM, YO-PRO 1 Integrità dell acrosoma Valutazione dell integrità della membrana acrosomiale Impiego di agglutinine FITC coniugate FITC-PSA lega α-mannosio e α-galattosio della matrice FITC-PNA lega il β-galattosio della membrana acrosomiale esterna 5
Potenziale mitocondriale Stima della capacità ossidativa dei mitocondri Rodamina 123 Mitotracker accumulo nei mitocondri attivi JC-1 Potenziale mitocondriale JC-1 Incorporato da tutti i mitocondri attivi Metabolizzato diventa verde Accumulato vira verso l arancio 6
Testsper la valutazione del DNA nemaspermatico Comet test Spermatozoi su gel di agarosio fatti migrare per elettroforesi Formazione di una cometa fluorescente Maggiore è il danno del DNA, maggiore intensità ed alone Testsper la valutazione del DNA nemaspermatico TUNEL assay Valuta l incorporazione di deossiuridina trifosfato nel DNA Sonda marcata, individua discontinuità nel DNA 7
Testsper la valutazione del DNA nemaspermatico Test arancio di acridina Colorante fluorescente metacromatico Emette in maniera diversa se si lega a DNA doppia elica(verde) a singola elica (rosso-arancio) Testsper la valutazione del DNA nemaspermatico Sperm chromatin structure assay (SCSA) Correlato con la fertilità (uomo) resistenza alla denaturazione del DNA impiego di un citofluorimetro 8
Testsper la valutazione del DNA nemaspermatico Sperm chromatin structure assay (SCSA) Campione denaturato con acido e permeabilizzato Colorazione con arancio di acridina Lettura con il citofluorimetro calcolo di indice di frammentazione rapporto fluorescenza DNA denaturato rispetto alla totale I test di laboratorio sono accurati nella valutazione delle caratteristiche del materiale seminale? Procedura essenziale per oggettivizzazione e comparazione Parametri usuali non predittivi della fertilità Spesso non identificano soggetti subfertili 9
Mancanza di correlazione fra test classici e recenti rispetto Fertilizzazione in-vivo Fertilizzazione in-vitro Mancanza di correlazione evidenziata in numerose specie Differenti condizioni ambientali Microclima epididimale Eiaculazione Ambiente vaginale/uterino Legame con regioni della giunzione U.T. Capacitazione Interazione con zona e oocita 10
Fattori di variabilità individuale a livello cellulare Regolazione del volume cellulare Legame con l epitelio oviduttale Capacità di fertilizzare (capacitazione) Regolazione del volume cellulare In condizioni di iperosmosi o ipoosmosi Capacità di perdere o acquisire liquidi Capacità acquisita a livello epididimale 11
Regolazione del volume cellulare Fisiologicamente eiaculazione (da iperosmosi a isosmosi) Tecnologicamente crioconservazione shock ipertonico al congelamento shock ipotonico allo scongelamento Regolazione del volume cellulare Meccanismo che prevede la perdita di elettroliti Effetto legato alla fosforilazione/defosforilazione delle protein kinasi Adattamento del citoscheletro 12
Test per valutare la regolazione del volume Hypoosmotic swelling test per valutare la funzionalità della membrana ambiente ipotonico determina curvatura/arricciamento degli spz 13
Test per valutare la regolazione del volume Hypoosmotic swelling test limiti soggettivo non individua gli spz che esplodono Test per valutare la regolazione del volume Osmotic challange Impiego di un contatore elettronico Volume cellulare determinato come resistenza elettrica al passaggio degli spz in un capillare 14
Test per valutare la regolazione del volume Osmotic challange Determina il volumetrico come V ipotonico V isotonico 15
Interazione con l ovidutto Spesso deposizione relativamente lontana dall ovulazione epitelio sequestra gli spermatozoi adesione e rilascio controllato significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza 16
Interazione con l ovidutto Individuato il legame carboidratorecettore Importante la normale architettura dello spermatozoo Non ancora sviluppato un test in-vitro Capacitazione Cascata di modificazioni metaboliche e strutturali Rendono lo spermatozoo in grado di fertilizzare Difficoltà nello studio in-vivo 17
Capacitazione Condizioni ambientali tipiche: elevata concentrazione di bicarbonato elevata concentrazione di CO2 influenza di fattori ovulatori Capacitazione Valutazione Clortetraciclina (calcio) Merocianina 540 Annessina V 18