FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO

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1 FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO Monica Muratori Sezione di Medicina della Sessualità e Andrologia, Università di Firenze Il manuale WHO 2010 per l esame del liquido seminale: luci e ombre Bologna 29 Gennaio 2011

2 FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEGLI SPERMATOZOI Presenza di tagli a singola e doppia elica nel DNA degli spermatozoi E un anomalia genomica frequentemente rinvenuta nei pazienti sub e infertili (Gorczyca et al, 1993) Ha un origine probabilmente multifattoriale: - apoptosi abortiva (nucleasi apoptotiche) - stress ossidativo (ROS) - difetti nella maturazione cromatinica (topoisomerasi)

3 I livelli di frammentazione nel seme predicono gli esiti della riproduzione? Determinare la frammentazione del DNA nel seme fornisce maggiori informazioni sullo stato di fertilità maschile rispetto a quelle ottenute con lo spermiogramma?

4 Spermiogramma Limiti di predittività clinica Necessità di nuovi parametri La frammentazione del DNA si propone come candidato a nuovo parametro predittivo della fertilità maschile

5 FRAMMENTAZIONE DEL DNA E QUALITA DEL SEME Sperm DNA Fragmentation Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Muratori et al, 2000

6 FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE Studi sull animale: netto impatto negativo della frammentazione sugli indici riproduttivi e salute della progenie (Fatehi et al, 2006; Fernandez Gonzalez et al, 2009). Soggetti infertili hanno maggiori livelli di frammentazione del DNA rispetto a soggetti fertili (Sergerie et al, 2005; Evenson et al, 1999) impatto sul rate di fertilizzazione (Tarozzi et al, 2007): IVF: discusso ICSI: inesistente Controversa è l associazione con: lo sviluppo embrionale, l impianto, il tasso di gravidanza (Zini and Sigman 2009, Zini 2010)

7 FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE Invece c è un buon accordo nel ritenere che aumentati livelli di danno al DNA spermatico causino un aumento degli aborti (Zini et al, 2008)

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10 SCSA TUNEL LE TECNICHE Sperm Chromatin Structure Assay ISNT (TdT)-mediated fluorescein-dutp nick end labeling COMET In Situ Nick Translation Single Cell Gel Electrophoresis assay AO Test Acridine Orange Test SCD test (Halosperm) Sperm Chromatin Dispersion Test Rivelano lo stesso tipo di danno? I dati sono confrontabili?

11 TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase mediated fluorescein dutp nick end labeling - Microscopia a fluorescenza e Citofluorimetria - Risultati come percentuale di cellule frammentate DNA Fragmentation

12 SCSA Sperm Chromatin Structure Assay - Citofluorimetria - Risultati come percentuale di cellule frammentate Arancio di Acridina Fluorescenza verde = DNA nativo Fluorescenza rossa = DNA denaturato DFI DFI= DNA denaturato DNA totale

13 COMET o SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis Inclusione degli spermatozoi in gel di agarosio, lisi ed elettroforesi in elevate concentrazioni saline Microscopia a fluorescenza Elevata sensibilità (50 single-strand breaks per cell) Percentuale di cellule danneggiate e misura del danno/cellula Cellula frammentata Cellula non frammentata

14 STEPS TUNEL Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. Mancanza Fresh 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; di standardizzazione delle procedure SAMPLE FIXATION PERMEABILIZATION with detergents LABELLING VARIANTS Frozen At -20 C, -70 C, -80 C Cryopreserved With or without cryoprotectant Alcohols EtOH, MeOH, MeOH-EtOH Formaldeyde At 1; 2; 3.5; 3.7% Absent Present 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at different times Direct labeling Many commercial kits Indirect labeling Many commercial kits REFERENCES Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; Long et al. 2007; O'Flaherty et al Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al Muciaccia et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al Martin et al. 2005; O'Flaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; Muratori et al. 2008a and 2009; Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; Avendaño et al. 2009a and 2009b O'Flaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. 2005; Zini et al DETECTION FLOW CYTOMETRY DATA ANALYSIS Fluorescence microscopy Flow cytometry Threshold setting method Subtraction method Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; O'Flaherty et al Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al and 2008a; Domínguez-Fandos D 2008; Zhang et al Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al Muratori et al, SBRM 2010

15 EFFETTO DELLE VARIANTI DEL TUNEL Letteratura , valori del TUNEL nel seme di soggetti subfertili 2.36±1.37%, n=29 Younglai et al, ± 23.75%, n=66 Domínguez-Fandos D et al, 2007 Effect of: PFA concentration (1% vs 3.7%) Time storage (0 vs 24 h) Parte della conflittualità della letteratura può risiedere nell eterogeneitàe nella mancanza di standardizzazione delle tecniche Labelling kit (TMR vs FITC) CV% 15.1± ± ±16.0 Intra-assay CV=4.3±1.4%, n=12 Data analysis 21.2±16.4 Muratori et al, J Androl, 2009

16 M540 Bodies:corpi apoptotici di probabile origine testicolare Colorazione May-Grunwald Giemsa Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007

17 Incidenza degli M540 Bodies nel seme di soggetti sub/infertili % M540 bodies vs spermatozoi % M540 bodies sul totale dei bodies e spermatozoi Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007 N=Normozoospermici, AT= Asthenoteratozoospermici T=Teratozoospermici, OAT=Oligoasthenoteratozoospermici

18 M540 Bodies: un interferenza nelle analisi citofluorimetriche degli spermatozoi Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007

19 Propidium Iodide, PI Bright field TUNEL/PI Controllo negativo Campione test PI Frammentazione del DNA Frammentazione del DNA Muratori et al, 2008

20 SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI Simple TUNEL underestimates Simple TUNEL overerestimates Percentuale ricavata dal semplice TUNEL meno percentuale ricavata dal TUNEL/PI Muratori et al, Hum Reprod 2008 Muratori et al, Cytometry A, 2008

21 SPERM SORTING by FACSAria PI br PI PI dim Unpublished results

22 Diversa relazione con la qualità del seme La frammentazione nella % di PI brighter % di è indipendente dalla frammentazione qualità del seme Parameters n sul totale degli spermatozoi frammentazione nella PI Dimmer PI DNA Fragmentation La frammentazione nella PI dimmer si rho p rho p associa strettamente a scarsa qualità del seme Sperm count (sperm/ejaculate) Sperm concentration (sperm/ml) Total motility Progressive motility Normal morphology Muratori et al, 2008

23 La vitalità cellulare è diversa nelle due popolazioni PI fluorescence Negative Control Test Sample Dead cells (L fluorescence)

24 Il danno nella popolazione brighter è indipendente dalla qualità del seme. E il danno della popolazione brighter a fornire informazioni addizionali/alternative sullo stato di fertilità maschile rispetto allo spermiogramma? Le cellule della popolazione dimmer sono morte Sono gli spermatozoi frammentati della brighter ad impattare negativamente sulla riproduzione?

25 CONFRONTO FRA SOGGETTI FERTILI ED INFERTILI Fertili= concepimento entro l anno dalla data del test Pazienti= afferenti al laboratorio di Seminologia per l esecuzione dello spermiogramma FRAMMENTAZIONE TOTALE unpublished data *p<0.001 PATIENTS FERTILE MEN n=29 n= FRAMMENTAZIONE BRIGHTER *p< FRAMMENTAZIONE DIMMER E il danno della popolazione brighter il parametro indipendente dalla qualità del seme che discrimina fra fertili ed infertili NS PATIENTS FERTILE MEN n=29 n=28

26 FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEI SOLI SPERMATOZOI VIVI Spermatozoi vivi frammentati Mitchell et al, 2010 Aitken et al, 2010

27 FRAMMENTAZIONE DEL DNA E DANNO OSSIDATIVO RIVELATO CON LA COMET = 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine (8-OHdG) Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase =FPG COMET Simon et al, 2010

28 FPG FRAMMENTAZIONE DEL DNA + DANNO OSSIDATIVO

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30 RINGRAZIAMENTI Dpt Fisiopatologia Clinica, sz. Medicina della Sessualità e Andrologia: Prof. Elisabetta Baldi Prof. Gianni Forti Prof. Mario Maggi Dr. Sara Marchiani Dr. Lara Tamburrino Dr. Marta Cambi Dr. Margarita Montoya Francesca Di Filippo Dr.Erminio Filimberti Dr. Selene Degl Innocenti Dpt di Ginecologia, Perinatologia e Riproduzione Umana: Prof. Ivo Noci Azienda U.S.L. 3 di Pistoia Presidio Ospedaliero di Pescia Dr. Ilaria Natali