Modelli in vitro per la predizione dei rischi da contaminazioni ambientali

Modelli in vitro per la predizione dei rischi da contaminazioni ambientali Monica Vaccari Area Tossicologia Sperimentale CTR Cancerogenesi Ambientale e Valutazione del Rischio

CONTAMINANTE AMBIENTALE STIMOLO ESTERNO NORMALI FUNZIONI BIOLOGICHE DOSE risposta adattativa CAMBIAMENTI PRECOCI DANNO MORTE

TEST DI TOSSICITA Osservazione della comparsa di effetti avversi dopo esposizione nell animale Incertezze nell estrapolazione Dalle alte dosi ai livelli ambientali Dall animale all uomo Dall esposizione sperimentale (1 composto, 1 via di esposizione) ad esposizioni aggregate (1 composto, + vie di esposizione) o cumulative (+ composti, + vie di esposizione)

Le 3R REPLACE sostituire l uso di animali con tecniche alternative o evitarne completamente l uso REDUCE ridurre al minimo il numero di animali utilizzati per ottenere le informazioni da meno animali o piu informazioni dallo stesso numero di animali REFINE affinare il modo in cui gli esperimenti sono condotti per essere certi che gli animali soffrano il meno possibile (migliore stabulazione, procedure che minimizzino le sofferenze o aumentino il benessere animale)

MODELLI IN VITRO VANTAGGI LIMITI Rapidità, economicità, riproducibilità Valutazione delle relazioni dose-risposta Identificazione dei meccanismi molecolari alla base degli effetti biologici Utilizzo come screening preliminare per nuovi materiali, miscele complesse di origine ambientale, ecc Non sono valutabili parametri fondamentali nella azione biologica del cancerogeno nell organismo in toto (metabolismo, trasporto e distribuzione, eliminazione) Possibilità di falsi positivi e falsi negativi Modelli non sempre direttamente correlabili con l organo target Non sono valutabili parametri di interesse ambientale (biodisponibilità, bioaccumulo/biomagnificazione)

TOXICITY TESTING IN THE 21 CENTURY: A VISION AND A STRATEGY US National Academy of Science report, 2007 not so-distant future in which virtually all routine toxicity testing would be conducted in human cells or cell lines in vitro by evaluating cellular responses in a suite of toxicity pathways assays using high-throughput tests dall animale a metodi in vitro basati su cellule, linee cellulari o componenti cellulari, preferibilmente di origine umana modelli che mirano alla valutazione dei processi biologici di risposta cellulari la cui significativa alterazione può portare a effetti avversi per la salute ( toxicity pathways )

pro-cancerogeno DETOSSIFICAZIONE ESCREZIONE ATTIVAZIONE METABOLICA cancerogeno DETOSSIFICAZIONE INIZIAZIONE (1-2 giorni) cellula normale PROMOZIONE (> 10 anni) PROGRESSIONE (> 1 anno) cellula iniziata cellula preneoplastica cellula tumorale

MODELLI IN VITRO DI TRASFORMAZIONE CELLULARE Test considerati come possibile alternativa ai saggi a lungo termine nell animale per la predizione del rischio cancerogeno nell uomo mimano alcune tappe del processo di cancerogenesi multifasica permettono lo studio del potenziale cancerogeno di agenti fisici e chimici sono proposti come screening di secondo livello per cancerogeni e come test di screening di elezione per cancerogeni non genotossici

MODELLI IN VITRO DI TRASFORMAZIONE CELLULARE AnnexV todirective67/548/eec Part B: Methods for the determination of toxicity

MODELLI IN VITRO DI TRASFORMAZIONE CELLULARE

MODELLI IN VITRO DI TRASFORMAZIONE CELLULARE

MODELLI IN VITRO DI TRASFORMAZIONE CELLULARE SHE BALB/c 3T3 C3H10T1/2 cellule con cariotipo normale effetti su fasi precoci della cancerogenesi cellule immortalizzate aneuploidi effetti su fasi più tardive della cancerogenesi

CELLULE BALB/c 3T3 BALB/c 3T3 A31 BALC/3T3 A31-1-1

ALTERAZIONI NEL RITMO PROLIFERATIVO ALTERAZIONI MORFOLOGICHE PERDITA DELL INIBIZIONE DA CONTATTO TUMORIGENICITÀ IN VIVO

TEST DI CITOTOSSICITA -48hr 0 48 hr 96 hr 10-12 d cancerogeno semina (250 cellule) trattamento 48 ore cambio terreno fissare colorare TEST DI TRASFORMAZIONE -48hr 0 48 hr 96 hr 28-35 d cancerogeno semina (3 x 10 4 cellule) trattamento 48 ore cambi terreno (2 v/settimana) fissare colorare FREQUENZA DI TRASFORMAZIONE

COMPOSTI SINGOLI Solventi Pesticidi Farmaci Biotossine algali AMIANTO MMF ASSOCIAZIONI BINARIE MISCELE COMPLESSE CAMPIONI AMBIENTALI RADIAZIONI IONIZZANTI

VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI CITOTOSSICI E TRASFORMANTI INDOTTI DA FIBRE CERAMICHE REFRATTARIE E FIBRE POLICRISTALLINE NEL MODELLO IN VITRO BALB/c 3T3 Gruppo Interregionale Fibre Coordinamento Tecnico Interregionale della Prevenzione nei Luoghi di Lavoro C.T.I.P.L.L. Monica Vaccari, Wolfango Horn, Paola Silingardi, Annamaria Colacci Eccellenza Cancerogenesi Ambientale, Laboratorio Meccanismi di Cancerogenesi e Anticancerogenesi, ARPA-Emilia Romagna, Sezione Provinciale di Bologna Tiziana Bacci, Orietta Sala, Giovanni Pecchini Eccellenza Amianto Polveri e Fibre, ARPA-Emilia Romagna, Sezione Provinciale di Reggio Emilia Stefania Perdichizzi, Maria Grazia Mascolo, Sandro Grilli Dipartimento di Patologia Sperimentale, Sezione Cancerologia, Università di Bologna

FIBRE POLICRISTALLINE classificate nel 2002 dalla IARC nella categoria 2B possibili cancerogeni per l uomo insieme alle FCR non incluse nella Direttiva UE 97/69/EC 2 KX 400 X

SPETTRI EDX FPC A Fibra ceramica refrattaria SEM FCR B Fibra policristallina DLG - 2ES (µm) FCR = 1.60 FPC = 2.71 n fibre/mg FCR = 0.399 x 10 6 FPC = 0.786 x 10 6

TEST DI CITOTOSSICITÀ citotossicità della fibra policristallina confronto con la tossicità indotta da FCR e crocidolite scelta delle dosi da utilizzare nel saggio di trasformazione TEST DI TRASFORMAZIONE Valutazione della potenziale cancerogenicità Comparazione degli effetti trasformanti delle fibre policristalline e delle FCR con un controllo positivo (crocidolite) RELAZIONI DOSE-RISPOSTA Stima di una curva di risposta Estrapolazione del dato per una stima quantitativa del rischio e/o identificazione di una dose soglia

EFFETTI CITOTOSSICI: confronto in base al n fibre/cm 2 % crescita 120 100 80 60 40 20 0 * * * FCR FPC CROCIDOLITE 0 5 10 15 20 fibre/cm 2 (x 10 3 ) RANKING DI POTENZA CITOTOSSICA crocidolite >> FCR > FCP

TRASFORMAZIONE: confronto in base al n fibre/cm 2 TF (x 10-4 ) 10 8 6 4 2 0 * 0 * * RCF PCF CROCIDOLITE 0 2 4 6 8 10 12 fibers/cm 2 (x 10 3 ) crocidolite >> FCR > FCP

Test di crescita in soft agar gelificazione Agar 0.5% La capacità di crescita indipendente dall ancoraggio è un marker di trasformazione neoplastica correlato alla tumorigenicità incubazione (2 settimane) sospensione cellulare + agar 0.3% colonie

MIGRAZIONE i filtri sono rivestiti con GELATINA (5 µg/filtro) INVASIONE i filtri sono rivestiti con MATRIGEL (12.5 µg/filtro) Trattamento con il composto chimico Semina in camere da chemiotassi a fondo cieco Incubazione (6 ore, 37 C, 5% CO 2 ) Fissazione e colorazione Valutazione del numero delle cellule sulla superficie inferiore del filtro (5-10 campi/filtro, ingrandimento 200x)

TEST DI VITALITA trattamento valutazione di tossicità/efficacia calcolo di GI 50 incubazione con MTT 150 crescita (% vs DMSO) 100 50 0-50 -100 0 20 40 60 80 100 24h 48h 72h 6gg solubilizzazione -150 A1260 (µm) Lettura a 540 nm

INTERFERENZA ENDOCRINA endpoint funzionali in linee cellulari rappresentative di organi target effetti sull espressione genica di molecole ad attività estrogenica e/o diossino-simile E-SCREEN ASSAY REPORTER GENE ASSAYS Real Time PCR

E-SCREEN ASSAY 3 lo stimolo estrogenico induce proliferazione in cellule ER+ 2 1 0-14 -13-12 -11-10 -9-8 ESTRADIOLO (log conc) 1.500 valutazione funzionale dell attività estrogenica di A1260 e PCB118 in cellule T47D (T-C)/(E2-C) 1.000 0.500 0.000 A1260 PCB118 DMSO E2-0.500-8.0-7.0-6.0-5.0-4.0 log conc

REAL-TIME PCR Valutazione della attivazione della pathway degli estrogeni esposizione di cellule T47D a PCB118 2^-ΔΔCt 10 8 6 4 4 h 16 h espressione di PDZK 2 0 DMSO E2 PCB 118

REAL-TIME PCR Valutazione della attivazione della pathway del recettore Ah esposizione di cellule T47D a particolato urbano 2^-ΔΔCt 500 400 300 200 100 0.198 1.000 397.093 326.288 374.806 espressione di CYP1A1 0 NT DMSO 2.4 mc 6 mc 12 mc

SVILUPPO NUOVI TEST Messa a punto di una metodica di citotossicità secondo un protocollo validato (Neutral Red Uptake) Acquisizione di un protocollo di trasformazione in vitro su cellule bersaglio umane Utilizzo del protocollo CALUX per la valutazione dell attività di interferenza endocrina