Rapporto Struttura/Funzione delle Proteine

Macromolecole Biologiche Chimica Biologica A.A. 2010-2011 Rapporto Struttura/Funzione delle Proteine

Struttura/Funzione delle Proteine Interazioni proteina-ligando come base della funzione di molte proteine - la maggior parte delle proteine possiede un attività biologica che può essere ricondotta alla capacità di formare complessi molecolari reversibili (transitori) con determinate sostanze - la sostanza che viene legata reversibilmente da una proteina viene definita ligando di quella proteina - la proteina forma un complesso con il ligando, legandolo a livello di uno specifico sito di legame

Struttura/Funzione delle Proteine Struttura 3D di un complesso enzima-substrato

Struttura/Funzione delle Proteine Interazione proteina-ligando L interazione proteina-ligando è in genere governata dal seguente equilibrio chimico: P + L PL che può essere descritto quantitativamente dalle equazioni: K a = [ PL] [ P][ L] eq K d = [ P][ L] [ PL] eq K a : costante di associazione tra P e L K d : costante di dissociazione di PL K d = 1 K a

Struttura/Funzione delle Proteine Significato della K d di un complesso binario K d = [ P][ L] [ PL] eq [ P] [ P] [ PL] Tot = + [ P] = [ P] [ PL] Tot K d = ([ P] [ ])[ ] Tot PL L [ PL] eq Frazione di saturazione θ (teta) in funzione della concentrazione di ligando libero θ = K d = ([P] Tot [L] / [PL]) - [L] K d + [L] = [L] [P] Tot / [PL] [ PL] [ P] Tot = K d [ L] [ L] + eq

Struttura/Funzione delle Proteine K d è la concentrazione di semisaturazione di L libero θ = [ PL] [ P] Tot = K d [ L] [ L] + eq Frazione di saturazione, [PL]/[P]Tot 1 0.75 0.5 0.25 Curva saturazione di una proteina (P) con il suo ligando (L) P + L PL 0 0 100 200 300 400 500 [Ligando] (μm) La frazione di saturazione (θ) di P (frazione di P complessata ) varia al variare di [L], per effetto della legge dell azione di massa Curva iperbolica (iperbole equilatera) asintoti perpendicolari

Struttura/Funzione delle Proteine K d di alcune proteine per il loro ligando più la K d è bassa, più l interazione proteina-ligando è forte

Struttura/Funzione e Regolazione nella famiglia delle globine: Mioglobina ed Emoglobina

Mioglobina ed Emoglobina La superfamiglia delle Globine - proteine che legano reversibilmente ossigeno molecolare (o diossigeno: O 2 ) - Mioglobina (Mb)e Emoglobina (Hb) sono i più importanti membri di questa famiglia di proteine tra loro omologhe (e strutturalmente simili) Mioglobina: - proteina monomerica (153 aa, capodoglio) - intracellulare (muscoli dei vertebrati) Emoglobina: - proteina tetramerica a 2 b 2 (umana) - intracellulare (eritrociti) 2 catene a 141 a.a. 2 catene b 146 a.a.

Mioglobina ed Emoglobina Ruolo di Hb e Mb nel trasporto di O 2 -ilmetabolismo aerobico richiede l apporto di O 2 ai tessuti - in organismi piccoli (fino ad alcuni millimetri) la diffusione dall esterno attraverso i tessuti è sufficiente - organismi più grandi hanno un sistema circolatorio -l O 2 ha una bassa solubilità in acqua (~10-4 M nel sangue) apposite proteine trasportatrici di ossigeno ne aumentano la solubilità nei fluidi circolanti

Mioglobina ed Emoglobina Ruolo di Hb e Mb nel trasporto di O 2 - queste proteine possono essere in soluzione (in alcuni invertebrati) o concentrate in cellule specializzate (eritrociti nei vertebrati) - nei vertebrati la proteina trasportatrice di O 2 del sangue è l emoglobina (Hb) - cellule che richiedono grossi apporti di O 2 (come le cellule muscolari) contengono la mioglobina (Mb), che: aumenta la solubilità effettiva intracellulare di O 2 accelerandone la diffusione e consentendo, in alcuni casi, una forma di immagazzinamento di O 2 Es: nei muscoli dei mammiferi acquatici la concentrazione di Mb è ~10 volte superiore a quella dei mammiferi terrestri) ratti knocked out normali Mb non necessaria ai muscoli in normali condizioni metaboliche

Mioglobina ed Emoglobina Requisiti di una sostanza trasportatrice di O 2 - una sostanza deputata al trasporto di O 2 deve: legarlo e rilasciarlo in modo opportuno impedire che reagisca con altre sostanze -le proteine non hanno gruppi funzionali adatti a fungere da siti di legame per l O 2 - alcuni ioni di metalli di transizione nei loro stati di ossidazione più bassi (Cu +, Fe ++ ) legano fortemente l O 2 ma sono soggetti a venirne ossidati - le proteine trasportatrici di ossigeno sono proteine coniugate contenenti Fe eminico (gruppo eme) lo ione ferroso dell eme (Fe 2+ ) lega l O 2 la componente proteica crea un ambiente idrofobico in cui il Fe 2+ non può essere ossidato a Fe 3+

Mioglobina ed Emoglobina Proteine coniugate - proteine che contengono una porzione non peptidica - quando la porzione non peptidica è una sostanza organica stabilmente legata alla componente proteica viene detta gruppo prostetico Oloproteina Apoproteina Gruppo prostetico

Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina - Struttura (Kendrew, 1959, Mb di capodoglio) (prima struttura determinata col metodo dei raggi X) - 153 residui -8α-eliche (A-H), sandwich 3-su-3 (BEF-AGH) - prototipo strutturale per le globine C D - gruppo eme legato in tasca idrofobica fra elica E ed F F A

Mioglobina ed Emoglobina Emoglobine troncate (2/2 Hb) - le prime 2 strutture (da P.caudatum e C.eugametos) determinate nel 2000 EMBO Journal (2000) 19, 2424-2434 - eme stabilizzato da sandwich di 2 eliche su 2 eliche (2/2 Hb) GENE (2007) 398, 2-11 GG motif GG motif

Eme: Mioglobina - derivato porfirinico con 4 anelli pirrolici (A-D) uniti da ponti metinici (anello tetrapirrolico) - eme = Fe-protoporfirina IX la componente organica dell eme è la protoporfirina IX, composto appartenente alla classe delle porfirine - sistema coniugato (legami Fe-N equivalenti) - lo ione Fe 2+ accetta 6 legami di coordinazione ordinati secondo i vertici di un ottaedro Mioglobina ed Emoglobina

Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina Eme: - Fe(II) coordinato a 4N della porfirina e ad N della catena laterale HisF8 -O 2 sesto ligando di Fe(II) stabilizzato da HisE7 (inclinazione 60 ) - eme in corretta posizione per interazione con ValE11 e PheCD1 sito distale HisE7 His distale ValE11 PheCD1 HisF8 sito prossimale HisF8 His prossimale

Nomenclatura dei residui nelle globine - nelle globine (struttura tutta α), le α eliche sono indicate sequenzialmente dal N- al C-terminale della catena polipeptidica con lettere dalla A alla H - i tratti di connessione (anse) tra due eliche adiacenti sono indicati con le due lettere identificative di ciascuna elica - i residui sono indicati sulla base della loro posizione in un elica o in un ansa Esempi: - AB è l ansa tra elica A e B - E7 è il settimo residuo dell elica E - FG5 è il quinto residuo dell ansa che connette le eliche F e G Mioglobina ed Emoglobina Struttura terziaria della Mb

Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina Eme: - deossimioglobina: Fe(II) fuori dal piano dell eme di 0.055 nm (struttura a cupola) - ossimioglobina: Fe(II) fuori dal piano dell eme di 0.026 nm - cambiamenti non rilevanti biologicamente per Mb ma fondamentali per la regolazione allosterica di Hb

Mioglobina Mioglobina ed Emoglobina -O 2 ossida irreversibilmente Fe(II) di un eme isolato a Fe(III), forma ionica che non può legare O 2 (ematina): Fe(II) Fe(III) o Fe 2+ Fe 3+ - la parte proteica della Mb (e della Hb) impedisce l ossidazione dell eme e rende possibile il legame reversibile di O 2 - l ossigenazione altera lo stato elettronico del complessi Fe(II)-eme (rosso scuro sangue venoso, rosso scarlatto sangue arterioso) - al di fuori della cellula Fe(II) (forma ferrosa) può essere ossidato lentamente a Fe(III) (forma ferrica) dare metamioglobina e metaemoglobina (colore marrone scuro carne vecchia/sangue secco) - CO, NO, H 2 S possono legarsi al gruppo eme delle proteine (con affinità maggiori di O 2 ) tossicità (Hb: affinità per CO 200 volte maggiore di O 2 )

Mioglobina ed Emoglobina Mioglobina 90 120 - eme isolato: affinità per CO 25000 volte maggiore di O 2 - Mb: affinità per CO 250 volte maggiore di O 2 - HisE7 impedisce formazione legame lineare fra Fe e CO diminuita affinità per CO rispetto a eme isolato

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: - legame reversibile di O 2 a Mb: reazione all equilibrio Mb + O 2 MbO 2 costante di dissociazione K = [Mb][O 2 ] [MbO 2 ] La dissociazione dell O 2 da Mb può essere caratterizzata mediante la sua saturazione frazionale Y O 2 [MbO YO 2 ] 2 = = [Mb] + [MbO 2 ] [O 2 ] K + [O 2 ] frazione di siti di legame di O 2 occupati essendo O 2 un gas po YO [O 2 ] come po 2 = 2 2 K + po po 2 = pressione parziale 2 (tensione ossigeno)

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: - la solubilizzazione dei gas nei liquidi è governata dalla legge di Henry: dove P = kc P è la pressione del gas sulla soluzione C è la concentrazione del gas nella soluzione k è una costante tipica di ciascun gas che correla la pressione del gas sulla soluzione e la sua concentrazione, ad esempio: O 2 : k = 4.34 10 4 L atm/mol (a T = 298 K) - un aumento di T, provocando aumento dell'energia cinetica del gas, provoca una diminuzione di solubilità per l'effetto di allontanamento delle molecole gassose dalla fase liquida - ogni gas, così come specificato nell'argomento relativo alla Legge delle pressioni parziali, entra in soluzione o si libera indipendentemente da ciò che fanno gli altri gas presenti

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: - il legame dell O 2 alla Mb (o alla Hb) può essere studiato con metodi spettroscopici (spettrofotometria)

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: YO 2 = po 2 K + po 2 iperbole rettangolare -a bassi po 2 si lega poco O 2 a Mb - all aumentare di po 2 aumentano i siti occupati da O 2 -a po 2 elevati si ha saturazione (tutti i siti sono occupati) - la pendenza della curva aumenta al diminuire di K - quando K = po 2 YO 2 = 0.5 (Mb è saturata al 50% da O 2 ) - operativamente la costante di dissociazione K può essere definita come: K = p 50

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Mb: - la Mb ha una p 50 molto bassa (circa 2.8 torr) e quindi una alta affinità per l O 2 - la Mb deve essere in grado di catturare, nel citoplasma di cellule metabolicamente molto attive, l O 2 proveniente dal torrente circolatorio (po 2 circa 30 torr) ed essere in grado di rilasciarlo ai mitocondri (po 2 <4 torr) - alle po 2 fisiologiche nel sangue (100 torr arterie, 30 torr vene) Mb è sempre saturata (po 2 = 100 torr Y O2 = 0.97; po 2 = 30 torr Y O2 = 0.91) Mb molto efficace per favorire il passaggio di O 2 dai capillari alle cellule muscolari

Mioglobina ed Emoglobina Emoglobina Proteina intracellulare (conferisce agli eritrociti il colore rosso) Funzione: trasporto O 2 bassa solubilità di O 2 in soluzioni acquose (~10-4 M nel sangue) Struttura: α 2 β 2 (Max Perutz) - dimero di protomeri αβ (simmetria C2) - pseudosimmetria binaria fra α e β (pseudosimmetria D2) - α e β evoluzionisticamente correlate fra loro e con Mb (stessa struttura, no elica D in α) - il legame dell O 2 altera la struttura del tetramero

Mioglobina ed Emoglobina α2 β1 α2 β1 β2 α1 β2 α1 deossi-hb ossi-hb il legame dell O 2 altera la struttura del tetramero: - cambiano i contatti α1-β2 e α2-β1 - rotazione 15 fra i 2 dimeri αβ avvicinamento subunità β - restrizione canale centrale contenente solvente (all interfaccia α1-α1 e β1-β1)

Mioglobina ed Emoglobina Comportamento di ipotetiche proteine di trasporto dell O 2 dotate di curve di saturazione iperboliche - una proteina di trasporto che lega l O 2 in modo analogo alla Mb non può essere un efficiente trasportatore di O 2 nel sistema circolatorio

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: - la curva sigmoide indica che Hb può trasportare più O 2 ai tessuti rispetto al caso iperbolico (a pari p 50 ) - pressione venosa = 30 torr YO 2 = 0.55 pressione arteriosa = 100 torr YO2 = 0.95 - differenza nella saturazione da O 2 come misura della capacità della Hb di rilasciare O 2 dai polmoni (alle po 2 degli alveoli) ai tessuti (alle po 2 dei capillari) : fattore 0.40 nella saturazione da O 2 (caso sigmoide) fattore 0.25 nella saturazione da O 2 (se la curva fosse iperbolica )

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: - curva di legame di O 2 sigmoidale cooperatività fra i siti di legame - p 50 = 26 torr per Hb - inizialmente: la pendenza della curva dell affinità per l O 2 è bassa perché le subunità competono indipendentemente per il legame al primo O 2 p 50 - dopo: quando una molecola di O 2 si è legata ad una subunità, l affinità delle altre subunità aumenta e quindi aumenta la pendenza della curva

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: in ogni sistema di legame, una curva sigmoide è indicativa di interazioni cooperative fra i siti di legame Hb + no 2 Hb(O 2 ) n n = numero O 2 legate in una singola tappa da Hb (cooperatività infinita) equazione di Hill YO 2 = (po 2 ) n (p 50 ) n + (po 2 ) n grado di saturazione di Hb in funzione di po 2

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: in realtà: - cooperatività infinita fisicamente impossibile YO 2 = - n (costante di Hill) non integrale come parametro di cooperatività fra subunità nel legame di O 2 (piuttosto che numero di subunità in grado di legare O 2 in una singola tappa) relazione empirica per fittare i dati n = 1 iperbole (non-cooperatività) n > 1 cooperatività positiva (cioè il legame di O 2 aumenta l affinità di Hb per il legame di altro O 2 ) n < 1 cooperatività negativa (cioè il legame di O 2 riduce l affinità di Hb per il legame di altro O 2 ) grafico di Hill (lineare) (po 2 ) n (p 50 ) n + (po 2 ) n YO (po 2 ) n 2 YO = log 2 1 - YO (p 50 ) n = n log po 2 - n log p 50 2 1 - YO 2

Mioglobina ed Emoglobina Calcolo di n e p 50 : YO log 2 = n log po 2 - n log p 50 1 - YO 2 - n = pendenza retta -logp 50 = intercetta ascisse - grafico lineare fra 0.1 < < 0.9 YO 2 - n calcolata alla max pendenza grafico doppio logaritmico YO 2 = 0.5 (po 2 = p 50 ) - per Hb 2.8 < n < 3.0 (alta affinità ma non infinita, cioè n = 4)

Mioglobina ed Emoglobina Calcolo di n e p 50 : Il grafico di Hill evidenzia come la curva di saturazione dell emoglobina (corrispondente al legame cooperativo di O 2 ) sia il risultato di una transizione da un processo di legame a bassa affinità ad uno ad alta affinità

Mioglobina ed Emoglobina Cinetica di legame O 2 per Hb: andamento asintottico YO 2 ~ 0 n = 1 tutti i siti sono disponibili e competono indipendentemente fra loro (Mb) YO 2 ~ 1 n = 1 3/4 dei siti sono occupati. I siti disponibili sono su Hb distinte (indipendenti) grafico doppio logaritmico estrapolando gli asintoti: p 50 (Hb n 1) = 30 torr p 50 (Hb n 4) = 0.3 torr la 4 molecola di O 2 si lega con affinità 100 volte maggiore della prima

Meccanismo di cooperatività Mioglobina ed Emoglobina -lo stato di legame di un gruppo eme influenza l affinità per O 2 del gruppo eme delle altre subunità - interazione gruppi eme attraverso modifiche struttura quaternaria (non elettronica: distanza atomi Fe(II) gruppi eme 25-37 Å)

Stato T = deossi-hb (stato teso ) Stato R = ossi-hb (stato rilassato ) Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina il legame dell O 2 innesca una serie di movimenti coordinati che altera la struttura quaternaria iniziale e determina il passaggio T R la transizione T R consiste in una rotazione reciproca dei 2 dimeri αβ

Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina (1) stato T: Fe(II) fuori dal piano dell eme (0.06 nm) verso HisF8 (struttura a cupola) (2) si lega O 2 : modifica stato elettronico dell eme, si accorciano i legami Fe-N porfirina, si annulla la forma a cupola dell eme

Mioglobina ed Emoglobina Meccanismo di Perutz passaggio T R: - movimento di 0.6Å di HisF8 verso l eme - traslazione di ~ 1Å di tutta l elica F (per evitare interferenze steriche) - rotazione dell angolo FG

Mioglobina ed Emoglobina Meccanismo di Perutz (3) accoppiamento variazioni terziarie e riorganizzazione quaternaria modifiche all interfaccia α1-β2 e α2-β1 stato T: contatto His(97)FG4(β2) - Thr(41)C6(α1) stato R: contatto His(97)FG4(β2) - Thr(38)C3(α1) (un giro di elica prima) in entrambi i casi buon impaccamento protuberanze/scanalature

Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina (3) accoppiamento variazioni terziarie e riorganizzazione quaternaria

(4) modifiche ai residui C-terminali Meccanismo di Perutz stato T: Arg(141)α, His(146)β parte di reticolo di coppie ioniche intered intra-subunità che stabilizza lo stato T stato R: rottura coppie ioniche Mioglobina ed Emoglobina stato T

Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina - Hb nello stato T ha bassa affinità per O 2 (lunghezza dei legami Fe-N superiore di 0.1 Å rispetto a stato R) - a seguito del legame dell O 2 ad una subunità nello stato T, l atomo di Fe 2+ torna nel piano della porfirina (da 0.6 Å a 0.2 Å) - tale movimento si trascina dietro l elica F e modifica i tratti EF ed FG - tali movimenti sono trasmessi all interfaccia tra le subunità e determinano la rottura dei ponti salini al C-terminale - tutte le subunità vengono convertite simultaneamente nello stato R (alta affinità per O 2 ) indipendentemente dal fatto che O 2 sia ad esse legato - le subunità nello stato R ma non impegnate da O 2 hanno aumentato la loro affinità per O 2 in quanto nella conformazione corretta - nello stato T, l O 2 è accessibile solo ai gruppi eme delle subunità α (ma non le β) per ingombro sterico impedimento assente dopo la transizione T R

Meccanismo di Perutz Mioglobina ed Emoglobina - le subunità α e β sono così saldamente accoppiate che una modificazione della struttura terziaria in una subunità non può non influenzare la struttura quaternaria dell intera proteina - Hb ha solo 2 stati quaternari, T ed R: i contatti inter-subunità agiscono come interruttori binari - la mancata flessibilità alle interfacce α1-β1 e α2-β2 fa sì che la transizione T R avvenga simultaneamente alle interfacce α1-β2 e α2-β1 - esistono effettori allosterici: H +, CO 2, Cl -, BPG (D-2,3-bisfosfoglicerato)

Effetto Bohr Mioglobina ed Emoglobina -H + è un antagonista del legame di O 2 ad Hb: al diminuire del ph è favorita la dissociazione dell O 2 dalla Hb Stato T: i gruppi carichi amminici (1) N-terminali delle subunità α (2) imidazolici delle His C-terminali delle subunità β formano ponti salini sono più basici (aumento del loro pk) minor disponibilità a perdere protoni nello stato R tali gruppi diventano parzialmente deprotonati (in condizioni fisiologiche rilascio di ~0.6 protoni per O 2 legato) T-Hb Bohr H + Bohr H +

Mioglobina ed Emoglobina Effetto Bohr l aumentare del ph (rimozione di protoni) stimola Hb a legare O 2, anche a basse po 2 Hb(O2)nHx + + O 2 Hb(O 2 ) n+1 + xh + Implicazioni fisiologiche nel trasporto di O 2 e CO 2 nei polmoni: alta po 2 (100 torr) O 2 si lega a Hb il sangue trasporta O 2 al tessuto che respira nei tessuti: bassa po 2 ~20 torr O 2 si dissocia da Hb nei tessuti muscolari O 2 si lega a Mb (che ha affinità per O 2 più alta di Hb)

Effetto Bohr Mioglobina ed Emoglobina - consente di rifprnire con altro O 2 i muscoli che si stanno contraendo attivamente, nei quali la po 2 può essere anche inferiore ai 20 torr - tali muscoli generano acido lattico velocemente si produce un abbassamento del ph nel sangue si stimola il rilascio di O 2 da parte di Hb - ad una po 2 di 20 torr, a ph 7.2 Hb rilascia ~10% di O 2 in più che a ph 7.4

Mioglobina ed Emoglobina Effetto Bohr e trasporto di CO 2 nel sangue nei tessuti: la CO 2 prodotta dalla respirazione cellulare diffonde dai tessuti ai capillare e viene trasportata ai polmoni sotto forma di bicarbonato CO 2 + H 2 O H + + HCO 3 - negli eritrociti (globuli rossi) la reazione è catalizzata dalla anidrasi carbonica (nel sangue la maggior parte della CO 2 è trasportata come HCO 3- )

Mioglobina ed Emoglobina Effetto Bohr e trasporto di CO 2 nel sangue nei capillari (bassa po 2 ) CO 2 + H 2 O H + + HCO 3 - -gli H + prodotti dalla dissociazione del carbonato in bicarbonato vengono legati da Hb e la stimolano al rilascio di O 2 - l assunzione di H + da parte di Hb stimola la formazione di HCO 3- e facilita il trasporto di CO 2 promuovendo la formazione di bicarbonato

Mioglobina ed Emoglobina Effetto Bohr e trasporto di CO 2 nel sangue - nei polmoni: alta po 2 il legame di O 2 rompe le coppie ioniche stato T R rilascio protoni che si legano al bicarbonato inducendo la liberazione di CO H 2 O H + + HCO 3 - CO 2

Carbammilazione di Hb Mioglobina ed Emoglobina La CO 2 modula il legame del O 2 per Hb anche combinandosi reversibilmente con i gruppi ammino-terminali (α) con formazione di carbammato ( NHCOO ) R NH 2 + CO 2 R NH COO + H + - nei tessuti (alta [CO 2 ]) reazione spostata a destra - nei polmoni (bassa [CO 2 ]) reazione spostata a sinistra La presenza N-terminale di un gruppo carico - consente la formazione di un ponte salino con Arg141 (α) (anche Cl ) stabilizzazione (e favorizzazione) stato deossi (T) rilascio O 2 (favorito anche da effetto Bohr prodotto da rilascio di H + )

Interazione BPG-Hb Mioglobina ed Emoglobina Hb purificata ha una affinità per O 2 più alta di Hb nel sangue intero - oltre a CO 2 nel sangue è presente il D-2,3-bisfosfoglicerato (BPG) che diminuisce l affinità di Hb per O 2

Interazione BPG-Hb Mioglobina ed Emoglobina - BPG ha alta affinità per stato T che stabilizza (bassa affinità per stato R) - formazione di legami H e coppie ioniche fra gruppi anionici BPG e 8 gruppi cationici di Hb (β1 e β2) legame nella cavità centrale della deossihb - cross-linkando le subunità β si stabilizza lo stato T e quindi si sposta l equilibrio T R verso lo stato T diminuzione dell affinità per O 2

Interazione BPG-Hb Mioglobina ed Emoglobina - 2,3-BPG si lega alla sola forma T della Hb, poiché il sito di legame non è disponibile nella forma R T R

Interazione BPG-Hb Mioglobina ed Emoglobina Funzione fisiologica - il BPG è il principale modulatore fisiologico dell Hb: in assenza di BPG nei capillari verrebbe liberata una quantità di O 2 minore Adattamento all altitudine - la pressione dell ossigeno a 3000 m è circa il 70% in meno che a livello del mare - l adattamento all altitudine è un fenomeno complesso che comprende: (1) aumento numero di eritrociti e quantità di Hb per eritrocita (settimane) (2) aumento di BPG sintetizzato dagli eritrociti (giorni) (da circa 4mM a 8mM)

Interazione BPG-Hb Adattamento all altitudine livello del mare: po 2(arterie) - po 2(vene) = 70 torr rilasciato 38% di O 2 altitudine: po 2(arterie) - po 2(vene) = 55-30 = 25 torr Mioglobina ed Emoglobina rilasciato 30% di O 2 rilasciato 37% di O 2 (se >BPG) - aumento di [BPG] anche in individui che soffrono di disordini che limitano l ossigenazione del sangue (ipossia)

Interazione BPG-Hb Mioglobina ed Emoglobina HbF = Hb fetale -strutturaα 2 γ 2 - γ) His143 Ser rispetto a β - [BPG] è la stessa negli eritrociti di adulti e fatali - BPG si lega meno efficacemente alle subunità γ funzione fisiologica HbF ha maggiore affinità per O 2 efficace trasferimento O 2 da madre a feto (scambi gassosi attraverso placenta)

Hb anormali Mioglobina ed Emoglobina - esistono più di 500 varianti di Hb, il 95% delle quali dipende dalla sostituzione di un solo amminoacido in una catena - non tutte le varianti producono sintomi clinici, ma alcune determinano malattie debilitanti

Hb anormali - mutazioni che destabilizzano la struttura terziaria o quaternaria alterazioni dell affinità per l O 2 (p 50 ) riduzione cooperatività (costante di Hill) - le Hb instabili sono degradate negli eritrociti (i prodotti di degradazione possono causare lisi delle cellule anemia emolitica) Mioglobina ed Emoglobina - alcune mutazioni favoriscono l ossidazione del Fe(II) a Fe(III) grandi quantità di metaemoglobina nei vasi arterosi cianosi (bassa costante di Hill: ~ 1.2) - le mutazioni che aumentano l affinità di Hb per O 2 determinano nell organismo per compensazione un aumento del numero degli eritrociti policitemia

Hb delle cellule falciformi (HbS) - mutazione Glu Val 6 in ciascuna catena β Mioglobina ed Emoglobina -nella deossihb: formazione di una catena lineare polimerica (14 filamenti superavvolti): unaval6 si inserisce in tasca idrofobica superficiale (presente solo nella forma deossi e non nella forma ossi) di un altra HbS in una Hb normale il Glu 6 non potrebbe inserirsi nella tasca idrofobica in quanto carico diametro della fibra ~ 220 Å

Anemia a cellule falciformi - le fibre si dissolvono in seguito ad ossigenazione e non sono presenti nel sangue arterioso - polimerizzazione di HbS quando gli eritrociti devono passare attraverso i capillari, dove avviene la deossigenazione (polimerizzazione dipendente da tempo e concentrazione) - filamenti insolubili deformazione ed irrigidimento degli eritrociti (che non passano più attraverso i capillari) - morte cellulare delle cellule dei tessuti non irrorati - anemia emolitica (lisi eritrociti per fragilità meccanica) Mioglobina ed Emoglobina

Hb delle cellule falciformi (HbS) - gli eterozigoti (HbS) sono più resistenti alla malaria - il protozoo Plasmodium falciparum risiede negli eritrociri durante il suo ciclo vitale (48h) - gli eritrociti infettati aderiscono alla parete del capillare fino ad occluderli (blocco del flusso sanguigno in organi vitali) - il parassita aumenta l acidità delle cellule infettate di 0.4 unità di ph Effetto Bohr favorita formazione di deossi-hb (nel caso di HbS formazione fibre) - rimozione preferenziale degli eritrociti danneggiati (cellule infette) da parte della milza - le fibre possono distruggere meccanicamente il parassita Mioglobina ed Emoglobina gli eterozigoti con HbS che vivono in zone malariche hanno un vantaggio evoluzionistico

Allosteria Proteine allosteriche - 2 o più siti di legame topologicamente distinti (in grado di legare substrati, inibitori, attivatori) che interagiscono in modo funzionale fra loro la formazione del legame di un ligando ad un sito altera le proprietà dell altro sito, in particolare la sua affinità per il secondo ligando cooperatività: - positiva: la modificazione aumenta la capacità di legame - negativa: la modificazione diminuisce la capacità di legame - effettori allosterici: 1) effettori allosterici omotropici: (il substrato è esso stesso effettore) 2) effettori allosterici eterotropici (effettore diverso da substrato) es: inibizione/attivazione a feed-back

Allosteria Proteine allosteriche - cinetica non obbedisce al modello di Michaelis-Menten v ([S]) sigmoidale v prop. [S] n con n>1 - a basse [S], un aumento di [S] causa solo un lieve incremento di velocità pochi siti sono occupati dal substrato ed essi hanno una bassa affinità per S - a più alte [S] si ha un drammatico incremento d velocità man mano che si lega S, aumenta l abilità dell enzima di legare S (cooperatività positiva) - ad alte [S] andamento asintottico raggiungimento saturazione (V MAX )

Allosteria Proteine allosteriche cooperatività positiva: - gli effettori allosterici (attivatori/inibitori) alterano la velocità di reazione dell enzima attivatore: aumenta la velocità di reazione dell enzima diminuisce il carattere sigmoide della curva di saturazione inibitore: diminuisce la velocità di reazione dell enzima aumenta il carattere sigmoide della curva di saturazione Tali effettori operano sulla capacità di legare il substrato e, quindi, sulla K M, lasciando alterata la V MAX (sistemi K) Sistemi V, nel caso che l effettore cambi la V MAX

Allosteria Proteine allosteriche struttura polimerica - le proteine ed enzimi allosterici possiedono una struttura polimerica o quaternaria - l interazione fra le subunità (interazioni deboli) è responsabile della cooperatività da substrato agenti denaturanti - se sottoposti a blanda denaturazione, molti enzimi allosterici perdono le loro proprietà allosteriche da substrato pur mantenendo attività catalitica risposta bifasica a inibitori competitivi (inibitori che mimano il substrato) - a basse [S], l inibitore competitivo può aumentare le capacità dell enzima a legare substrato (agisce come un attivatore) - ad alte [S], l inibitore competitivo si comporta in modo normale rallentando la reazione

Allosteria Modelli di allosteria (1) modello concertato o simmetrico (Monod, Wyman, Changeux) (2) modello sequenziale (Koshland, Nemethy, Filmer) Modello simmetrico Premessa: proteina allosterica formata da subunità che esistono in 2 stati Stato R (rilassato) Stato T (teso)

Allosteria Modello simmetrico Assunzioni: - le subunità devono essere tutte nello stesso stato (R o T) - stato R: alta affinità per il substrato stato T: bassa affinità per il substrato k T >> k R - in assenza di ligandi i 2 stati sono in equilibrio (spostato verso T) T 0 R 0 es: costante di equilibrio L = [T 0 ]/[R 0 ] = 10 4 (T 0 e S 0 in assenza di substrato S)

Allosteria Modello simmetrico S aggiunto a proteina allosterica all equilibrio: - legame prevalente a proteine in stato R - spostamento dell equilibrio verso R (diminuzione della concentrazione della proteina nello stato T) incremento dell affinità complessiva enzima-substrato cooperatività positiva da substrato

Allosteria Effettori allosterici eterotropici Modello simmetrico attivatore: si lega prevalentemente allo stato R spostamento dell equilibrio verso R (stato ad alta affinità per il substrato) diminuzione dell apparente stato di cooperatività (riduzione piede della sigmoide e tendenza della curva di saturazione a diventare iperbolica) inibitore: si lega prevalentemente allo stato T spostamento dell equilibrio verso T (stato a bassa affinità per il substrato) aumento del piede della sigmoide necessaria una quantità maggiore di substrato per raggiungere lo stesso grado di cooperazione

Allosteria Effettori allosterici eterotropici Modello simmetrico

Assunzione: Modello sequenziale - le subunità possono essere sia nello stato R o che nello stato T - equilibri complessi di cui l equilibrio tra le forme pure R e T sono un caso particolare (modello simmetrico) - il substrato ha una influenza diretta sulla forma dell enzima S aggiunto a proteina allosterica (prevalentemente nello stato T 0 ): Allosteria - adattamento indotto: il substrato entra nel sito attivo a causa di collisioni casuali e la subunità si sistema attorno al substrato per produrre un buon adattamento conversione nello stato R

Allosteria Modello sequenziale - se il cambio T R in una subunità tende a spingere le altre subunità ad assumere la forma R cooperatività positiva - il cambio conformazionale propagato può avvenire prima che si leghi il nuovo substrato o rendere il processo di adattamento indotto più semplice - se il cambio T R in una subunità rende più difficile alle altre subunità la assunzione della forma R cooperatività negativa la cooperatività negativa non è spiegabile con il modello simmetrico (che dipende solo dalla legge d azione di massa tra le forme R e T) Effettori allosterici eterotropici attivatore: si lega in un sito dal substrato ma opera allo stesso modo inibitore: rende l enzima più rigido, rendendo più difficoltoso l adattamento indotto T R

Allosteria Hb ed allosteria il legame di O2 ad Hb esprime proprietà associate ad entrambi i modelli - la transizione quaternaria T R è concertata come nel modello simmetrico - il legame del ligando nello stato T determina modifiche alla struttura terziaria delle subunità, necessarie per la conversione nello stato R (come richiesto dal modello sequenziale)