Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Anno Accademico 2015-16 Corso di Laurea Magistrale in SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA Insegnamento di BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI Prof. Augusto Parente Lezione 17
CISTEIN-PROTEASI Sono presenti in tutti gli organismi viventi: i) vegetali (papaina, bromelina (o bromelaina), ficina, chimopapaina, actinidina); ii) animali (catepsine B, C e D, calpaine, e caspasi) e, iii) microrganismi (clostripaina, proteasi 1, ecc.) Sono state descritte più di 20 famiglie di cistein-proteasi (CP; EC 3.4.22), molte delle quali hanno un importanza a livello industriale. Peso molecolare 21-30 kda Esopeptidasi rompono il legame peptidico in prossimità dell N o del C- terminale Endopeptidasi rompono il legame peptidico lontano dall N o dal C-terminale. 5 CLAN : CA papaina-simili CB chimotripsina virale-simili CC endopeptidasi dei virus a RNA papaina-simili CD caspasi legumina-simili CE contenenti residui di His, Glu/Asp, Gln e Cys nel sito catalitico.
ESEMPI DI CISTEIN-PROTEASI Viene sintetizzata come precursore di 345 amminoacidi e peso molecolare di 38.9 kda Il precursore è formato da: - Peptide segnale (1-18) - Peptide di regolazione (19-133) - Proteina matura (134-345) La papaina La papaina (EC 3.4.22.2) è la cistein-proteasi meglio conosciuta. E stata isolata nel 1879 dal latice essiccato del frutto acerbo di Carica papaya ed è stata anche la prima proteasi per la quale è stata determinata la struttura cristallografica. In realtà il latice essiccato di Carica papaya contiene una miscela di almeno 4 proteasi. Preparazioni di papaina pura si ottengono mediante cromatografia di affinità.
Se la cisteina del sito attivo si ossida, l enzima perde l attività. L attività viene recuperata trattando l enzima con cisteina (molto efficace), mercaptoetanoto, ditiotreitolo, glutatione-sh. PROTEINA MATURA Sito attivo Proprietà chimico-fisiche e funzionali - 212 amminoacidi - peso molecolare 23,4 kda - pi 8.75-3 ponti disolfurici interni - due domini di dimensioni simili, con all interno il sito catalitico Utilizzando la caseina come substrato si ha: - ph ottimale 5.8-7.0 - Temperatura ottimale 50-57 C Resistente anche a temperature di cottura
Il sito attivo della papaina è caratterizzato dalla presenza dei residui di Cys25 (Cys158 nell intera sequenza del precursore) e His159 (His292 nell intera sequenza), situati ai lati opposti della tasca catalitica. Il residuo di Asn175 (Asn308 nell intera sequenza) è importante per l orientamento dell anello imidazolico dell istidina all interno del sito attivo. Il gruppo tiolico del sito attivo deve essere allo stato ridotto (-SH). His 159 Base Gruppo nucleofilo Asn 175 Terzo residuo
MECCANISMO CATALITICO Nell intervallo di ph 3,5-8,0 la cisteina e l istidina stabiliscono un legame ionico (i tioli hanno pka intorno a 8-9, quindi sono più acidi rispetto agli alcoli). 1. Si forma un intermedio S- acetilato attraverso l attacco nucleofilo del gruppo tiolico della cisteina sul carbonio carbonilico del legame peptidico del substrato 1 2 2. Una molecola d acqua reagisce con l intermedio: il frammento N-terminale viene rilasciato e viene rigenerato l enzima per un nuovo ciclo catalitico. 4 3 Porzione C-terminale
Il sito attivo della papaina lega almeno 7 residui amminoacidici del substrato. Da studi cinetici e strutturali, i siti importanti per il binding del substrato sono 5. I siti S2, S1 e S1 (in blu in Figura) sono importanti sia nel legame con la catena amminoacidica del substrato che con le catene laterali, mentre i siti S3 e S2 sono cruciali solo per il legame con le catene laterali. Le papaine mostrano una preferenza per i substrati che presentano un amminoacido con catena laterale ingombrante e idrofobica in posizione P2 (Phe, R Leu, Ile, ecc.), mentre il residuo in posizione P1 non influenza in maniera C=O H 2 O determinante il legame enzima-substrato (anche OHse c è una preferenza per gli amminoacidi basici quali Arg e Lys). Val non è accettata in questa posizione. La posizione S3 ha meno vincoli. In generale quindi la papaina possiede una ampia specificità. SUBSTRATO Phe Leu Ile Arg Lys H H O Nomenclatura di Schechter e Berger ENZIMA Papaina
Bromelina Il termine bromelina originariamente è stato dato ad una miscela di proteasi trovate nel succo del gambo e del frutto dell ananas (Ananas comosus). La esopeptidasi principale del gambo viene chiamata bromelina del gambo e l enzima principale presente nel frutto dell ananas bromelina del frutto. La bromelina del gambo è una proteina glicosilata: - 212 amminoacidi -Peso molecolare 24,5kDa - 7 cisteine, di cui una catalitica, mentre le altre 6 sono impegnate in 3 legami disolfurici - ph optimum 6-8,5 - temperatura ottimale 50-60 C La bromelina da frutto, presente nel succo, ha un peso molecolare di 25kDa ed è immunologicamente distinta dalla bromelina del gambo.
FICINA Ficina è il nome della cistein-peptidasi isolata dal latice essiccato di Ficus glabrata. E anche presente in altre specie di Ficus come F. carica e F. elastica). Nel frutto acerbo è presente all 1% e diminuisce alla maturazione. Sensibile all essiccamento al sole (temperatura ottimale 45-55 C). Ha la capacità di far coagulare le micelle di caseina, come citato da Omero nell Iliade. - Peso molecolare 23,1 kda (circa - 7 cistine, di cui una catalitica, mentre le altre 6 sono impegnate in 3 legami disolfurici - ph optimum 6,5-8,5 (7.0) - stabilizzata da trealosio Ficus glabrata Ficus carica
Catepsine B, C e D Le catepsine sono enzimi presenti all interno dei lisosomi del sarcoplasma del tessuto muscolare. Vengono liberate post-mortem e provocano una proteolisi parziale delle proteine miofibrillari (miosina e actina) durante la fase di maturazione (processo di frollatura). - ph ottimale acido- 5,5 (sono inattivate a ph 7.0) - Amminoacidi 214-260 - Attive anche a basse temperature. Sono importanti per molti processi fisiologici. Oltre alla degradazione delle proteine cellulari, intervengono anche (catepsina C) nella coagulazione del sangue facilitando la proteolisi della protrombina e la sua conversione in trombina.
APPLICAZIONI INDUSTRIALI DELLE CISTEIN-PROTEASI Gli enzimi sono molto utilizzati nell'industria chimica e in altre applicazioni industriali che richiedono catalizzatori estremamente specifici. Le principali limitazioni al loro impiego sono la scarsa stabilità in un solvente differente da quello biologico e - ovviamente - il numero limitato di reazioni per cui l'evoluzione ha messo a punto enzimi efficaci. Di seguito viene riportato un elenco di settori/applicazioni in cui vengono impiegati enzimi.
Tabella 1. Alcune applicazioni delle peptidasi SETTORE APPLICAZIONE ENZIMI FUNZIONI INDUSTRIA ALIMENTARE Panificazione Birrificazione Proteasi - Bromelina. Usata di più per la sua elevata velocità di reazione, ampio ph di utilizzo (6-8,5), e temperatura (50-60 C) - papaina (cfr. ph di utilizzo 5,8-7,0; temperatura 50-57 C). Inoltre la bromelina non è contaminata da amilasi o pentosanasi (enzimi che agiscono sui pentosani delle emicellulose ). Proteasi Papaina grezza oppure bromelina L impasto può essere preparato più velocemente (perché viene reso più morbido) se il glutine è parzialmente idrolizzato. Questo è soprattutto vero, quando si usano varietà ad alto contenuto di glutine. Questi enzimi vengono utilizzati soprattutto nella preparazione di biscotti e di altri prodotti di pasticceria (torte) evitandone il restringimento. Si ha come effetto una maggiore friabilità, una uniforme doratura, un miglioramento dell aroma per la liberazione di amminoacidi. Rimuovono la torbidità della birra, dovuta alla precipitazione delle proteine durante la conservazione a freddo. Attualmente si tende a non usare papaina per il divieto ad usare additivi, nei paesi Europei
SETTORE APPLICAZIONE ENZIMI UTILIZZATI FUNZIONI INDUSTRIA ALIMENTARE Trasformazione dei prodotti alimentari * Papaina**, bromelina e ficina (*L attività della papaina è di difficile controllo, persiste anche durante la cottura e può avere effetti indesiderabili. Producono idrolizzati con eccellenti proprietà gustative, per la mancanza di sapori amari. Infatti gli idrolizzati proteici di frutti di mare, uova, e vegetali (soia, grano, riso, girasole, sesamo e mais) presentano un aumentato sapore ed una più elevata assimilazione (anche per la presenza di amminoacidi (es. glutammato e glicina, esaltatori di sapidità). *L idrolisi delle proteine di matrici alimentari animali o vegetali viene effettuata per diversi scopi: i) migliorare le caratteristiche nutrizionali; ii) ritardare il deterioramento; SEGUE
iii) modificare alcune proprietà funzionali (solubilità, la formazione di schiuma- es. nelle caseine-, la coagulazione, le capacità emulsionanti); iv) prevenire interazioni indesiderate; v) modificare sapore e odore; vi) Rimuovere fattori tossici o inibitori. L idrolisi enzimatica è da preferire (rispetto a metodi chimici) perché essa produce idrolizzati con una ben definita composizione, senza tra l altro la distruzione di L-amminoacidi.
SETTORE Industria alimentare APPLICAZIONE Trasformazione di caseine e di proteine del siero Intenerimento della carne** ENZIMI UTILIZZATI Papaina, bromelina e ficina Bromelina e ficina (spruzzate o spolverate sulla carne). FUNZIONI - Riducono la formazione di schiuma, tipica di queste proteine; -Riducono le proprietà allergeniche dei prodotti lattiero-caseari; - Portano alla preparazione di bevande per gli sportivi; per la nutrizione infantile e enterale, e di cibi dietetici. Rottura dei legami crociati delle proteine fibrose (stromali-3%) della carne (collagene e elastina). Negli animali vecchi la carne può essere resa tenera iniettando papaina nella vena giugulare ** Morbidezza e tenerezza sono considerati fattori importanti che influenzano la soddisfazione del consumatore e la percezione dei sapori.
SEGUE SETTORE APPLICAZIONE Trasformazione Industria dei prodotti alimentare alimentari ENZIMI UTILIZZATI Papaina*, bromelina ficina FUNZIONI Applicazioni ulteriori: -Produzione di baby foods - produzione di fagioli (legumi in generale) disidratati - preparazione di cibi di facile digeribilità (in particolare per ammalati) - eliminazione da cibi di sapori sgradevoli dovuti a componenti peptidici - accelerare la maturazione dei salumi e prosciutto crudi
SETTORE ENZIMI UTILIZZATI FUNZIONI Soprattutto proteasi, Detersivi (papaina e bromelina) Utilizzate nelle fasi di prelavaggio, con in una specifica isoforma applicazione diretta sulle macchie di natura in grado di funzionare proteica. all'esterno delle cellule. Pulizia delle lenti a contatto Fotografia Industria cosmetica Proteasi Proteasi (ficina) Bromelina, papaina Industria tessile Bromelina, papaina Permettono la rimozione di varie proteine dalle lenti, per prevenire eventuali infezioni. Degradano la gelatina presente sulle pellicole di scarto per il recupero del contenuto di argento. Effetto peeling. Sbiancamento dei denti. Il trattamento può contribuire a far regredire macchie e brufoli e brufoli per un viso pulito (!!!pubblicità!!) Utilizzate per la lavorazione della lana; nella bollitura dei bozzoli di seta e nella 3 sua raffinazione (per liberare la fibroina della deta dalla sericina.
SETTORE ENZIMI UTILIZZATI FUNZIONI Effetto depilatorio nella concia del cuoio. Conferisce anche morbidezza. Industria del cuoio Papaina Riduce l inquinamento dovuto alla presenza di cromo nei rifiuti della lavorazione tradizionale. Chimica di sintesi Papaina Utilizzata nella sintesi di di peptidi bioattivi. Bromelina Sono stati riportati varie applicazioni di preparazioni grezze di bromelina: la inibizione reversibile della aggregazione delle piastrine, attività fibrinolitica, attività antinfiammatoria, attività antitumorale, Medicina ecc. Non tutti gli effetti, però, sono dovuti Papaina alla sua presenza, ma anche a quella di altri Proteasi lisosomiali enzimi (perossidasi, fosfatasi acida, inibitori di proteasi). La papaina viene usata per l eliminazione di tessuti necrotici, trattamento dell acne, depilazione, ecc.