Corso di formazione ACCREDIA-ISS su: Le disposizioni in materia di sicurezza alimentare applicate ai Laboratori Accreditati Roma, Aula Magna Istituto Superiore Antincendi 15-16 Novembre 2011 I laboratori che effettuano prove per individuare la presenza di Trichinella nelle carni Dr. Gianluca Marucci Dipartimento di Malattie Infettive Parassitarie ed Immunomediate Istituto Superiore di Sanità
Che cosa è una Trichinella? È un nematode parassita, patogeno per l uomo, presente nel tessuto muscolare di animali vertebrati
Un pò di storia... Scoperta in Inghilterra da J. Paget e descritta nel 1835 da R. Owen come Trichina spiralis Il ciclo descritto da R. Virchow nel 1859 Nel 1860 F. Zenker dimostrò la patogenicità di questi vermi nell uomo Nel 1895, Railliet cambiò il nome del genere da Trichina in Trichinella Sir James Paget Sir Richard Owen
Ciclo del parassita A: liberazione della larva L1 ad opera dei succhi gastrici B: penetrazione della larva nella nicchia multicellulare (cellule epiteliali cilindriche intestinali) C: sviluppo ad adulto; accoppiamento; rilascio di larve newborne che passano nei vasi sanguigni D: migrazione e penetrazione nelle cellule striate scheletriche E: accrescimento della larva e formazione della cellula nutrice Tempo totale 28 giorni
Trichinella spp. Il genere Trichinella comprende attualmente 8 specie e 4 genotipi, tutte in grado di infettare l uomo, ed ha una distribuzione cosmopolita A livello mondiale la trichinellosi ha: un incidenza annua di 10.000 casi clinici con una mortalità dello 0,2% una prevalenza 10 milioni di casi INCAPSULATA NON INCAPSULATA
Epidemiologia di Trichinella sp. Ciclo silvestre Ciclo domestico
Il ciclo selvatico L importanza degli animali selvatici come serbatoio di Trichinella si evince dalla biomassa dei parassiti più elevata tra gli animali selvatici che tra i domestici La scorretta gestione della fauna selvatica e degli animali domestici può favorire la trasmissione di Trichinella sp. dall ambiente silvestre a quello domestico (o viceversa)
Cinghiali riscontrati positivi in Italia Nel periodo 1988-2010, su circa 960.000 cinghiali esaminati per Trichinella, solo 19 (0,002%) sono risultati positivi
Il ciclo domestico - 1 Il più comune agente eziologico del ciclo domestico è T. spiralis che è ben adattata al suino nel quale ha un tasso riproduttivo molto elevato senza indurre la malattia clinica all infuori delle infestazioni da milioni di larve Questo ciclo si perpetua dove non vengono rispettate le corrette pratiche di allevamento ed i suini sono alimentati con: avanzi della macellazione o rifiuti alimentari contenenti carne suina carcasse di suini morti carcasse di animali oggetto di attività venatoria
Il ciclo domestico - 2 È inoltre presente laddove i suini sono allevati allo stato brado o nelle vicinanze di discariche di rifiuti alimentari
Suini riscontrati positivi all esame ispettivo per Trichinella in Italia dal 1959 Totale 26
Trichinella negli equini 1975-2005 - 7 focolai umani in Italia (1.038 casi) per il consumo di carne equina 1988-2008 - sono stati identificati alla macellazione in Italia 8 cavalli infetti con Trichinella In Europa, si stima 1 cavallo infetto ogni 250.000 macellati! Cause: Alimentazione e/o finissaggio con avanzi della macellazione di suini, di animali da pelliccia, o di animali oggetto di attività venatoria
Epidemie umane in Italia dal 1948 al 1990 Anno Regione No. di casi Fonte dell infezione 1948 Lazio 109 maiale 1953 Umbria 9 maiale 1961 Trentino Alto Adige 9 volpe 1968 Puglia 9 maiale 1975 Emilia Romagna 90 cavallo d importazione 1978 Basilicata 6 cinghiale 1980 Calabria 3 maiale 1984 Lombardia 13 cavallo d importazione 1985 Puglia 80 cinghiale d allevamento 1985 Calabria 2 volpe 1986 Basilicata 20 cinghiale d allevamento 1986 Emilia Romagna 300 cavallo d importazione 1988 Umbria 48 cinghiale 1990 Piemonte 11 cinghiale d allevamento
Epidemie e singoli casi umani in Italia dal 1990 ad oggi Anno Regione No. di casi Fonte dell infezione 1990 Puglia 500 cavallo d importazione 1991 Basilicata 6 maiale 1993 Toscana 4 maiale 1995 Abruzzo 23 cinghiale 1996 Basilicata 3 maiale 1996 Abruzzo 10 cinghiale 1998 Emilia Romagna 92 cavallo d importa zione 2000 Puglia 36 cavallo d importazione 2002 Lazio 8 maiale d importazione 2002 Abruzzo 2 cinghiale 2005 Sardegna 19 maiale 2005 Lombardia 7 cavallo d importazione 2006 Lombardia 3 maiale d importazione 2007 Sardegna 1 maiale 2008 Piemonte 6 cinghiale 2011 Sardegna 6 maiale Totale 1.455, media 23 casi/anno
Prevenzione e controllo dell infezione da Trichinella nell uomo - 1 Educazione sanitaria dei consumatori non consumare carne e derivati crudi o poco cotti di origine suina, equina, di animali oggetto di attività venatoria (cinghiale) se non preventivamente controllati dai servizi veterinari Controlli veterinari negli allevamenti e nei macelli suini, cavalli e animali oggetto di attività venatoria per mezzo della digestione artificiale Educazione dei cacciatori i cacciatori devono essere informati che c è una diretta correlazione tra l abitudine di macellare le carcasse degli animali sul campo e una elevata prevalenza dell infezione nella fauna selvatica
Prevenzione e controllo dell infezione da Trichinella nell uomo - 2 Congelamento della carne devitalizza le larve presenti nei muscoli tuttavia le larve di T. britovi possono sopravvivere nei muscoli di suini congelati a -20 fino a 3 settimane Specie di Specie ospite Trichinella T. britovi lupo volpe rossa cinghiale topo di laboratorio T. spiralis volpe rossa suino topo di laboratorio Temperatura di congelamento -20 C -15 C -20 C -10 C -18 C -18 C -10 C Tempo di sopravvivenza 6 mesi 11 mesi 3 settimane 7 giorni 3 gg 4 hs 2 hs
Prevenzione e controllo dell infezione da Trichinella nell uomo - 3 Cottura delle carni le larve presenti nei muscoli vengono devitalizzate alla temperatura di 70 C per 3 minuti la cottura della carne nel forno a microonde non è in grado di devitalizzare il 100% delle larve presenti in grossi tagli di carne Le larve sopravvivono per un lungo periodo di tempo in: carni o loro derivati conservate sotto vuoto carni o loro derivati conservati sott olio o altro grasso (lardo) Prodotti lavorati (salsicce, salami, ecc.)
Metodi di prova per la ricerca di Trichinella nelle carni
Normativa vigente Il regolamento CE 2075/2005 che indica le norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichinella spp. nelle carni e descrive in dettaglio le tecniche diagnostiche ufficiali (All.1, cap. I e II) Il regolamento 1245/2007 che integra la 2075/2005 inserendo la possibilità di utilizzare la pepsina in formulazione liquida Le linee di indirizzo per la corretta applicazione del regolamento CE 2075/2005 (Conferenza permanente per i rapporti tra lo stato, le regioni e le provincie autonome di Trento e Bolzano, del 10 maggio 2007)
Siti di prelievo e quantità Categoria produttiva Suino da ingrasso Scrofe e verri Sito di prelievo esame 1 istanza esame 2 istanza Conferma positività pilastri diaframma 1 gr 20 gr 20 gr massetere, lingua, muscoli addominali, diaframma prossimo alle costole o sterno 2 gr 20 gr 20 gr pilastri diaframma 2 gr 20 gr 20 gr massetere, lingua, muscoli addominali, diaframma prossimo alle costole o sterno 4 gr 20 gr 20 gr Cinghiali lingua, diaframma, tibiale 10gr - 50 gr Equini lingua, massetere 10 gr - 50 gr Altri animali siti di elezione 10 gr - - Il prelievo deve essere una quantità tale da garantire l esame di prima e seconda istanza di campioni aggregati e l esame del singolo positivo in relazione alla categoria produttiva
Campionamento La fase di campionamento è esclusa dalla prova Ai sensi del reg. 854/2004 il veterinario ufficiale è responsabile dell effettuazione del prelievo del materiale da sottoporre ad analisi ed assicura che sia adottata una procedura documentata per lʼidentificazione, la manipolazione e lʼinvio dei campioni/pool di campioni al laboratorio designato nonché per la rintracciabilità dei singoli campioni e loro correlazione con la carcassa e sue parti
Conformità del campione Requisiti di conformità richiesti dalla 2075/2005: 1. Il campione deve essere di peso idoneo 2. Il campione deve essere privo di grasso e tessuto connettivo 3. Se si utilizza la lingua, occorre asportare lo strato superficiale che non è digeribile ed impedisce una corretta lettura del sedimento Questi requisiti devono essere valutati dal laboratorio che effettuerà l analisi al momento della ricezione del campione
Accettazione del campione Il laboratorio è tenuto a giudicare l idoneità del campione sulla base dei requisiti di conformità (17025, punto 5.8.3) e, laddove sia necessario, dovrà procedere con le operazioni di pesatura e toelettatura al fine di ottenere un campione valido per l analisi
Manipolazione del campione Il laboratorio deve inoltre garantire: La conservazione adeguata del campione (17025, punto 5.8.1) L identificazione del campione durante tutte le fasi di analisi (17025, punto 5.8.2)
Metodi diagnostici Metodo di riferimento: Agitatore magnetico (Cap. I, Allegato I della 2075/2005) Metodi equivalenti: Stomacher e Trichomatic 35 (Cap. II, Allegato I della 2075/2005)
Validazione Non ci sono metodi da validare ma il laboratorio deve confermare che può correttamente eseguire i metodi normalizzati prima di metterli in opera per le prove (17025, punto 5.4.2) Il laboratorio è tenuto ad applicare uno dei metodi descritti nel regolamento EU e deve dare evidenza che è in grado di farlo correttamente mediante la partecipazione a circuiti interlaboratorio o l applicazione del metodo a campioni di prova inficiati con larve muscolari di Trichinella forniti dal Laboratorio Nazionale di Riferimento per la Trichinellosi o da un altro laboratorio di riferimento europeo per la Trichinella.
Agitatore magnetico Apparecchiature non soggette a taratura Miscelatore con lame affilate (tritacarne o frullatore) Agitatore magnetico con piastra riscaldante Beckers (3 litri), imbuti ed imbuti separatori (2 litri) e cilindri graduati (50 o 100 ml) in vetro. L uso di materiale in plastica può pregiudicare la prova per via dell adesività delle larve alle pareti dei contenitori Setaccio con maglie metalliche da 180 µm. Non richiesta taratura in quanto non utilizzato per misurare ma per trattenere residui di digestione, fondamentale la pulizia e l integrità delle maglie Stereomicroscopio con ingrandimenti di almeno 15-20X (60-100X) Piastre Petri monouso 9 cm Ø con quadrettatura sul fondo Dispositivi di protezione individuali (camice, guanti, mascherina) ed ambientali (cappa chimica o sistema di aspirazione dell aria)
Agitatore magnetico Apparecchiature soggette a taratura Agitatore magnetico con piastra riscaldante (se presente deve essere tarata la sonda che viene inserita nella soluzione digestiva) Termometro con precisione di 0,5 C Bilancia con precisione di 0,1 g Frigorifero per la conservazione dei campioni e/o della pepsina (se presente deve essere sottoposto a monitoraggio della temperatura mediante sonda tarata, es. datalogger) Per queste apparecchiature è richiesta la taratura, interna o da parte di un centro SIT, e la conferma metrologica (17025, punto 5.5)
Agitatore magnetico Reagenti Acido cloridrico 25% (importante la concentrazione finale) Pepsina in polvere o liquida concentrazione 1:10 000 NF ( 1: 12 500 BP, 2 000 FIP) Etanolo al 90% per la conservazione di eventuali larve trovate da inviare al laboratorio di riferimento per l identificazione di specie La pepsina è un reagente critico che deve essere conservato in ambiente fresco (4-15 C) ed asciutto in un contenitore ermeticamente chiuso. L attività enzimatica si riduce con il tempo (scadenza circa 2 anni)
Agitatore magnetico Procedura Preparare la soluzione digestiva aggiungendo in un becher da 3 litri in successione 2 litri di acqua a 46-48 C, 16±0,5 ml di HCl a 25%, 10±0,2 g di pepsina in polvere (o 30 ml di liquida) Sminuzzare i campioni e trasferirli nel becher Sciacquare il contenitore e le lame del tritacarne Incubare in agitazione alla temperatura di 44-46 C fino alla scomparsa delle particelle di carne, circa 30 (o al massimo 60 ) Versare la soluzione attraverso il setaccio nell imbuto separatore e lasciare sedimentare per 30 Valutare il residuo indigerito (max 5% in peso del campione) Prelevare 40 ml di soluzione nel cilindro graduato o nella provetta e lasciare sedimentare per 10 Aspirare il sopranatante fino a 10 ml e versare il rimanente nella piastra da lettura insieme ad ulteriori 10 ml con cui verrà lavato il cilindro Procedere con la lettura del sedimento assicurandosi di esaminare tutti i campi
Agitatore magnetico Raccomandazioni della 2075/2005 La pepsina va sempre aggiunta alla soluzione di acqua ed acido cloridrico, mai direttamente all acido cloridrico altrimenti verrà degradata Il liquido digestivo rimasto nell imbuto separatore deve essere conservato fino al completamento della lettura dei risultati La lettura del sedimento deve essere effettuata immediatamente, nel caso il sedimento non venga esaminato entro 30 occorre procedere con la chiarificazione (lavaggio con 30 ml di acqua di rubinetto) Un massimo di 15 g possono essere aggiunti al pool di campioni, più di 15 g vanno analizzati come campione separato Campioni fino a 50 g possono essere analizzati dimezzando la quantità dei reagenti In caso di positività i parassiti devono essere conservati in alcool etilico al 90% per l identificazione della specie ed i liquidi digestivi decontaminati riscaldandoli ad una temperatura minima di 60 C
Agitatore magnetico Punti critici della procedura La temperatura iniziale dell acqua e della soluzione digestiva vanno costantemente monitorate, sotto i 37 C l attività della pepsina si riduce mentre sopra i 48 C la pepsina viene disattivata (digestione incompleta) Un tempo di digestione eccessivo (>60 ) può danneggiare le larve con conseguente diminuzione del peso specifico (diverso tempo di sedimentazione) ed aumento dell adesività ai contenitori Un eccesso di sedimento nel setaccio può trattenere le larve Le larve possono rimanere adese alle pareti del bicchiere del tritacarne, o del becher che vanno quindi sciacquati con cura La torbidità del sedimento può impedire una corretta lettura; L utilizzo di campioni positivi a scopo didattico (PT, addestramento, visita ispettiva) può essere fonte di falsi positivi se l attrezzatura utilizzata non viene correttamente lavata
Stomacher Sistema di omogeneizzazione del campione Temperatura interna regolabile Permette di analizzare un campione di 100 g
Stomacher Materiali ed apparecchiature peculiari Sacchetti in plastica per stomacher Apparato vibrante (es. rasoio elettrico) Relè elettrico Nel caso di isolamento delle larve mediante filtraggio: Imbuto Gelman da 1 litro con supporto per filtro Dischi filtranti in acciaio da 35 µm Beuta da aspirazione Pompa aspirante Sacchetti in plastica sigillabili Rennilasi
Stomacher Procedura Dotare lo stomacher di un doppio sacchetto e regolare la T a 40-41 C Versare nel sacchetto interno 1 ½ litro di acqua preriscaldata a 40-41 C, 25 ml di acido cloridrico al 17,5 %, il pool di campioni da 100 g e 6 g di pepsina Mescolare il contenuto del sacchetto per 25 minuti Filtrare il succo di digestione attraverso il setaccio in un becker da 3 litri Aggiungere ghiaccio fino ad ottenere un volume di 2 litri Trasferire il liquido digestivo in un imbuto separatore da 2 litri Lasciare sedimentare per 30 Durante la sedimentazione il recipiente viene fatto vibrare ad intervalli di 1 Prelevare 60 ml di liquido e lasciare sedimentare per 10 in un cilindro graduato Aspirare il surnatante fino a 15 ml, trasferire il rimanente in una Petri per la ricerca delle larve
Stomacher Isolamento mediante filtraggio Dopo l aggiunta del ghiaccio il succo digestivo viene trasferito nell imbuto Gelman e filtrato Il filtro viene messo in un sacchetto con la soluzione di rennilasi ed incubato nello stomacher per 3 La soluzione viene versata nella piastra per controllare la presenza di larve di Trichinella
Stomacher Punti critici della procedura Gli stessi del metodo dell agitatore magnetico inoltre: Temperatura mantenuta dallo stomacher durante l analisi Se si utilizza la procedura di filtraggio anche: Possibilità che le larve restino adese alle pareti del sacchetto dello stomacher o nell imbuto Gelman Corretta attività della soluzione di rennilasi
Trichomatic 35 Apparecchio di digestione completamente automatico Permette un analisi veloce del campione (circa 20 ) Massima quantità di campione analizzabile 35 g
Trichomatic 35 Procedura Aggiungere il campione (max 35 g) nella camera di digestione Versare l'acqua nella camera dei liquidi fino al segno (400ml circa) Versare circa 30 ml di acido cloridrico all'8,5 % nell apposita cameretta Collocare il filtro a membrana (14 µm) sotto al filtro a grana grossa nell apposito supporto Aggiungere 7 g di pepsina nella camera di digestione; Selezionare il periodo di digestione (5 per suini da ingrasso, 8 per altri campioni) Rimuovere il filtro a membrana e trasferirlo sulla piastra Petri per la lettura allo stereomicroscopio
Trichomatic 35 Raccomandazioni della 2075/2005 Il filtro a membrana può essere riutilizzato fino ad un massimo di cinque volte. Il filtro deve essere rigirato dopo ciascuna utilizzazione e controllato prima dell uso per individuare eventuali danni che lo renderebbero inutilizzabile Nel caso di risultati positivi, riempire la camera di reazione del miscelatore con acqua bollente fino a 2/3. Versare acqua di rubinetto nel recipiente collegato al contenitore di liquidi fino raggiungere il livello del sensore inferiore e procede con la pulizia automatica. Decontaminare il supporto del filtro e qualsiasi altra attrezzatura, usando, ad es. formalina In caso di digestione incompleta si pone un nuovo filtro sul supporto, si riempie con acqua il recipiente del miscelatore e si procede al programma di pulizia automatica. Alla fine entrambi i filtri devono essere esaminati allo stereomicroscopio
Trichomatic 35 Punti critici Essendo un sistema totalmente automatizzato è fondamentale una corretta manutenzione dello strumento (es. mantenimento della corretta temperatura, tenuta delle guarnizioni, etc.) Stato di usura della membrana filtrante
Trichinoscopio Fuorilegge da gennaio 2010 Non permette di analizzare un elevato numero di animali Difficoltà nel rilevare le specie di Trichinella non incapsulate Falsi negativi causati da errata dimensione del campione (elevato spessore del tessuto da esaminare)
Qualifica del personale che effettua le prove
Corretta formazione del personale I rischi correlati ad una non adeguata formazione del personale preposto all analisi sono: 1.I falsi negativi, dovuti all incapacità dell operatore di eseguire correttamente la digestione o di leggere il sedimento 2.I falsi positivi, dovuti all incapacità dell operatore di riconoscere il parassita e di distinguerlo ad esempio dalle fibre muscolari
Normativa di riferimento Linee guida per la corretta applicazione del regolamento CE 2075/2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichinella nelle carni del 10 maggio, 2007 Capitolo VI, Formazione del personale
Cosa stabilisce la normativa Il personale (sia laureato che tecnico) deve ricevere una formazione sia sulla teoria che sulle pratiche di laboratorio specifiche L aggiornamento semestrale del personale tecnico mediante l analisi di campioni positivi Divisione dei compiti durante l analisi
Personale laureato Formazione corso teorico-pratico di 8 ore Parte teorica principali conoscenze sull epidemiologia dei parassiti del genere Trichinella legislazione europea su questi patogeni conoscenza dei metodi diagnostici e dei punti critici del procedimento diagnostico Parte pratica riconoscimento di larve di Trichinella sp. dopo digestione artificiale, riconoscimento di larve di Trichinella sp. in tessuto muscolare tramite trichinoscopio, esecuzione di almeno due metodi diagnostici ammessi dalla recente legislazione, prelievo dei campioni per l analisi tracciabilità del campione e della carcassa
Personale tecnico Formazione corso teorico-pratico di 8 ore Parte teorica conoscenza dei metodi diagnostici e dei punti critici del procedimento diagnostico Parte pratica riconoscimento di larve di Trichinella sp. dopo digestione artificiale riconoscimento di larve di Trichinella sp. in tessuto muscolare tramite trichinoscopio esecuzione di almeno due metodi diagnostici ammessi dalla recente legislazione prelievo dei campioni per l analisi tracciabilità del campione e della carcassa ogni sei mesi, il personale tecnico che svolge giornalmente o settimanalmente la prova mediante digestione artificiale, deve essere messo in grado di poter osservare le larve di Trichinella dopo digestione a seconda della tecnica utilizzata
Aggiornamento del personale Non esistendo materiali di riferimento certificati (17025, punto 5.6.3.2.) possono essere considerati come tali i campioni di carne inficiati con larve vive di Trichinella oppure le larve di Trichinella fissate in alcol L aggiornamento del personale può essere effettuato utilizzando questi materiali di riferimento e con la partecipazione ai circuiti interlaboratorio
Compiti del personale I tecnici di laboratorio formati provvedono alla preparazione del campione, il personale laureato è responsabile della lettura dell analisi
Problematiche - 1 frequente turnover del personale scarsa conoscenza dell uso del microscopio attualmente la partecipazione ai circuiti interlaboratorio è di laboratorio e non individuale come sarebbe raccomandato scarsa esperienza specifica del personale e strumentazione insufficiente soprattutto per i laboratori annessi ai piccoli macelli
Problematiche - 2 i piccoli macelli sono quelli che esaminano il maggior numero di suini a rischio Trichinella ma sono quelli dove il personale ha minore esperienza è presente strumentazione di minor qualità è più difficile partecipare ai circuiti interlaboratorio i grandi macelli sono quelli che esaminano il maggior numero di suini non a rischio Trichinella e sono quelli dove il personale ha una maggiore esperienza è presente strumentazione di migliore qualità è più facile partecipare ai circuiti interlaboratorio
Circuiti interlaboratorio
Digestione artificiale La digestione artificiale è un test diagnostico che non prevede l utilizzo di controlli interni (positivi o negativi), pertanto risulta fondamentale che il personale tecnico incaricato della prova sia stato correttamente addestrato e che la sua capacità operativa venga monitorata nel tempo Questo può essere fatto tramite i circuiti interlaboratorio (proficiency tests)
Proficiency tests I Proficiency tests sono uno strumento ampiamente utilizzato per: Valutare le prestazioni dei laboratori riguardo specifiche analisi o misurazioni Monitorare le prestazioni dei laboratori su base continua Identificare i problemi correlati alle procedure di prova (strumentazione inadeguata, formazione tecnica inefficace, ecc.) ed attuare le idonee azioni per il miglioramento Comparare tra loro diversi metodi di prova o di misurazione Aumentare la fiducia dei clienti nei confronti dei laboratori che vi partecipano
Preparazione dei campioni Larve muscolari di Trichinella spiralis prive di capsula vengono ottenute per digestione artificiale di tessuto muscolare proveniente da un topo infettato sperimentalmente ed inserite all interno di polpette preparate con carne suina magra macinata una sola volta
Preparazione dei campioni Le larve vengono contate sotto uno stereoscopio e trasferite nel centro della polpetta con del PBS il vetrino viene poi esaminato per assicurare che non vi siano rimaste adese delle larve ed il campione viene sigillato sottovuoto e spedito refrigerato
Tipo di campioni Ogni partecipante riceve un set di 5 campioni in cui possono essere inclusi uno o più negativi I campioni positivi contengono un numero di larve variabile: Campioni da 100 g N larve 2-3 5-6 8-10 Campioni da 35 g N larve 2 3-4 5-6 Insieme ai campioni viene inviata una scheda su cui registrare i risultati
Scheda registrazione risultati Codice campione Metodo di digestione 1 Data (gg/mm) No. di larve reperite Note 1 A 15/07/11 0 2 A 15/07/11 2 3 A 15/07/11 5 4 A 15/07/11 1 5 A 15/07/11 0 1 ) A, metodo dell agitatore magnetico con digestione artificiale di campioni aggregati fino a 100 gr; B, metodo di digestione automatica per campioni aggregati fino a 35 gr. Alla consegna i campioni devono essere immediatamente conservati a +4 C. I campioni devono essere processati in toto [non dividere mai il campione], entro 48 ore dal ricevimento e secondo uno dei metodi riportati nel regolamento europeo 2075/2005. Trattandosi di carne macinata omogenare nel frullatore solo per pochissimi secondi. Il presente modulo, debitamente compilato deve essere inviato all Istituto Superiore di Sanità per fax (06 4990 3561) o per email (gianluca.marucci@iss.it) entro 48 ore dall esecuzione delle prove. Data Tecnico (nome/firma):
Valutazione dei risultati La normativa 2075/2005 stabilisce che il personale che effettua l analisi deve essere in grado di identificare la positività/negatività del campione alla Trichinella senza prendere in considerazione il numero di larve del parassita in esso contenute Pertanto il test della digestione artificiale deve essere considerato di tipo esclusivamente qualitativo
Scheda di valutazione-1 Risultati del proficiency test sulla digestione di campioni aggregati di tessuto muscolare secondo il Regolamento (CE) N. 2075/2005 CODICE CAMPIONE RISULTATO ATTESO RISULTATO OSSERVATO 1 negativo negativo 2 positivo positivo 3 positivo positivo 4 positivo positivo 5 positivo negativo Criteri d interpretazione dei risultati Sulla base del REGOLAMENTO (CE) N. 2075/2005 DELLA COMMISSIONE del 5 dicembre 2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichinella nelle carni, i risultati della digestione dei campioni di tessuto muscolare vengono espressi come positivo (presenza di una o più larve di nematodi) o negativo (assenza di larve di nematodi).
Valutazione generale del PT La valutazione generale del PT viene fatta assegnando a ciscun campione un peso correlato con il numero di larve in esso contenute (esempio campione 100 g) campioni 6 + + + + - - - - - - - - - - - - 6 + + + + + + + + - - - - - - - - 6 + + + + + + + + + + + + - - - - 7 + + - - + + - - + - + - + + - - 0 - + - + + - - + - - + - - + - + valutazione P P N N P P N N N N N N N N N N Parametri non definitivi, in attesa di convalida da parte degli organi competenti (International Commision on Trichinellosis e DGSANCO)
Valutazione secondaria Secondo il regolamento 2075/2005 la sola identificazione dei campioni come positivi o negativi per la presenza del parassita è ritenuta sufficiente Tuttavia il numero di larve recuperate durante l analisi di un dato campione costituisce un buon indicatore dell efficacia della tecnica e dell addestramento dell operatore A tale scopo al laboratorio viene fornito anche un secondo tipo di valutazione riguardante il numero di larve recuperate durante l analisi Per la valutazione del numero di larve recuperate ci avvaliamo dello Z-score
Come calcolare lo Z-score X lab " z =!ˆ X Ref Dove: X lab è il risultato ottenuto dal partecipante (numero di larve recuperate) X Ref è il risultato atteso (numero di larve effettivamente presenti nel campione) ˆσ è la deviazione standard
!ˆ Come calcolare ˆσ Il valore di ˆσ è 1/3 dello scarto accettabile tra numero di larve recuperate e numero di larve presenti nel campione Scarto accettabile: 30% per campioni contenenti 10 o più larve 50% per campioni contenenti da 4 a 9 larve Per i campioni fino a 3 larve, è considerato sufficiente il recupero di almeno una larva (Z-score non applicabile)
Applicazione pratica Scarto accettabile= 30% (70% larve recuperate) óˆ = 0.3! X 3 Ref = X lab z = "!ˆ X 10 X Ref Ref In verde: Z 2.0 positive signal In giallo: 2.0 < Z <3.0 warning signal In rosso: Z 3.0 action signal σ= 1.2 X ref X lab z 12 6-5.0 7-4.1 8-3.3 9-2.5 10-1.6 11-0.8 12 0.0 13 0.8 14 1.6 15 2.5 16 3.3 17 4.1 18 5.0
Interpretazione dello Z-score z 2.0 positive signal 2.0 < z <3.0 warning signal z 3.0 action signal A single action signal in one round, or two warning signals in successive rounds, shall be taken as evidence that an anomaly has occurred that requires investigation. (ISO 13528:2005)
Scheda di valutazione-2 Non richiesta dalla 2075/2005 ma utile al laboratorio per valutare la propria prestazione CODICE CAMPIONE NUMERO DI LARVE ATTESO NUMERO DI LARVE OSSERVATO Z-SCORE VALUTAZIONE FINALE 1 0 0 non applicabile positiva 2 3 2 non applicabile positiva 3 10 5 5,0 negativa 4 3 1 non applicabile positiva 5 5 0 6,0 negativa Criteri d interpretazione dei risultati Z-score viene valutato utilizzando l equazione X lab corrisponde al numero di larve reperite dal laboratorio nel campione X ref corrisponde al numero di larve presenti nel campione σ corrisponde ad 1/3 dello scarto accettabile tra il numero di larve reperite dal laboratorio ed il numero di larve effettivamente presenti nel campione Criterio di valutazione: - per campioni contenenti 10 o più larve, lo Z-score è calcolato con uno scarto accettabile del 30% - per campioni contenenti 4-9 larve, lo Z-score è calcolato con uno scarto accettabile del 50% - per campioni contenenti 1-3 larve, lo Z-score non è applicabile, ma viene considerato accettabile il reperimento di almeno 1 larva. Con valori di z 2,0 il risultato del laboratorio è positivo; con valori di 2,0< z <3,0 il risultato è sempre positivo ma deve allertare il laboratorio; con valori di z 3,0 il risultato del laboratorio è negativo.
Grazie per la vostra attenzione