Università Cattolica del Sacro Cuore di Piacenza e Cremona Facoltà di Scienze Agrarie e Veterinarie Studio e caratterizzazione di Clostridium isolati dalla fliera alimentare di Gianluca Quintini Relatore: Pier Sandro Cocconcelli A. A. 2008-09
1. INTRODUZIONE 1.1. CARATTERISTICHE DEI BATTERI DEL GENERE CLOSTRIDIUM Il genere Clostridium fu identificato da Prazmowski nel 1880 (1). Si tratta di bacilli Gram-positivi, spesso accoppiati o in corte catenelle, con estremità arrotondate o talvolta affusolate o tozze, spesso pleiomorfi. Sono in gran parte mobili per flagelli peritrichi e raramente capsulati e producono spore generalmente a localizzazione terminale o subterminale. La maggior parte dei clostridi sono normalmente saprofiti e si ritrovano negli strati del suolo poveri di ossigeno (2) e nell intestino di alcuni animali, compreso l uomo. (3-4) Il genere Clostridium è molto eterogeneo riguardo all ossigeno; si ritrovano, infatti, vicino a specie moderatamente aerotolleranti (C. aerotolerans, C. histolyticum, ecc.), specie di anaerobi obbligati assoluti (C. perfringens, C. haemolyticum, Clostridium novyi tipo B, ecc.) possono richiedere incubazione prolungata o pre-riduzione delle piastre di recente preparazione; essi sono privi del sistema dei citocromi e della catalasi, producendo ATP esclusivamente mediante reazioni di fosforilazione a livello del substrato. Le endospore formate da tali batteri sono ovali o sferiche e sono localizzate nella parte terminale o subterminale della cellula, la quale presenta un rigonfiamento. Il genere Clostridium include specie molto diverse tra loro per quanto riguarda il range di temperatura di crescita, infatti, questi microrganismi si differenziano in psicrofili, mesofili e termofili. Nonostante questa condizione si possono trovare cellule vegetative anche dopo il processo di pastorizzazione, dato dal fatto che questo genere di batteri producono spore termoresistenti, vengono disattivate solo durante il processo di sterilizzazione (121 C per 15 ). Un ulteriore differenziazione tra le varie specie appartenenti al genere Clostridium può essere effettuata in base alla differente produzione di metaboliti. Nonostante tutte le specie siano coinvolte nella degradazione di sostanze organiche ad acidi, alcoli, CO 2, H 2 e minerali, non tutte producono acido butirrico, ma alcune producono alcoli, acido acetico, acido succinico e gas come l anidride carbonica, l idrogeno e l acido solfidrico con conseguente formazione di odori e sapori sgradevoli, fino ad arrivare al fenomeno della putrefazione. 2
Alcune specie decompongono le proteine (proteolitici), altre fermentano carboidrati (saccarolitici) quali glucosio, maltosio, lattosio e saccarosio, altre possiedono entrambe le proprietà e pochissine ne l'una ne l'altra. I clostridi che interessano le produzioni casearie sono ascrivibili al gruppo dei butirrici, ulteriormente suddivisibile in due sottogruppi fisiologici: i saccarolitici (Clostridium tyrobutyricum e Cl. butyricum) con spiccata capacità fermentativa degli zuccheri e degli acidi organici e i proteolitici (Cl. sporogenes e Cl. bifermentans) che provocano la liberazione di aminoacidi, sui quali esercitano azioni di deaminazione, decarbossilazione, ossidazione e riduzione (5, 6, 7, 8, 10). Una suddivisione più accurata dei batteri del genere Clostridium per quanto riguarda le loro attività (saccarolitica e proteolitica), evidenziata su terreni quali agar latte o agar caseinato, è riassunta nella tabella n 1. Tabella n 1. Suddivisione delle varie specie di clostridi. Saccarolitici e Proteolitici non Saccarolitici non Non saccarolitici e Proteolitici Saccarolitici Proteolitici non proteolitici Cl. sordelli Cl. histolyticum Cl. perfringens Cl. cochlearis Cl. sporogenes Cl. botulinum Cl. barati Cl. tetani Cl. bifermentans * tipo G Cl. tyrobutyricum Cl. botulinum Cl. butyricum * tipo A Cl. tertium * tipo B Cl. fallax * tipo F Cl. chuvoei Cl. septicum Cl. sphenoides Cl. novyi (A-D) Cl. botulinum * tipo B * tipo C * tipo D * tipo E * tipo F Cl. cadaveris Cl. difficile Il genere Clostridium attualmente comprende circa 100 specie. Nel 1994 l eterogeneità di questa specie è stata confermata con il sequenziamento del gene 16S rdna. Come risultato sono stati proposti cinque nuovi generi ed undici nuove specie, nessuna delle quali appare significativa nelle infezioni dell uomo. 3
All'interno del genere Clostridium è possibile individuare un gruppo di microrganismi, i clostridi solfito riduttori, che comprende quei clostridi dotati della capacità di ridurre i composti ossidati dello zolfo a solfuro, capacità evidenziata nei terreni colturali contenenti citrato di ferro, dalla precipitazione di solfuro di ferro nero sulle colonie e nel terreno circostante. A questo gruppo appartengono sia un patogeno quale il Clostridium perfringens, sia microrganismi non patogeni quali Cl. baratti, Cl. bifermentans, Cl. celatum, Cl. novyi, Cl. putrificum, Cl. paraputrificum, Cl. pasteurianum, Cl. roseum, Cl. ramosum, Cl. saccarolyticum, Cl. tertium. Alcune specie sono patogene per l uomo a causa della produzione di tossine istolitiche, enterotossiche e neurotossiche, tra questi vi sono il Clostridium tetani, il Cl. botulinum e il Cl. perfringens e Cl. difficile; inoltre sono incluse anche specie responsabili dell alterazione degli alimenti che producono perdite economiche notevoli, Cl. butyricum, Cl. tyrobutyricum e Cl. sporogenes. La presenza di Cl. butyricum, Cl. tyrobutyricum e Cl. sporogenes è legata all utilizzo del mais insilato nell alimentazione dei bovini da latte con conseguente inquinamento delle feci che a loro volta possono contaminare il latte ed il suolo, il quale diventa un serbatoio di spore. Lo sviluppo dei clostridi deve avvenire in atmosfera strettamente anaerobica (90% H 2, 10% CO 2 ) in cui il potenziale di ossido-riduzione è molto basso. I terreni più comunemente impiegati per la coltivazione dei clostridi, prevedono l'utilizzazione di sostanze fortemente riducenti quali cisteina, tioglicolato, estratto di fegato o di carne. L attività dell acqua (a w ) ha un ruolo molto importante nella crescita cellulare e soprattutto nella produzione delle tossine, infatti, a valori di a w < 0,94 viene inibita la crescita e la produzione delle tossine. Le tossine (9) vengono prodotte durante la fase di sporulazione, cioè durante la produzione della spora all interno della cellula vegetativa, i vari tipi di tossine prodotte dai microrganismi del genere Clostridium si suddividono in: - tossina alfa = tossina prodotta da tutti i ceppi di Clostridium perfringens ed è una fosfolipasi C (lecitinasi) che lisa eritrociti, leucociti, cellule endoteliali. Ciò provoca aumento della permeabilità vascolare, emolisi, sanguinamento e distruzione dei tessuti ( come avviene nella mionecrosi) tossicità epatica e disfunzioni cardiache ( bradicardia, ipotensione). La tossina beta è responsabile di lesioni necrotiche (enteriti necrotizzanti). - tossina epsilon = una protossina prodotta da Clostridium perfringens attivata dalla tripsina, la quale provoca un aumento della permeabilità vascolare della parete gastroenterica. - tossina iota = tossina prodotta da Clostridium perfringens responsabile di attività necrotica ed aumento della permeabilità vascolare. 4
- enterotossina = questa tossina prodotta da Clostridium perfringens può inserirsi nella membrana cellulare e modificare la permeabilità ( citotossica ed enterotossica); gli effetti enterotossici sono dovuti ad ingestione di un elevato numero di microrganismi. - tossina A o Enterotossina = questa tossina prodotta da Clostridium difficile è chemio tattica per i PMN nell ileo e provoca il rilascio di citochine, responsabili dell ipersecrezione di liquidi e della necrosi emorragica. - tossina B o Citotossina = questa tossina prodotta da Clostridium difficile provoca depolimerizzazione dell actina, la distruzione citoscheletro cellulare. - tetanolisina = una emolisina prodotta da Clostridium tetani ossigeno-labile analoga alla streptolisina O. - tetanospasmina = una neurotossina prodotta da Clostridium tetani responsabile delle manifestazioni cliniche del tetano. E prodotta dalla cellula durante la fase stazionaria, inoltre è codificata in un plasmide ed è prodotta come singola molecola (150 KDa) che viene scissa da proteasi in due subunità peptidiche: subunità leggera (catena A) e subunità pesante (catena B) tenute insieme da un ponte disolfuro. La catena B si lega con l estremità COOH terminale ad un recettore sulla superficie dei neuroni (ganglioside GM2). La catena A, che è una zinco-endopeptidasi, viene internalizzata e risale dalle terminazioni periferiche al SNC tramite trasporto assonale retrogrado. La tetanospasmina viene rilasciata dai dendriti post-sinaptici, attraversa lo spazio giunzionale della sinapsi, e va a localizzarsi a livello delle vescicole delle terminazioni nervose presinaptiche. A livello sinaptico, la tetanospasmina blocca il rilascio dei neurotrasmettitori come il GABA (acido gamma-aminobutirrico) e la glicina delle sinapsi inibitorie, determinando una paralisi spastica. Il legame della tossina è irreversibile per cui la guarigione dipende dal tempo necessario alla formazione di nuove terminazioni assoniche. 5