ACIDI NUCLEICI...2 FUNZIONI DEL DNA...5 FUNZIONI DELL RNA...5 I NUCLEOTIDI...6 Struttura dei nucleotidi...6 Modello di Watson e Crick...10 Organizzazione strutturale superiore del DNA...13 DUPLICAZIONE DEL DNA...16 Replicazione semiconservativa del DNA...17 DNA POLIMERASI DI E.COLI...18 I PRIMER DI RNA...19 Il filamento di DNA è copiato in direzione 5 3...20 La reazione della DNA-polimerasi...21 DNA POLIMERASI III È LA REPLICASI DI E.COLI...23 LA DNA-POL I RIMUOVE I FRAMMENTI DI OKAZAKI...25 DNA-LIGASI...26 DNA POLIMERASI I...26 DNA POLIMERASI DEGLI EUCARIOTI...31 FEDELTÀ DI REPLICAZIONE...32 LE MUTAZIONI...33 PERCHÉ È STATO SCELTO IL DNA E NON L RNA COME MOLECOLA DELL EREDITARIETÀ...35 Idrolisi dell RNA in condizioni alcaline...36 Deamminazione della citosina ( uracile)...37 1
ACIDI NUCLEICI - DNA e RNA 1. Differenze strutturali 2. Differenze funzionali - Duplicazione del DNA - Trascrizione - Traduzione Controllo dell espressione genica 2
DNA (acido deossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico) sono molecole polimeriche (polinucleotidi) costituite da un unità base il NUCLEOTIDE. I nucleotidi sono delle molecole composte da uno zucchero a 5 atomi di carbonio (ribosio o deossiribosio) da una base azotata e da un fosfato. 3
DNA RNA Deossiribosio Ribosio Timina Uracile Doppia elica Singola elica Eccezioni: DNA a singola elica (in alcuni virus) RNA forma strutture a doppia elica (trna) 4
FUNZIONI DEL DNA 1. Dirige la propria replicazione durante la divisione cellulare 2. Dirige la trascrizione di molecole complementari di RNA FUNZIONI DELL RNA 1. Gli mrna dirigono la sintesi sui ribosomi delle proteine (traduzione) 2. Gli RNA dei ribosomi (che sono costituiti 1/3 da proteine e 2/3 da RNA) hanno prob. ruoli funzionali oltre che strutturali 3. Durante la sintesi proteica gli Aa vengono portati ai ribosomi da molecole di RNA di trasferimento (trna) 4. Certi RNA sono associati a proteine specifiche dando luogo a ribonucleoproteine che partecipano a processi di modificazione post-trascrizionali di altri RNA 5. In molti virus è l RNA e non il DNA il vettore dell informazione ereditaria 5
I NUCLEOTIDI Struttura dei nucleotidi 6
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Nel DNA e nell RNA i nucleotidi sono uniti da legami fosfodiesteri 8
DNA: doppia elica antiparallela 9
Modello di Watson e Crick s 1) doppia elica destrorsa fatta da 2 catene antiparallele 2) ogni giro dell elica vi sono 10,5 coppie di basi e 3,6 nm (passo) 3) le due catene sono tenute insieme da legami-h, le basi azotate sono all interno 4) la sequenza della basi porta l informazione genetica 10
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Procarioti Niente nucleo DNA circolare supervvolto Niente istoni Eucarioti Cellule nucleate DNA organizzato in cromosomi che contengono 1 unico filamento di DNA Proteine istoniche Dimensione delle molecole di DNA E.coli : 4X106 (coppie di basi) 1360 µm (lunghez.) Uomo (in 23 cromosomi aploidi) 2,9X109 (coppie di basi) 990.000 µm (lunghez.) 2 m cellula (in un uomo 1014 cellule) lungheza tot DNA 2 X1011 Km!! (distanza terra-sole 1,5 X 108 km) 12
Organizzazione strutturale superiore del DNA DNA superavvolto 13
Impaccamento dei nucleosomi (fibra 30 nm) 14
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DUPLICAZIONE DEL DNA Avviene durante la divisione cellulare. È un processo che coinvolge una grande quantità di enzimi, tra i principali: 1. DNA girasi (induce un superavvolgimento negativo alla doppia elica) 2. Proteine che separano i filamenti di DNA alla forcella di replicazione 3. Proteine che ne impediscono la riassociazione prima che la replicazione sia avvenuta 4. Enzima per la sintesi del primer di RNA (Primasi) 5. DNA polimerasi 6. Enzima che rimuove i primer di RNA 7. Un enzima che lega covalentemente i frammenti di Okazaki successivi. (DNA ligasi) 16
Replicazione semiconservativa del DNA 17
DNA polimerasi di E.coli 1.DNA-pol I: processi di riparazione, eliminazione del primer 2.DNA-pol III : duplicazione del DNA Promuovono l allungamento del filamento DNA (5 3 ) accoppiando i deossiribonucleotidi tri-fosfato sullo stampo di DNA Sono enzimi che necessitano di: 1. deossiribonucleotidi tri-fosfati 2. filamento stampo 3. filamento primer, ovvero una estremità 3 -OH libera (DNA) n residui + NTP (DNA) n +1 residui 18 + PPi
I primer di RNA Le DNA-pol hanno bisogno di un gruppo 3 -OH libero per poter allungare la catena. Come viene iniziata la sintesi di DNA? La RNA-polimerasi (primasi) NON ha bisogno di primer!! La primasi è una piccola (60 kda) RNA-polimerasi che sintetizza frammenti di RNA di 1-60 (dipende dalla specie) nucleotidi complementari alla catena stampo che fungono da primer dei frammenti di Okazaki. 19
Il filamento di DNA è copiato in direzione 5 3 Replicazione semi-discontinua (filamento veloce e filamento lento ) 20
La reazione della DNA-polimerasi 21
DNA polimerasi III è la replicasi di E.coli È un oloenzima di almeno 7 subunità Altamente processiva (> di 5000 nucleotidi) Attività: 1. polimerasi 5 3 2. esonucleasi 3 5 22
Sintesi dei frammenti di Okazaki 23
Sintesi della catena veloce e di quella lenta La DNA-polimerasi-III di E.coli è composta da 2 subunità 24
La DNA-pol I rimuove i frammenti di Okazaki attività esonucleasica 5 3 25
DNA-ligasi 26
DNA polimerasi I è un enzima scarsamente processivo (catalizza circa 20 polimerizzazioni successive prima di staccarsi) ma con una bassa frequenza di errore (10-7). In aggiunta ai sistemi di riparazione si arriva a 10-10! La DNA pol. I può correggere i propri errori è una 1. esonucleasi 3 5 2. esonucleasi 5 3 La funzione fisiologica della DNA-pol I è quella di: 1. riparare il DNA danneggiato (basi modificate chimicamente e quindi non correttamente appaiate) 2. eliminare i primer di RNA durante la replicazione 27
DNA-pol-I Attività esonucleasica 5 3 riparazione DNA eliminazione primer di RNA Attività esonucleasica 3 5 lettura di sicurezza ; verifica il corretto appiamento della base precedente prima di aggiungere la successiva 28
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DNA polimerasi degli eucarioti Sono note 5 diverse polimerasi: pol-α (alfa): oligomero a localizzazione nucleare; partecipa alla dupl. del DNA ; ad essa è associata una attività primasica; non ha attività esocucleasica; processività limitata (circa 100 nucleotidi) Ip.: replicazione del filamento ritardato (necessita di molti primer ma di una bassa processività) pol- γ (gamma): enzima mitocondriale pol-δ (delta): enzima nucleare; partecipa alla dupl. del DNA ha attività esonucleasica 3 5 ; processività illimitata. Ip.: replicazione del filamento leader (necessita di pochi primer e alta processività) pol-ε (epsilon): enzima nucleare; è implicata nei processi di riparazione del DNA 30
FEDELTÀ DI REPLICAZIONE La fedeltà di replicazione del DNA è necessaria per preservare l integrità del messaggio genetico di generazione in generazione. La DNA-pol III di E.coli polimerizza una base sbagliata ogni 1081010 basi replicate. (1 errore ogni 1000 batteri per ogni generazione). Ragioni di questa elevatissima accuratezza: 1. lettura di sicurezza e attività esonucleasica 3 5 2. necessità di un primer (i primi nucleotidi di una catena ad essere appaiati sono più soggetti ad un errato appaiamento tra le basi) 31
Le mutazioni 1. sostituzione di basi (mutazioni puntiformi) 2. inserzione o delezione di basi (frame shift) mutazioni puntiformi: 1. transizioni (purina sostituisce purina o pirimidina sostituisce pirimidina) 2. transversioni (purina sostituisce pirimidina viceversa) A) tautomero raro della adenina che si appaia con la citosina (invece che con la timina) A-T A-T A*-C A-T G-C DNA mutato!! A-T A-T 32
B) bromo-uracile (analogo della timina) si appaia con l adenina; con una certa frequenza si lega alla Guanina mutazione. C) deaminazione della citosina deaminazione G-C replicazione G-U G-C A-U 33 DNA mutato!!
Perché è stato scelto il DNA e non l RNA come molecola dell ereditarietà 1. RNA ma non il DNA è suscettibile di idrolisi catalizzata da basi. Quindi il DNA è una molecola chimicamente più stabile. 2. Il DNA non risente della deaminazione della citosina (ad Uracile) perché esso non contiene Uracile (ma Timina) 34
Idrolisi dell RNA in condizioni alcaline 35
Deamminazione della citosina ( uracile) deamminaz G=C duplicazione G=U A=U DNA mutato!! G=C Se accade questa deamminazione si ha una mutazione ma siccome l uracile NON è una base del DNA viene eliminato dai sistemi di riparazione 36