I.T.S.E. Cecilia DEGANUTTI CERCASI ENZIMA ALUNNI: Bogojevic Lidija De Stefano Davide Gabara Mihai Andrei Stoian Ioana Versolatto Sara INSEGNANTE: Prof.ssa Cinello Eugenia TECNICO LABORATORIO: Finiello Carmen
CERCASI ENZIMA Nepenthes X Rebecca Soper : è una pianta insettivora che ha sviluppato un metodo di cattura degli insetti per la necessità di sali minerali non presenti nel terreno originario. Presenta ascidi (particolari coppe presenti come prolungamento delle foglie) contenenti liquido digestivo. Il colore particolare e il suo odore serve per attirare gli insetti al loro interno. Domande guida: Come digerisce la nostra pianta carnivora? Enzima: è un catalizzatore biologico, cioè una molecola proteica capace di accelerare le reazioni senza subire trasformazioni chimiche permanenti. Gli enzimi sono regolati da: Temperatura Grado di acidità Presenza di coenzimi L attività delle proteasi è analoga a quella dell uomo? Il meccanismo di azione dei suoi enzimi è riconducibile al modello conosciuto di attività enzimatica digestiva dell uomo?
COME ABBIAMO CERCATO DI RISPONDERE: Individuando al microscopio il tessuto ghiandolare che secerne il liquido digestivo. Misurando il ph degli ascidi per individuare relazioni con l attività digestiva della pianta. Osservazioni: Si modifica solo il ph degli ascidi con BSA (A e B). Il ph sale durante la digestione. Le modifiche di ph possono dipendere o da un effetto tampone degli AA o da una reazione della pianta.
Proteina utilizzata: BSA COME ABBIAMO CERCATO DI RISPONDERE: Individuare metodi adeguati per rilevare l attività digestiva e le modalità di attivazione e di blocco della proteasi. Abbiamo deciso di utilizzare BSA purificata (siero albumina bovina) per semplificare lo studio della digestione proteica. Metodo: spettrofotometria Strumento: Spettrofotometro Esso misura la trasmitanza e l assorbanza. É formato da 5 parti: sorgente luminosa, monocromatore, chopper, vano porta campioni e fototubo. Assorbanza: è l'unità di misura con la quale si individua l'assorbimento della luce ad una certa λ da parte di un colorante. Colorante utilizzato: Blu brillante di Coomassie G-250 Esso si lega alle proteine causandone la colorazione (più alta è la concentrazione di proteina, più scuro è il colore).
ESPERIMENTO 1 Procedimento: Aggiunto BSA al liquido digestivo della pianta, proseguito l esperimento effettuando prelievi dagli ascidi A e B: In VITRO: Conservato i campioni a temperatura ambiente. Dopo 24, 48, 72 ore bloccato l attività enzimatica aggiungendo NaOH fino a ph 7 e raffreddando i campioni (-18 ). In VIVO: Dopo 24, 48, 72 ore e bloccato l attività enzimatica aggiungendo NaOH fino a ph 7 e raffreddando i campioni (-18 ). RISULTATI DELL ANALISI SPETTROFOTOMETRICA: Sono migliori nei campioni trattati con la soluzione di idrossido di sodio. L assorbanza generalmente diminuisce (= digestione) per poi aumentare......perché? POSSIBILI CAUSE: Torbidità: sul fondo degli ascidi erano presenti residui di insetti precedentemente digeriti. Concentrazione in vivo: l evaporazione del liquido degli ascidi può averne causato l aumento. MODIFICHE APPORTATE AGLI ESPERIMENTI SUCCESSIVI: Usare una maggiore concentrazione di albumina. Misurare i volumi dei campioni per valutarne le possibili variazioni. Bloccare l enzima con una soluzione tampone invece che con la soluzione di idrossido di sodio. Utilizzare anche un ascidio appena aperto dove non sono ancora stati digeriti insetti. Per le analisi in vitro preparare un campione unico dove mettere la BSA e da cui fare tutti i prelievi. Prolungare le osservazioni a 7 giorni sia in vitro che in vivo.
ESPERIMENTO 2 IN VITRO Procedimento: Analogo all esperimento precedente con le variazioni elencate nell esperimento 1: Abbiamo: Preparato due campioni con liquido di ascidi diversi da cui fare i prelievi M e P e filtrato il campione M. Utilizzato la soluzione tampone TRIS HCl (ph 7.5) per bloccare l attività enzimatica. Osservazioni: Poco liquido digestivo negli ascidi. Perdita di liquido nei campioni (probabile evaporazione). I risultati migliori sono quelli filtrati perché il liquido risulta essere meno torbido.
ESPERIMENTO 2 IN VIVO Abbiamo deciso di utilizzare un ascidio nuovo, appena aperto, per verificare la presenza degli enzimi. Procedimento: Abbiamo: Inserito 180 µg di BSA nel ascidio. Misurato il volume del liquido e segnato il livello sulla superficie dell ascidio. Prelevato 2 campioni, dopo 0, 24, 48, 72 ore, e aggiunto, in uno dei due, il tampone Tris HCl e conservati a temperatura di -18 C; Effettuato l analisi spettrofotometrica. Problemi: Rimisurando il volume ci siamo accorti di una notevole perdita di liquido nell ascidio. Prima di eseguire l analisi abbiamo diluito i campioni con acqua aggiungendo un adeguata quantità di soluzione tampone.
Cosa abbiamo imparato: CONCLUSIONI Lo studio degli organismi è molto complesso, la verifica delle ipotesi viene ostacolata da molti fattori disturbanti difficili da eliminare ed è per questo che è necessario fare delle semplificazioni. Lavorare in vitro invece che in vivo permette di ridurre i disturbi. L enzima nel liquido delle Nepenthes agisce a ph acido e risente della temperatura. Come avviene la digestione delle proteine e la loro scomposizione in amminoacidi. A utilizzare il ph e la sua scala logaritmica. A usare strumenti di laboratorio come spettrofotometro, microscopio A cercare collaborazione con persone fuori dall ambiente scolastico. Limiti del lavoro e possibili miglioramenti: Avremmo potuto: Utilizzare una maggiore quantità di albumina visto che il margine di errore, come si può vedere dai grafici, è minore nella parte centrale. Utilizzare più piante della stessa specie per poter fare dei confronti. Utilizzare un antibiotico per verificare che non ci siano dei batteri simbionti che favoriscono la digestione operata dalla pianta. Fare l esperimento in un periodo dell anno diverso da quello invernale, in quanto la temperatura del periodo non era ideale per questo tipo di pianta tropicale.
Senza la curiosità e l interesse di scoprire cose nuove, di spiegare il perché di quello che ci accade attorno e la voglia di fare una cosa nonostante la fatica e i continui ostacoli, non ci sarebbe l innovazione. A volte sono proprio queste piccole cose e le esperienze che fanno nascere la passione e fanno avere dei risultati straordinari!