ISTRUZIONI PER L'USO TERRENI SU PIASTRA PRONTI ALL'USO PA-254489.02 Rev.: giugno 2003 BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate) USO PREVISTO BD CHROMagar Orientation Medium/Columbia CNA Agar (Biplate) (terreno di coltura di orientamento BD CHROMagar/agar Columbia CNA (doppia piastra) viene utilizzato per l'isolamento dei batteri comunemente responsabili di infezioni del tratto urinario. Mentre CHROMagar Orientation Medium è un terreno non selettivo per l'isolamento, l'identificazione o la differenziazione degli agenti patogeni del tratto urinario, l'agar Columbia CNA è un terreno selettivo per l'isolamento di batteri Gram-positivi. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. CHROMagar Orientation Medium: I gruppi di Escherichia coli, enterococchi, Klebsiella- Enterobacter-Serratia e Proteus-Morganella-Providencia sono gli organismi che più frequentemente causano infezioni del tratto urinario. Il 60 70% delle infezioni urinarie sono causate da E. coli in coltura pura o unitamente ad enterococchi. Lo Staphylococcus saprophyticus e lo Streptococcus agalactiae si riscontrano, anche se con minor frequenza, nelle infezioni del tratto urinario di pazienti donne. Alcuni degli organismi in questione producono enzimi per il metabolismo del lattosio o glucosidi, oppure entrambi, mentre altri non producono nessuno di questi enzimi. Ad esempio, l'e. coli produce enzimi del metabolismo del lattosio ma è negativa per quanto riguarda la ß-glucosidasi. Altri membri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono positivi alla ß-glucosidasi ma non contengono gli enzimi necessari per la fermentazione del lattosio, mentre altri possono contenere entrambi i tipi di enzimi o nessuno di essi. Le beta-glucosidasi si trovano anche nei cocchi Gram-positivi ad esempio Enterococcus spp. e Streptococcus agalactiae. La triptofano deaminasi è un enzima che di solito si trova negli organismi del gruppo Proteus-Morganella- Providencia. CHROMagar Orientation Medium consente l'identificazione di E. coli, enterococchi e gran parte dei ceppi di Staphylococcus saprophyticus e S. simulans direttamente sulla piastra di isolamento; inoltre la rilevazione dei gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (=KES) e Proteus- Morganella-Providencia (=PMP) è possibile mediante la colorazione della colonia e del terreno di coltura. 1-3 Dato che CHROMagar Orientation Medium non è selettivo, la crescita riguarderà anche altri agenti patogeni del tratto urinario, ma sono necessari test biochimici per la loro identificazione. CHROMagar Orientation Medium è stato sviluppato da A. Rambach e viene venduto da BD Diagnostic Systems su licenza di CHROMagar, Parigi, Francia. In BD CHROMagar Orientation Medium i nutrienti sono forniti da peptoni appositamente selezionati. La miscela cromogena è costituita da substrati artificiali (cromogeni) che rilasciano composti di colore diverso a seconda della degradazione di enzimi microbici specifici, assicurando in tal modo la differenziazione diretta di alcune specie o la rilevazione di determinati gruppi di organismi, mediante semplici test di conferma Columbia CNA Agar: Ellner e colleghi hanno documentato lo sviluppo di una formulazione di agar contenente sangue, definito agar Columbia. 4 Questo terreno consente di ottenere colonie di dimensioni più grandi e una crescita maggiore rispetto a quanto avviene su basi agar contenenti sangue paragonabili e viene utilizzato per terreni di coltura contenenti sangue e per formulazioni selettive. Ellner e colleghi hanno riscontrato che un terreno contenente 10 mg di colistina e 15 mg di acido nalidixico per litro in una base di agar Columbia, arricchito con 5% di sangue di montone, facilita la crescita di stafilococchi, streptococchi emolitici ed enterococchi, mentre inibisce la crescita di Proteus, Klebsiella e Pseudomonas spp. 4 L'agar Columbia fornisce un terreno di base altamente nutritivo. L'aggiunta di agenti antimicrobici, colistina e acido nalidixico rende il terreno selettivo per i microorganismi Gram- PA-254489.02-1 -
positivi, soprattutto streptococchi e stafilococchi. Al terreno viene aggiunto sangue di montone per consentire la rilevazione di reazioni emolitiche. 4,5 REAGENTI BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate) Formule approssimative* per litro di acqua purificata CHROMagar Orientation Medium Cromopeptoni 16,1 g Miscela cromogena 1,3 Agar 15,0 ph 6,9 ± 0,2 Columbia CNA Agar Digerito pancreatico di caseina 12,0 g Cloruro di sodio 5,0 g Digerito peptico di tessuto animale 5,0 Agar 13,5 Estratto di lievito 3,0 Colistina 0,01 Estratto di carne bovina 3,0 Acido nalidixico 0,015 Amido di granturco 1,0 Sangue defibrinato di montone 5% ph 7,3 ± 0,2 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento. PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni cromatiche, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 8 C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana se conservate in luogo pulito a 2 8 C. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce prima e durante l'incubazione, in quanto la luce distrugge i cromogeni inclusi in CHROMagar Orientation Medium. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per informazioni più dettagliate, v. ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare le piastre in aerobiosi a 35 37 C per 20 24 h. Ceppi per test CHROMagar Orientation Medium Columbia CNA Agar Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus agalactiae ATCC 12386 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Crescita da buona a eccellente, piccole colonie dal verdazzurro al blu Crescita da discreta a buona; piccole colonie blu Crescita da buona a eccellente, colonie dal bianco al giallastro Crescita da discreta a eccellente, colonie medie, trasparenti, rosa Crescita da buona a eccellente, colonie grigie; assenza di emolisi Crescita da buona a eccellente, colonie dal bianco al grigio; beta-emolisi Crescita da buona a eccellente, colonie biancastre, beta-emolisi Inibizione completa PA-254489.02-2 -
Ceppi per test CHROMagar Orientation Medium Columbia CNA Agar Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 Crescita da buona a eccellente, colonie medie, blu scuro con o senza alone Inibizione da parziale a completa Proteus vulgaris ATCC 8427 Crescita da discreta a eccellente; colonie verdazzurre; il terreno circostante è da ambra a marrone Inibizione da parziale a completa Non inoculate Da incolori a beige chiaro, trasparenti Rosse (color sangue) PROCEDURA Materiali forniti BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (doppie piastre impilate Stacker da 90 mm). Microbiologicamente controllate. Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. Tipi di campioni BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar è utilizzato esclusivamente per l'isolamento, la conta e la differenziazione dei batteri nelle urine. Si può utilizzare l'urina della minzione o del catetere, o quella raccolta mediante puntura vescicale ipogastrica (v. anche PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). Osservare le tecniche asettiche per il prelievo dei campioni urinari. Strisciare l'urina direttamente sul terreno non più tardi di 2 h dopo il prelievo o conservarla in frigorifero (non oltre 24 h) per evitare l'eccessiva crescita di agenti infettivi o contaminanti prima dell'inoculazione del terreno. 6-8 Procedura del test Prelevare un campione di urina ben miscelata e non diluita usando un'ansa calibrata (0,01 o 0,001 ml). Per l'inoculazione dei terreni in piastre doppie è preferibile usare anse da 0,001 ml (= 1 µl). Verificare che l'ansa sia caricata correttamente con il campione. In primo luogo inoculare il campione in una piccola area della superficie di CHROMagar Orientation Medium; quindi inoculare il restante terreno. In seguito, raccogliere un nuovo campione di urine e procedere nello stesso modo per Columbia CNA Agar. Se si utilizzano anse da 10 µl, si consiglia di prediluire dieci volte il campione di urina in soluzione fisiologica sterile. Incubare la piastra inoculata in posizione invertita a 35 37 C in aerobiosi per 20 24 h. Non è consigliabile incubare la doppia piastra in un'atmosfera arricchita di anidride carbonica. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante l'incubazione, in quanto la luce potrebbe distruggere i cromogeni inclusi in CHROMagar Orientation Medium. Una volta che i colori delle colonie si sono sviluppati l'esposizione alla luce è consentita. È obbligatorio l'uso di anse calibrate o altre tecniche comunemente utilizzate per il posizionamento sulla piastra dei campioni di urina al fine di ottenere colonie isolate, con le tipiche forme e colori. Risultati Dopo l'incubazione i terreni dovrebbero presentare colonie isolate nelle aree in cui l'inoculo è stato correttamente diluito. Per l'identificazione o la differenziazione utilizzare lo Schema 1 oppure servirsene come linee guida per ulteriori reazioni di conferma su CHROMagar Orientation Medium. Per la verifica dei risultati possono essere utilizzati una colorazione di Gram o l'indagine microscopica. La crescita di batteri Gram-positivi, se presenti, può avvenire sull'agar Columbia CNA. Per ulteriori informazioni e l'interpretazione della crescita su questo terreno, consultare la bibliografia. 5,9 Test di conferma Eseguire i necessari test di conferma per CHROMagar Orientation Medium (Schema 1). Non applicare reagenti di rilevazione, ad es. il reagente per l'indolo alla DMACA o altri reagenti PA-254489.02-3 -
direttamente sulle colonie in questo terreno. I test devono invece essere eseguiti su filtri di carta con crescita proveniente dalle rispettive colonie. Per le colonie di E. coli non utilizzare reagente Kovac per l'indolo, in quanto il colore di queste colonie può interferire con il colore rosso indice di positività dei test per l'indolo; utilizzare in sostituzione reagente per l'indolo alla dimetilaminocinnamaldeide (DMACA). Se si utilizzano altri test di conferma o sistemi di identificazione biochimici, seguire le relative istruzioni. Calcolo e interpretazione dei risultati 6-9 Contare il numero di colonie (UFC) su ciascun terreno. Se è stata utilizzata un'ansa da 0,001 ml, ogni colonia corrisponde a 1000 UFC/mL di urina. 7 Urina della minzione e del catetere: le direttive vigenti stabiliscono che se un singolo isolato ha una densità di 10 5 UFC/mL è presente infezione, se la densità è <10 5 UFC/mL si ha contaminazione uretrale o vaginale, mentre una densità tra 10 4 e 10 5 UFC/mL rende necessario un riesame alla luce dei dati clinici. I batteri contaminanti in genere appaiono in numero ridotto e in colonie di differenti forme. Urina prelevata mediante puntura vescicale ipogastrica: poiché la vescica è sterile nei soggetti non infetti, le UFC eventualmente osservate indicano la presenza di un'infezione. Gli agenti patogeni del tratto urinario di solito danno luogo a conte elevate, con colore e morfologia delle colonie uniformi in questo terreno di coltura. PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA BD CHROMagar Orientation Medium/Columbia CNA Agar (Biplate) viene utilizzato per l'isolamento, l'identificazione o l'identificazione presuntiva di batteri comunemente responsabili di infezioni del tratto urinario. CHROMagar Orientation Medium è un terreno di coltura cromogeno per l'identificazione diretta, la differenziazione e la conta di agenti patogeni comuni del tratto urinario. Il terreno di coltura è usato per l'isolamento di numerosi microrganismi a crescita aerobica, ad es. Enterobacteriaceae, Pseudomonas e altri bacilli Gram-negativi non fermentanti, enterococchi, stafilococchi e molti altri presenti nei campioni urinari. Consente l'identificazione diretta dell'escherichia coli mediante il colore delle colonie e un test per l'indolo di conferma, oltre all'identificazione diretta dell'enterococco e dello Streptococcus agalactiae mediante il colore delle colonie e un test PYR di conferma o, in alternativa un test di agglutinazione sierologico per la determinazione del gruppo Lancefield. È inoltre possibile identificare altri organismi dopo l'esecuzione di alcuni test di conferma oppure può essere necessaria un'identificazione biochimica completa, a seconda delle specie. Dato che la maggior parte delle infezioni del tratto urinario sono causate da E. coli e/o enterococchi, l'uso di questo terreno di coltura riduce significativamente il carico di lavoro e il tempo necessari per inoculare e leggere i sistemi di identificazione obbligatori quando per l'isolamento si utilizzano terreni di coltura convenzionali. Columbia CNA Agar è un terreno standard per l'isolamento e la coltura di molti microorganismi Gram-positivi a crescita aerobica, ad es. streptococchi, stafilococchi, corineformi, Listeria spp. e altri. 5,7,9 Risultati delle prestazioni 2,10 Sono state condotte due valutazioni indipendenti delle prestazioni di CHROMagar Orientation Medium. In entrambi gli studi il terreno cromogeno ha rilevato più agenti patogeni dei terreni tradizionali utilizzati a confronto. I particolari della prima valutazione sono stati pubblicati e i risultati del primo e del secondo studio sono riportati nel documento delle istruzioni per l'uso di BD CHROMagar Orientation Medium (n. cat. 254102). 2 Limitazioni della procedura CHROMagar Orientation Medium: Le colonie che si presentano del loro colore naturale e non reagiscono con i substrati cromogeni devono essere ulteriormente differenziate con test biochimici o sierologici adeguati. Consultare la bibliografia. 9,11 PA-254489.02-4 -
I bacilli Gram-negativi diversi da quelli appartenenti al gruppo KES possono dare luogo a grandi colonie di colore blu e quindi per la loro identificazione potrebbero essere necessari ulteriori test biochimici. 11 In casi molto rari nell'urina potrebbero essere presenti Listeria monocytogenes o altre specie di Listeria (ad es., in conseguenza di aborto dovuto a questi agenti). La Listeria produce piccole colonie dal blu al verdazzurro. PYR-negative, somiglianti allo Streptococcus agalactiae (vedere lo Schema 1). Pertanto potrebbe essere utile preparare una colorazione di Gram di tutti i ceppi che, su questo terreno di coltura, danno luogo a piccole colonie di colore dal blu al verdazzurro PYR-negative. La presenza di bacilli Gram-positivi può essere indice di Listeria spp. Sono necessari ulteriori test biochimici per accertare la presenza di questi agenti. Molto raramente, gli isolati di Aeromonas hydrophila possono produrre colonie dal rosa al rosa acceso. È possibile differenziarle dall'e. coli mediante un test per l'ossidasi (Aeromonas = positivo; E. coli = negativo). Occasionalmente, le colonie di stafilococchi coagulasi-negativi diversi dallo S. saprophyticus, ad es., S. simulans, S. xylosus e S. intermedius, possono assumere una colorazione dal rosa al rosa acceso. È pertanto necessario eseguire ulteriori test (vedere lo Schema 1) su questi isolati. BD CHROMagar Orientation Medium non supporta la crescita di organismi esigenti, quali Neisseria, Haemophilus o Mycoplasma spp. L'uso di questo terreno di coltura per campioni clinici e non clinici diversi dall'urina non è stato convalidato. Prima di utilizzare per la prima volta BD CHROMagar Orientation Medium, si consiglia di far pratica con l'aspetto di una colonia tipica utilizzando ceppi definiti, ad es. i ceppi citati in CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE. Columbia CNA Agar: su questo terreno possono crescere batteri che mostrano resistenza agli ingredienti selettivi. La Candida ed altri funghi non sono inibiti su questo terreno. Sebbene si tratti di batteri Gram-positivi, gli organismi aerobici che formano spore, ad es. Bacillus spp., possono risultare inibiti in Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood. Benché alcuni test diagnostici possano essere eseguiti direttamente sul terreno, per completare l'identificazione sono necessari test biochimici e, all'occorrenza, immunologici, eseguiti usando colture pure. L'agar Columbia ha un contenuto relativamente alto di carboidrati e quindi gli streptococchi beta-emolitici possono produrre una reazione emolitica verdastra che può essere confusa con l'alfa-emolisi. BIBLIOGRAFIA 1. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury. 1996. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: 1788-1793. 2. Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr. 1997. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 35: 2773-2777. 3. Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: 990-994. 4. Ellner, P.D., C.J. Stoessel, E. Drakeford, and F. Vasi. 1966. A new culture medium for medical bacteriology. Am. J. Clin. Pathol. 45:502-504. 5. MacFaddin, J. F. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria, vol. 1, p. 269-275.Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 6. Barry, A.L., P.B. Smith, and M. Turck. 1975. Cumitech 2, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., T.L. Gavan. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria. 1995. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. PA-254489.02-5 -
8. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti. 1987. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Isenberg, H. D. (ed.). 1992. Interpretation of aerobic bacterial growth on primary culture media, Clinical microbiology procedures handbook, vol.1, p. 1.6.1-1.6.7. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany. 11. Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). 2003. Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate) N. di cat. 254489 Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20 ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès 38800 Le Pont de Claix/France Tel: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292 http://www.bd.com BD, BD logo and Stacker are trademarks of Becton, Dickinson and Company CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection 2003 Becton, Dickinson and Company Schema 1: linee guida per l'aspetto delle colonie, le prestazioni dei test di conferma e la differenziazione o identificazione che ne risulta su BD CHROMagar Orientation Medium Piccole colonie dal verdazzurro al blu Test PYR b rosse (+) incolori (-) a Enterococcus spp. Cocchi: Str. agalactiae Bacilli: Listeria spp. Grandi colonie blu: Gruppo Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES) Identificare le specie con test biochimici Grandi colonie rosa, trasparenti: Test per l'indolo alla DMACA c verdi (+) da incolori a rosse (+) E. coli d Identificare le specie con test biochimici PA-254489.02-6 -
Piccole colonie opache, dal rosa acceso al rosa: Disco di novobiocina da 5 µg e resistente suscettibile Staphylococcus saprophyticus f, S. Xylosus f S. simulans f S. intermedius g Identificare le specie con test biochimici Colonie da incolori a beige su terreno da ambra a marrone h : Gruppo Proteus-Morganella-Providencia (PMP) Test dell'indolo alla DMACA c verdi (+) da incolori a rosa (-) Proteus vulgaris H 2 S + i Proteus mirabilis ( ODC +) j Providencia spp. H 2 S- Proteus penneri (ODC -) Morganella spp. H 2 S - a È consigliata la colorazione di Gram. b Test del piroglutamato per la pirrolidonil arilamidasi. Per il gruppo Lancefield è possibile utilizzare test sierologici anziché il test PYR per la differenziazione di Enterococcus spp. da Streptococcus agalactiae. c DMACA= Reagente alla dimetilaminocinnamaldeide per la produzione di indolo. Applicare il reagente su filtro di carta e strofinare una colonia con l'area contenente il reagente sul filtro di carta. Attendere 10 20 sec. Il colore verde è indice della produzione di indolo (rosso o incolore = negativo). Non utilizzare il reagente Kovac per l'indolo su colonie di colore rosa! d Su tutte le grandi colonie rosa positive all'indolo può essere eseguito un test per l'ossidasi al fine di escludere l'aeromonas (= ossidasi-positiva). e Inoculare per strisciamento una piastra Mueller Hinton II Agar con l'isolato. Posizionare un disco alla novobiocina (da 5 µg) sulla piastra inoculata. Incubare per 18 24 h a 35 37 C e misurare le dimensioni della zona di inibizione (resistente: 16 mm, suscettibile: > 16 mm). f Noti come patogeni umani, possono essere isolati anche dalle urine. g Non è noto se possano essere isolati dalle urine umane. h Il colore dall'ambra al marrone è dovuto alla positività alla triptofano deaminasi (TDA) comune a tutti gli organismi che fanno parte del gruppo PMP. Circa il 50% dei ceppi di P. vulgaris producono colonie blu su terreno da ambra a marrone. i Test convenzionale per l'acido solfidrico. j Test convenzionale per la ornitina decarbossilasi. PA-254489.02-7 -