Le presenti istruzioni si applicano a Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP).

Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Codice K4000 115 ml Codice K4001 110 ml Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. Le presenti istruzioni si applicano a Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP). Questo prodotto è previsto per l uso con gli anticorpi primari di topo forniti dall utente ai fini dell identificazione qualitativa degli antigeni mediante microscopia ottica nei tessuti normali e patologici inclusi in paraffina, nei tessuti al criostato o nelle preparazioni cellulari. Possono essere utilizzati tessuti trattati in una molteplicità di fissativi tra cui etanolo, B-5, fissativo di Bouin, formalina zincata e formalina tamponata neutra. Fare riferimento alle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica o alle Istruzioni del Sistema di rilevamento delle procedure immunoistochimiche per: (1) Principio della procedura, (2) Materiale necessario, non fornito, (3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura di colorazione, (6) Controllo di qualità, (7) Eventuali problemi e risoluzione, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limitazioni generali Sommario e spiegazione Il sistema EnVision+, HRP è una tecnica di colorazione immunoistochimica in due fasi. Questo sistema si fonda su un polimero marcato con HRP che viene coniugato con anticorpi secondari. Il polimero marcato non contiene né avidina, né biotina. Di conseguenza, la colorazione non specifica risultante dall attività endogena dell avidina-biotina nel fegato, nel rene e nei tessuti linfoidi così come nelle sezioni al criostato viene eliminata o significativamente ridotta. Il reagente contenuto in Dako EnVision+, HRP è pronto all uso. Questo sistema è un metodo estremamente sensibile e, di conseguenza, le diluizioni ottimali dell anticorpo primario sono fino a 20 volte maggiori di quelle utilizzate per la tradizionale tecnica PAP e molte volte più grandi di quelle utilizzate per i metodi tradizionali ABC o LSAB. Questo protocollo offre un sistema avanzato di generazione del segnale per l individuazione degli antigeni presenti in concentrazioni ridotte o degli anticorpi primari con titolo basso. Gli anticorpi primari prodotti nel topo reagiscono bene con il polimero marcato. L interpretazione di qualsiasi colorazione positiva o la sua assenza dovrebbe essere completata da studi morfologici e istologici con controlli adeguati. Principi della procedura Reagenti forniti Qualsiasi attività della perossidasi endogena viene repressa incubando i campioni con un appropriato reagente in grado di bloccare la perossidasi endogena. Il campione viene incubato dapprima con un anticorpo primario murino adeguatamente caratterizzato e diluito, quindi con il polimero marcato con due incubazioni sequenziali di 30 minuti. Si ricorda che per gli anticorpi che richiedono la digestione enzimatica o il riconoscimento del bersaglio, potrebbe essere necessario aumentare i tempi di incubazione dell anticorpo primario e del polimero marcato di 5 10 minuti. La colorazione viene completata da un incubazione di 5 30 minuti con un substrato-cromogeno idoneo. Codice K4000: Il materiale seguente è sufficiente per 150 sezioni di tessuto, in base a 100 µl per sezione: Quantità 1x15 ml Descrizione Polimero marcato Polimero marcato con perossidasi coniugato con anti-immunoglobuline murine di capra in tampone Tris/HCl contenente proteina stabilizzate e un agente antimicrobico. Codice K4001: Il materiale seguente è sufficiente per 1100 sezioni di tessuto, in base a su 100 µl per sezione: Quantità 1x110 ml Descrizione Polimero marcato Polimero marcato con perossidasi coniugato con anti-immunoglobuline murine di capra in tampone Tris/HCl contenente proteina stabilizzate e un agente antimicrobico. (107459-004) 302059IT_003p. 1/6

Materiale necessario, ma non fornito Salviettine assorbenti Tessuto di controllo, positivo e negativo Controcolorazione; a base acquosa, come a Mayer s Hematoxylin o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309) Coprioggetti Acqua distillata Etanolo, assoluto e 95% Microscopio ottico (20x 800x) Mezzi di montaggio, come Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount, Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (codice S3025) o mezzo di montaggio permanente non acquoso, Ultramont (codice S1964) Anticorpi primari e reagente di controllo negativo Vetrini, polilisinati oppure Silanized Slides (codice S3003) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 3 40 minuti) Boccette di lavaggio Soluzione tampone di lavaggio Xilene, toluene o derivati dello xilene Per EnVision+, Peroxidase, K4000 o K4001, in aggiunta all'elenco riportato sopra, sono richiesti i seguenti reagenti: Reagente per il blocco della perossidasi endogena, quale Dual Endogenous Enzyme Block (codice S2003) Soluzione cromogeno-substrato, quale AEC+ Substrate-Chromogen, Ready-to-Use (110 ml, codice K3469) o Liquid DAB+ (codice S2002) Materiali opzionali richiesti ma non forniti Idrossido di ammonio, 15 mol/l diluito a 0,037 mol/l PAP Pen (codice S2002) Precauzioni Preparazione del reagente 1. Per operatori specializzati. 2. Non utilizzare reagenti oltre la data di scadenza fissata per il metodo di conservazione prescritto. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate nel foglietto illustrativo del prodotto, l utente deve verificarne le condizioni. 3. Non sostituire con reagenti tratti da altri numeri di lotto o da kit di altri produttori. 4. Gli enzimi e i substrati-cromogeni possono essere alterati se esposti a eccessivi livelli di luce. Non conservare i componenti del kit né procedere alla colorazione in condizioni di luce intensa, come per esempio la luce solare diretta. 5. Rispettare i tempi o le temperature di incubazione specificati per evitare risultati errati; ogni eventuale modifica deve essere convalidata dall utente. 6. Utilizzare le procedure di manipolazione indicate per i prodotti derivati da fonti biologiche. 7. Indossare dispositivi di protezione individuale idonei per evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. 8. La soluzione inutilizzata deve essere smaltita nel rispetto delle disposizioni locali e statali. È opportuno preparare i seguenti reagenti prima della colorazione. Soluzione tampone di lavaggio La soluzione tampone di lavaggio raccomandata per il rilevamento IHC automatico e manuale è la soluzione TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (codice S3006). Le soluzioni TBS, 0,05 mol/l Tris buffered Saline (codice S1968) e PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (codice S3024) sono altre soluzioni tampone di lavaggio idonee per la colorazione manuale. Si sconsigliano le soluzioni tampone di lavaggio contenenti azide sodica. L azide sodica inattiva la perossidasi (HRP) e di conseguenza determina una colorazione negativa. Conservare la soluzione salina inutilizzata a 2 8 C. Eliminare la soluzione tam pone, se appare torbida. Per sciacquare il blocco della perossidasi, il substrato e la controcolorazione è possibile utilizzare acqua distillata. Anticorpo primario Gli anticorpi NP-Series Plus ready-to-use sono ottimizzati e raccomandati per un impiego con i sistemi di rilevamento ad alta sensibilità Dako Plus. Dako fornisce anche anticorpi concentrati. L ottimizzazione degli anticorpi concentrati viene richiesta dall utente finale. Le diluizioni devono essere preparate utilizzando Antibody Diluent (codice S0809) oppure un diluente contenente soluzione tampone Tris-HCI 0,05 mol/l con l 1% di sieroalbumina bovina (BSA). Gli anticorpi Dako N-Series ready-to-use non sono ottimizzati per un impiego con i sistemi di rilevamento Dako Plus. Per la maggior parte degli anticorpi primari utilizzati con questo kit, è sufficiente un tempo di incubazione di 30 minuti. Reagente di controllo negativo Quando si utilizzando anticorpi Dako NP-Series Plus ready-to-use, quale reagente di controllo negativo si raccomanda Universal Negative Control+ ottimizzato per un impiego con anticorpi murini NP-Series Plus ready-to-use (codice NP015). (107459-004) 302059IT_003p. 2/6

Idealmente, un reagente di controllo negativo contiene un anticorpo che non mostra alcuna reattività specifica ai tessuti umani o al siero normale/non immune nella stessa matrice/soluzione dell anticorpo primario diluito. Il reagente di controllo negativo dovrebbe appartenere alla stessa sottoclasse e alla stessa specie animale dell anticorpo primario, diluito alla stessa concentrazione di immunoglobulina o proteina dell anticorpo primario diluito utilizzando lo stesso diluente. Il periodo di incubazione per il reagente di controllo negativo dovrebbe corrispondere all anticorpo primario. Controcolorazione Il prodotto finale colorato della reazione di colorazione è solubile in alcol e dovrebbe essere utilizzato con controcolorazioni su base acquosa come l ematossilina di Mayer o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309). In seguito alla controcolorazione dell ematossilina, sciacquare accuratamente in acqua distillata e poi immergere i vetrini con i tessuti in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l o in un agente azzurrante simile. Il bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l viene preparato miscelando 2,5 ml di idrossido di ammonio 15 mol/l (concentrato) in 1 litro di acqua. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l inutilizzata può essere conservata a temperatura ambiente (20 25 C) in un flacone ben chiuso per 12 mesi. Per indicazioni su procedure di controcolorazione alternative, consultare le linee-guida del produttore. Mezzi di montaggio Per il montaggio in mezzo acquoso si raccomandano Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S3025). Glycergel deve essere portato almeno a una temperatura di 50 C appena prima dell uso. Pu ò inoltre essere utilizzato il mezzo di montaggio permanente non-acquoso Ultramount (codice S1964). Conservazione EnVision+, HRP deve essere conservato a 2 8 C. Non congelare. Non usare dopo la data di scadenza stampata sulle fiale di reagente e sull etichetta del prodotto. L alterazione nell aspetto di qualsiasi reagente, come la precipitazione, può indicare instabilità o deterioramento. In questi casi, non utilizzare il(i) reagente(i). Non esistono segni evidenti che indichino l instabilità dei prodotti. Per questo motivo, i controlli positivi e negativi devono essere testati simultaneamente ai campioni del paziente. Se si dovesse osservare una colorazione inattesa non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e si sospetta un problema relativo al prodotto, contattare il Servizio Tecnico Dako. Preparazione del campione Tessuto incluso in paraffina Fare riferimento alle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica e/o al foglio con le specifiche dell anticorpo. Prima della colorazione IHC, i tessuti devono essere fissati e trattati. La fissazione previene l autolisi e la putrefazione dei tessuti asportati, preserva l antigenicità, accresce l indice di rifrazione dei costituenti dei tessuti e aumenta la resistenza degli elementi cellulari al trattamento dei tessuti. Il trattamento dei tessuti include la disidratazione, l eliminazione degli agenti disidratanti, l infiltrazione dei mezzi di inclusione, l inclusione e il sezionamento dei tessuti. I fissativi più comuni per le preparazioni tissutali IHC sono illustrati nelle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica. Queste sono solo linee guida. Le procedure ottimali devono essere determinate e verificate dall utente. (Per informazioni specifiche riguardanti la fissazione e il trattamento dei tessuti, vedere i riferimenti bibliografici 1 e 2). Procedura di colorazione Note sulla procedura L utente deve leggere queste istruzioni con attenzione e acquisire familiarità con il contenuto del prodotto prima dell uso. I reagenti e le istruzioni fornite sono state studiate per dare risultati ottimali. Ulteriore diluizione del reagente del prodotto o alterazioni dei tempi o delle temperature di incubazione possono portare a risultati errati. Tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20 25 C) prima dell immunocolorazio ne. Preferibilmente, tutte le fasi di incubazioni dovrebbero essere eseguite a temperatura ambiente. Non lasciare andare a secchezza le sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Le sezioni tissutali essiccate possono aumentare il fenomeno di colorazione non specifica. Coprire i vetrini esposti a correnti d aria. In caso di prolungata incubazione, porre i tessuti in un ambiente umido. La sensibilità di EnVision+, HRP può essere ulteriormente aumentata allungando i tempi di incubazione delle Fasi 2 e 3 di 5 10 minuti. Protocollo di colorazione FASE 1: BLOCCO DELLA PEROSSIDASI Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Usando carta bibula (per esempio carta di tessuto (107459-004) 302059IT_003p. 3/6

assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere ogni eccesso di liquido e mantenere il reagente all interno dell area prescritta. Applicare una quantità di Peroxidase Block sufficiente per coprire il campione. Incubare per 5 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata o soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto) e porre in un bagno tamponato fresco. FASE 2: FASE 3: FASE 4: FASE 5: FASE 6: ANTICORPO PRIMARIO O REAGENTE DI CONTROLLO NEGATIVO Eliminare picchiettando il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di anticorpo primario o di reagente di controllo negativo diluiti in modo ottimale sufficiente per coprire il campione. Incubare per 30 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con una soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto) e porre in un bagno tamponato fresco. Se la procedura di colorazione deve essere interrotta, i vetrini possono essere mantenuti in un bagno tamponato dopo l incubazione con l anticorpo primario (fase 2) sino ad un ora a temperatura ambiente (20 25 C) senza alterare il risultato dell a colorazione. POLIMERO MARCATO-HRP ANTICORPO ANTI-TOPO Eliminare picchiettando il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità sufficiente di Labelled Polymer per coprire il campione. Incubare per 30 (±1) minuti. Sciacquare i vetrini come nella fase 2. SUBSTRATO-CROMOGENO Asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità sufficiente di substrato-cromogeno per coprire il campione. Incubare per 5 30 minuti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Raccogliere il substrato-cromogeno da eliminare in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo corretto. CONTROCOLORAZIONE CON EMATOSSILINA (opzionale) Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina acquosa (codice S3309). La lunghezza di incubazione dipende dalla forza dell ematossilina usata. Sciacquare delicatamente in un bagno ad acqua distillata. Immergere i vetrini 10 volte in un bagno di 0,037 mol/l di ammoniaca o di un agente azzurrante simile. Sciacquare i vetrini in un bagno ad acqua distillata o deionizzata per 2-5 minuti. MONTAGGIO I campioni possono essere montati con vetrino coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio su base acquosa come Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount (codice S3025) oppure un mezzo di montaggio permanente non acquoso, Ultramount (codice S1964). Nota: i vetrini possono essere letti quando opportuno. Tuttavia, se i vetrini vengono esposti a luce intensa per un periodo di una settimana, è possibile che si verifichi uno scolorimento. Per ridurre lo scolorimento, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20 25 C). Controllo di qualità Eventuali modifiche al trattamento dei tessuti e alle procedure tecniche nel singolo laboratorio possono causare variazioni significative nei risultati, rendendo necessaria una performance regolare dei controlli interni in aggiunta alle procedure descritte. Vedere le linee guida sul controllo della qualità del College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry e i riferimenti bibliografici da 3 a 5 per ulteriori informazioni. Vedere le specifiche di ogni anticorpo primario utilizzato per i dettagli riguardanti la sensibilità e l immunoreattività. Fare riferimento alle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica per maggiori informazioni sui controlli positivi e negativi. Interpretazione della colorazione Limitazioni Fare riferimento alle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica per le linee guida relative all interpretazione. Fare riferimento alle Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica per le limitazioni generali. L uso di fissativi vecchi o non tamponati o l esposizione dei tessuti al calore eccessivo (superiore a 60 C) durante il trattamento può comportare una ridotta sensibilità alla colorazione. La perossidasi endogena o l attività della pseudoperossidasi può essere rilevata nelle emoproteine come l emoglobina, la mioglobina, il citocromo e la catalasi nonché negli eosinofili. 6,7 Questa attività può essere inibita incubando i campioni con Peroxidase Block per cinque minuti prima dell applicazione dell anticorpo primario. Con questo reagente è possibile trattare anche gli strisci di sangue e midollo osseo e i tessuti congelati. Tuttavia, questa procedura non elimina il pigmento bruno-rossastro delle emoproteine. In alternativa, è possibile impiegare una soluzione di perossido di idrogeno-metanolo. Con questa procedura, (107459-004) 302059IT_003p. 4/6

alcuni antigeni possono divenire denaturati. I tessuti delle persone infette dal virus dell epatite B e contenenti l antigene di superficie del virus dell epatite B (HBsAg) possono mostrare una colorazione non specifica con la perossidasi di rafano. 8 I sieri normali/non immuni tratti dalla stessa fonte animale degli antisieri secondari utilizzati nelle fasi bloccanti possono causare risultati falsamente negativi o falsamente positivi a causa degli auto-anticorpi o degli anticorpi naturali. I reagenti forniti in questo kit sono stati diluiti in maniera ottimale. Ulteriori diluizioni possono causare perdita di rilevamento dell antigene. Eventuali problemi e risoluzione Problema Causa probabile Azione suggerita 1. Nessuna colorazione di qualsiasi vetrino. 2. Colorazione debole su tutti i vetrini. 3. Colorazione di fondo eccessiva in tutti i vetrini. 1a. I reagenti non sono stati utilizzati nell ordine corretto. 1b. Azide sodica. 2a. Le sezioni trattengono troppa soluzione dopo il bagno di lavaggio. 2b. I vetrini non sono stati sottoposti a un incubazione sufficientemente lunga. 3a. I campioni contengono un attività della perossidasi endogena elevata. 3b. Paraffina non completamente rimossa. 3c. Vetrini non accuratamente risciacquati. 3d. Reazione del substrato più veloce del normale a causa p.es. di una temperatura ambiente eccessiva. 1a. Rivedere l applicazione dei reagenti. 1b. Utilizzare un tampone fresco senza azide. 2a. Eliminare delicatamente l eccesso di soluzione prima di asciugare attorno alla sezione. 2b. Rivedere i tempi di incubazione raccomandati. 3a. Utilizzare tempi di incubazione più lunghi per il blocco della perossidasi. 3b. Utilizzare bagni freschi in xilene o toluene. Se più vetrini vengono colorati contemporaneamente, il secondo bagno in xilene dovrebbe contenere xilene fresco. 3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni tampone e boccette di lavaggio. 3d. Utilizzare un tempo di incubazione più breve con la soluzione substratocromogeno. 3e. Le sezioni sono asciugate durante la procedura di colorazione. 3f. Legame non specifico dei reagenti alla sezione di tessuto. 3g. Anticorpo troppo concentrato. 3e. Utilizzare la camera umida. Asciugare solo tre o quattro vetrini per volta prima di applicare il reagente. 3f. Applicare una soluzione bloccante contenente una proteina estranea. 3g. Diluire maggiormente l'anticorpo primario. Riferimenti bibliografici NOTA: Se il problema non può essere attribuito ad alcuna delle suddette cause oppure se l azione correttiva suggerita non risolve il problema, contattare il Servizio Tecnico Dako e chiedere assistenza. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campione sono disponibili in Handbook -Immunochemical Staining Methods 2 (disponibile presso Dako), Atlas of Immunohistology 9 e Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81 2. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. J Clin Pathol 1989;92:6696. 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible (107459-004) 302059IT_003p. 5/6

Ulteriori riferimenti bibliografici source of error in immunohistochemistry. J Clin Pathol 1980;73:626 8. 9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 11/12 (107459-004) 302059IT_003p. 6/6