Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 Clone EP17/EP30 Codice M3652 Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, è destinato all'utilizzo in immunoistochimica. Gli anticorpi anti-citocheratina 8/18 possono rivelarsi utili per l'identificazione dei tumori di origine epiteliale (1). L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione o della sua assenza deve essere completata da studi morfologici usando controlli corretti e deve essere valutata nel contesto dell'anamnesi clinica del paziente e di altri esami diagnostici eseguiti da un patologo qualificato. Sinonimo dell'antigene Cenni introduttivi Reagente fornito Cheratina 8/18 (K8/18) (1), CK8/18 (2). La citocheratina 8/18 (CK8/18) appartiene alla famiglia dei filamenti intermedi, un gruppo eterogeneo di proteine eteropolimeriche associate a 54 geni diversi. I polipeptidi delle citocheratine (CK) sono classificati in due sottofamiglie: acida (tipo I) e neutro-basica (tipo II). Polipeptidi di tipo I e di tipo II si appaiano a formare l'eteropolimero tetramerico maturo. CK18 è una CK di 45 kda appartenente alla sottofamiglia delle CK acide di tipo I, che in genere si associa alla citocheratina di tipo II di 54 kda CK8. La combinazione CK8/18 costituisce una delle citocheratine a basso peso molecolare (LMW-CK, Low Molecular Weight Cytokeratin). CK8/18 è espressa negli epiteli semplici, non stratificati, nelle cellule basali e superficiali dell'epitelio di transizione, nelle cellule secretorie/luminali degli epiteli complessi, nel mesotelio e può essere presente in alcuni tipi di cellule mesenchimali (1). In una data cellula possono essere espressi diversi membri della famiglia delle citocheratine, specifici per tipo cellulare e stato di differenziazione (1). Quasi tutti i carcinomi di origine epiteliale e i mesoteliomi esprimono CK8/18 (2), pertanto, gli anticorpi anti-ck8/18 sono un utile ausilio nella classificazione dei tumori di origine sconosciuta e dei carcinomi scarsamente differenziati (1). Gli anticorpi anti-ck8/18 mostrano un pattern di colorazione citoplasmatico e/o membranoso. È possibile riscontrare una debole espressione focale anche nei tumori mesenchimali, inclusi il tumore associato alla leiomiomatosi, il rabdomiosarcoma, il melanoma maligno, lo schwannoma, il sarcoma di Ewing, il tumore desmoplastico a piccole cellule rotonde, il carcinoma a cellule squamose e il linfoma (3, 4). Fare riferimento al documento General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica) di Dako o alle istruzioni sul sistema di rilevazione per le procedure IHC. Miscela di due anticorpi monoclonali di coniglio fornita in forma liquida come sopranatante di colture cellulari in tampone Tris-HCl 0,05 mol/l, sodio azide 0,015 mol/l, ph 7,2. Contiene una proteina stabilizzante. Clone: EP17 (CK8) and EP30 (CK18). Isotipo: IgG di coniglio. Concentrazione di IgG di coniglio in mg/l: vedere l'etichetta sul flacone. La concentrazione della proteina tra i lotti potrebbe variare senza influenzare la diluizione ottimale. La titolazione di ogni lotto viene confrontata e regolata in base ad un lotto di riferimento per garantire una colorazione immunoistochimica coerente tra i lotti. Immunogeni CK8: peptide sintetico corrispondente ai residui aminoacidici della parte C-terminale della proteina citocheratina 8 umana. CK18: proteina citocheratina 18 umana isolata da cellule HT-29. Specificità CK8/18 è una miscela di due anticorpi monoclonali. In esperimenti di Western blot condotti su lisati di cellule A431, l'anti-ck8, clone EP17, riconosce una banda principale di 52 kda corrispondente al peso molecolare atteso di CK8; l'anti-ck18, clone EP30, riconosce una banda principale di 45 kda corrispondente al peso molecolare atteso di CK18. Precauzioni 1. Per uso professionale. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN 3), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Sebbene alle concentrazioni del prodotto non sia classificata come pericolosa, la sodio azide può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per impedire la formazione di azidi metalliche. 3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 4. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute. 5. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in materia. (124408-002) P02831IT_02_M3652/2013.12 p. 1/5
Conservazione Conservare a 2-8 C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sul flacone. Nel caso in cui i reagenti vengano conservati diversamente da quanto specificato, le condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto. Pertanto, è necessario analizzare gli opportuni controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Se si osserva una colorazione inattesa non imputabile a variazioni delle procedure di laboratorio e si sospetta un problema associato all'anticorpo, contattare l'assistenza tecnica Dako. Guida rapida* Passaggio Commenti Fissazione Formalina N/A Pretrattamento EnVision FLEX, High ph (codici K8000/K8004) HIER 20 min, 3-in-1 con PT Link e PT Link Rinse Station Diluizione 1:50 Incubazione 20 min Tampone di Dako Antibody Diluent (codice S0809) Diluire immediatamente prima dell'uso diluizione Controllo negativo Negative Control, Rabbit IgG (codice X0936) Incubazione 20 min Visualizzazione Colorazione di contrasto Tessuto di controllo EnVision FLEX, High ph (codice K8000/K8010) EnVision FLEX Hematoxylin (codici K8008/K8018) Fegato normale 20 min di incubazione, 2 x 5 min di incubazione con DAB+ 5 min di incubazione Colorazione citoplasmatica/membranosa Vetrini FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) Consigliati per applicazioni in cui è richiesta una maggiore aderenza delle sezioni di tessuto ai vetrini. Montaggio È richiesto il montaggio permanente e non acquoso Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente. Strumentazione Autostainer Link 48 e Autostainer Plus Utilizzare fiale specifiche per lo strumento (codici SK200-SK203 e S3425) *Si raccomanda all'utente di leggere sempre il foglietto informativo contenuto nella confezione per istruzioni dettagliate sulla procedura di colorazione e la manipolazione del prodotto. Preparazione dei campioni Sezioni in paraffina: è possibile utilizzare l'anticorpo per la marcatura delle sezioni di tessuto incluse in paraffina e fissate in formalina. I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm. Pretrattamento: è necessario il pretrattamento di sezioni di tessuto incluso in paraffina e fissato in formalina con la tecnica dello smascheramento antigenico termoindotto (HIER). Per risultati ottimali, eseguire il pretrattamento dei tessuti con HIER utilizzando la soluzione diluita EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (codice K8004). La deparaffinazione, la reidratazione e lo smascheramento dell'epitopo possono essere eseguiti in Dako PT Link (codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Per PT Link, attenersi a seguenti parametri: temperatura di preriscaldamento: 65 C; temperatura e tempo per smascheramento antig enico: 97 C per 20 (±1) minuti; raffreddamento fino a 65 C. Ri muovere il rack per vetrini dal serbatoio PT e immergere immediatamente i vetrini in una vaschetta o in un serbatoio (ad esempio PT Link Rinse Station, codice PT109) contenente il tampone EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (codice K8007) diluito, a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini nel Wash Buffer per 1-5 minuti. Le sezioni di tessuto non devono essiccarsi durante il trattamento o durante la successiva procedura di colorazione immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020). Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente. (124408-002) P02831IT_02_M3652/2013.12 p. 2/5
Procedura di colorazione Interpretazione dei risultati della colorazione Diluizione: la diluizione consigliata di Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, codice M3652, è 1:50.Diluire l'anticorpo in Dako Antibody Diluent (codice S0809). Incubare le sezioni di tessuto pretrattate per 20 minuti a temperatura ambiente. Queste informazioni sono fornite esclusivamente come linee guida. Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato, pertanto dovranno essere convalidate autonomamente da ogni laboratorio. Controllo negativo: il reagente di controllo negativo consigliato è Dako Negative Control, Rabbit IgG (codice X0936), diluito alla stessa concentrazione di Ig dell'anticorpo primario. A meno che la stabilità dell'anticorpo e del controllo negativo diluiti non sia stata determinata nella procedura effettiva di colorazione, diluire tali reagenti immediatamente prima dell'uso. I controlli positivi e negativi devono essere analizzati insieme ai campioni dei pazienti. Visualizzazione: il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX, High ph (codice K8000/K8010) in incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Attenersi alla procedura prevista per il(i) sistema(i) di visualizzazione prescelto(i). Automazione: l'anticorpo è idoneo per le procedure di colorazione immunoistochimica su piattaforme automatizzate come, ad esempio Dako Autostainer, Autostainer Plus, Autostainer Link e PT Link per il pretrattamento. Colorazione di contrasto: la controcolorazione consigliata è EnVision FLEX Hematoxylin (codici K8008/K8018). Per risultati ottimali, si consiglia di utilizzare un mezzo di montaggio permanente non acquoso. Controlli: i tessuti di controllo positivo e negativo devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve includere tessuto epatico normale e le cellule/strutture devono mostrare i pattern di reazione descritti per il tessuto in questione nella sezione "Caratteristiche di prestazione". Il pattern di colorazione cellulare è di tipo citoplasmatico/membranoso. (124408-002) P02831IT_02_M3652/2013.12 p. 3/5
Caratteristiche di prestazione Tessuti normali: Le cellule epiteliali mostrano una reazione di colorazione da moderata a forte con pattern citoplasmatico e/o membranoso (5). Tenere presente che è possibile osservare la colorazione delle cellule reticolari nei tessuti linfoidi. Surrene 3/3 Pancreas 3/3 Midollo osseo 0/3 Paratiroide 3/3 Mammella 3/3 Ipofisi 1/3 Cervelletto 0/3 Prostata 3/3 Cervello 0/3 Ghiandola salivare 3/3 Cervice 1/3 Muscolo scheletrico 0/3 Colon 3/3 Cute 3/3 Esofago 3/3 Intestino tenue 3/3 Cuore 0/3 Milza 3/3 Rene 3/3 Stomaco 3/3 Fegato 3/3 Testicolo 2/3 Polmone 3/3 Timo 3/3 Cellule mesoteliali 2/3 Tiroide 3/3 Nervo, periferico 0/3 Tonsilla 3/3 Ovaio 3/3 Utero 1/3 Tessuti anomali: Le cellule epiteliali mostrano una reazione di colorazione da moderata a forte con pattern citoplasmatico e/o membranoso (41/56) (6). Carcinoma epatocellulare 3/3 Melanoma 0/3 Carcinoma renale a cellule 3/3 Carcinoma indifferenziato 1/3 chiare Carcinoma renale papillare 3/3 Leiomiosarcoma (1) 0/1 Adenocarcinoma polmonare 2/2 Rabdomiosarcoma (1) 0/1 (2) Carcinoma polmonare a 1/1 Carcinoide intestinale (2) 2/2 cellule squamose (1) Carcinoma polmonare a 3/3 Carcinoma ovarico (2) 2/2 piccole cellule Adenocarcinoma gastrico 3/3 Tessuto fibrotico (2) 0/2 Adenocarcinoma pancreatico Carcinoma papillare della tiroide Carcinoma duttale della mammella Carcinoma lobulare della mammella Adenocarcinoma della prostata Adenocarcinoma del colon 3/3 Teratoma - maturo (1) 0/1 3/3 Teratoma - immaturo (1) 0/1 3/3 Leiomioma (2) 1/2 3/3 Linfoma diffuso a grandi 0/2 cellule B (2) 2/3 Linfoma a cellule T (2) 0/2 3/3 Linfoma follicolare (2) 0/2 (124408-002) P02831IT_02_M3652/2013.12 p. 4/5
Bibliografia 1. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol 2008;129: 705-33. 2. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia,PA: Churchill Livingstone, 2002. 3. Adams H, Schmid P, Dirnhofer S, Tzankov A. Cytokeratin expression in hematological neoplasms: A tissue microarray study on 866 lymphoma and leukemia cases. Pathol Res Pract 2008;204:569-73. 4. Lane EB, Alexander CM. Use of keratin antibodies in tumor diagnosis (review). Semin Cancer Biol 1990; 1:165-79. 5. Yu J. Report of Normal Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19056. 6. Yu J. Report of Cancer Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19756. Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 (CK8/18), Clone EP17/EP30 has been created by Epitomics Inc., using Epitomics proprietary rabbit monoclonal antibody technology covered under Patent Nos 5,675,063 and 7,402,409. Edizione 04/14 (124408-002) P02831IT_02_M3652/2013.12 p. 5/5