ALLwell Ingenasa Ingezim Gluten Quick

ALLwell Ingenasa Ingezim Gluten Quick ELISA kit Cat. N. LFD030-Q TEST immunoenzimatico per la rivelazione quantitativa del glutine in campioni alimentari ed ambientali Manuale d uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all uso del kit Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy (: +39 059 8637161 : +39 059 7353024 *: laboratorio@generon.it : www.generon.it [1] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

1 Principio del test Il test si basa sulla tecnica ELISA utilizzando la metodica del doppio anticorpo coniugato con un enzima per la rivelazione immunoenzimatica dell analita di interesse. La tecnica viene brevemente descritta di seguito. I pozzetti della piastra ELISA sono rivestiti con l'anticorpo monoclonale R5, che riconosce specificamente un epitopo comune per le gliadine, le secaline e le ordeine. L aggiunta del campione nei pozzetti della piastra permette all anticorpo di legarsi alle gliadine presenti. Dopo una fase di lavaggio è aggiunto un secondo anticorpo monoclonale R5 specifico per gliadina coniugato con una perossidasi. Questo anticorpo monoclonale si lega alle gliadine, attraverso l utilizzo della perossidasi e del substrato TMB si ha lo sviluppo di una reazione colorimetrica. Il cambio di colorazione da blu, dopo l aggiunta del substrato TMB, a giallo, dopo l aggiunta della soluzione bloccante viene misurato attraverso un lettore di piastre ELISA. Il contenuto di gliadina nei campioni è determinato dalla interpolazione dei valori di OD con la curva di calibrazione, costruita mediante l utilizzo di standard forniti con il kit. Il limite si rilevabilità del test è di 3 ppm di glutine. 2 Componenti del Kit Materiale non presente nel kit: - etanolo - acqua distillata Reagente Unità Volumi Piastra da microtitolazione ELISA da 96 pozzetti (12x8) coniugata con anticorpo monoclonale specifico per gliadina, secalina e ordeina. Vial con Standard Europeo di gliadina: soluzioni da 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml. Pronte all uso. 1 96 pozzetti 5 1.5 ml Controllo negativo. Pronto all uso. 1 1.5 ml Anticorpo anti gliadina, secalina, ordeina coniugato con perossidasi. Pronto all uso. 1 flacone di soluzione di estrazione. Pronto all uso. 1 15 ml 1 110 ml 1 flacone di soluzione di lavaggio concentrata 25X. 1 65 ml 1 flacone di soluzione diluente concentrata 5X. 1 65 ml 1 flacone di soluzione di TMB. 1 15 ml 1 flacone di soluzione di arresto (H 2 SO 4 0.5 M). 1 15 ml [2] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

3 Precauzioni e avvertenze 1. Leggere attentamente le istruzioni d'uso. 2. Portare i reagenti a temperatura ambiente (22-25 C) prima dell'uso. 3. Non mescolare i reagenti o seguire istruzioni di diversi kit. 4. Evitare la contaminazione dei reagenti del kit. 5. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza e non mescolare componenti di diversi lotti. 6. Non mangiare, bere, o fumare durante la manipolazione di reagenti o campioni. 7. Non pipettare con la bocca. 8. Utilizzare un nuovo puntale per ogni nuovo campione. 9. Per ogni test eseguito allestire una nuova curva standard e relativi controlli. 10. IMPORTANTE: Il substrato cromogeno TMB deve essere maneggiato con cura in quanto è molto sensibile alla luce e alle contaminazioni: prelevare dal flacone una quantità sufficiente per il test e riporlo in un contenitore scuro prima della fase di colorazione del campione. 11. La soluzione di arresto è un acido forte e quindi deve essere maneggiata con cura. 12. Tutti i componenti del kit devono essere conservati tra 2-8 C. Informazioni sulla fase di lavaggio La procedura può essere fatta utilizzando una pipetta multicanale adatta per dispensare un volume di 300 µl in ogni pozzetto o un lava-piastre automatico. Dopo i periodi di incubazione, le fasi di lavaggio devono essere eseguite seguendo le istruzioni riportate di seguito: Eliminare il contenuto della piastra girando rapidamente la piastra al fine di evitare il possibile scambio di contenuti da un pozzetto all'altro. Erogare un volume di 300 µl di soluzione di lavaggio in ogni pozzetto. Agitare delicatamente la piastra avendo cura di evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. Svuotare i pozzetti della piastra girandola, effettuare il corretto numero di lavaggi come riportato nelle istruzioni. Prima di svuotare il contenuto dell'ultima fase di lavaggio, verificare che il reagente successivo da aggiungere alla piastra sia pronto per essere utilizzato. Non lasciate la piastra asciugare più di quanto sia strettamente necessario. Per rimuovere completamente il liquido in eccesso al termine dei lavaggi utilizzare della carta assorbente su cui capovolgere la piastra. 4 Preparazione dei reagenti Soluzione di lavaggio: Diluire una parte della soluzione di lavaggio concentrata fornita nel kit con 24 parti di acqua distillata o deionizzata. Una volta preparata, questa soluzione rimane stabile se conservata a +4 C. Soluzione diluente: Diluire una parte della soluzione di lavaggio concentrata fornita nel kit con 4 parti di acqua distillata o deionizzata. Una volta preparata, questa soluzione rimane stabile se conservata tra +2 C e +8 C. Anticorpo Coniugato, Controllo Negativo e Standard: vengono forniti pronti per l'uso. Non diluire. Aggiungere 100 µl di ciascun reagente direttamente nel pozzetto. [3] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

5 Preparazione dei campioni IMPORTANTE: per i campioni contenenti cioccolato e per campioni ambientali (tamponi) deve essere utilizzato un apposito protocollo di estrazione. Per analisi su altri tipi di matrice non riportati espressamente nel protocollo consultare i tecnici Generon (www.generon.it email: laboratorio@generon.it). Procedura di estrazione per prodotti sottoposti a trattamento termico o contenenti soia. 1. Pesare 0.25 g di campione macinato e trasferirlo in un tubo da 10 ml. 2. Aggiungere 2.5 ml di soluzione di estrazione nel tubo contenente il campione. 3. Chiudere il tubo e coprire il tappo con del parafilm per evitare l'evaporazione. 4. Mescolare accuratamente con il vortex (5-10 secondi) e posizionare i tubi in un rack. 5. Incubare le provette tra 20 e 60 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo di incubazione vortexare il campione 2-3 volte. 6. Aprire i tubi, aggiungere 7.5 ml di etanolo 80%. Mescolare per favorire la dispersione della soluzione, vortexare i campioni i campioni da 10 a 60 secondi e incubare 20-60 minuti a temperatura ambiente in agitazione (è consigliato un agitatore orbitale 45 giri/minuto). 7. Centrifugare le provette per 10 minuti a 2000-2500g a temperatura ambiente. 8. Trasferire il surnatante in una tubo da 10 ml. La soluzione è ora pronta per il test ELISA. Procedura di estrazione per prodotti non sottoposti a trattamento termico o non contenenti soia. 1. Pesare 0.25 g di un campione macinato e collocarlo in un tubo da 10 ml. 2. Aggiungere 10 ml di etanolo 60% e incubare per 20-60 minuti a temperatura ambiente con agitazione. 3. Proseguire come al punto 8 della procedura di estrazione per i prodotti sottoposti a trattamento termico o contenenti soia. Attenzione: i campioni estratti possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 7 giorni prima di eseguire il test ELISA. Per evitare l'evaporazione chiudere i tubi con parafilm. Prima di effettuare il test ELISA i campioni devono essere diluiti come segue: 1. Per campioni con contenuto stimato di glutine inferiore a 10 ppm: fare una diluizione 1/12.5 utilizzando la soluzione diluente del kit. 2. Per campioni con contenuto stimato di glutine tra 10-100 ppm fare una diluizione 1/25. 3. Per campioni con contenuto stimato di glutine oltre 100 ppm fare una diluizione 1/50. Protocollo per allestire le diluizioni: 1/12.5 = 920 μl di soluzione diluente + 80 μl di campione 1/25 = 960 μl di soluzione diluente + 40 μl di campione 1/50 = 980 μl di soluzione diluente + 20 μl di campione Per campioni di cui non si ha una stima è raccomandata una diluzione 1/25. [4] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

6 Esecuzione del test 1. Prima di iniziare il test portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-25 C). 2. Aggiungere 100 μl del campione diluito. Si consiglia di operare in duplicato. 3. Aggiungere 100 μl di standard e di controllo negativo. Incubare 20 minuti a temperature ambiente (22-25 C). 4. Lavare 6 volte seguendo la procedura riportata al paragrafo 3: precauzioni e avvertenzeinformazioni sulla fase di lavaggio. 5. Aggiungere 100 μl di coniugato a ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e incubare 20 minuti a temperatura ambiente (22-25 C). 6. Effettuare le operazioni di lavaggio per 6 volte seguendo la procedura precedentemente descritta. 7. Utilizzando una pipetta multistep, aggiungere 100 μl di substrato TMB in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. 8. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto in ogni pozzetto nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il substrato. Una reazione positiva porterà ad un cambiamento di colore: da blu a giallo. 9. Leggere la densità ottica di ciascun pozzetto a 450 nm entro 5 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di arresto. [5] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

7 Lettura e interpretazione dei risultati Validità del test Il test può essere considerato valido quando il valore OD dello standard 50 ng/ml è superiore a 1.5 e il valore OD del controllo negativo è inferiore a quello dello standard 3.12 ng/ml. Interpretazione dei risultati Il valore OD del campione deve essere calcolata come media aritmetica dei valori di OD dei duplicati. Realizzare la curva standard utilizzando la media aritmetica dei valori di OD ottenuti per i cinque standard (asse delle ascisse) e i loro corrispondenti valori ng/ml (asse delle ordinate).determinare la concentrazione di gliadina nel campione (C) interpolando il valore di assorbanza del campione con la curva standard. Il contenuto (ppm) di glutine in un campione viene calcolato come segue: dove: ppm di glutine = C x D x 2 x 40/1000 C è la concentrazione di gliadina nel campione calcolata dalla interpolazione con la curva standard ng/ml. D è il fattore di diluizione del campione (12. 5, 25, 50). 2 è un fattore applicato per poter esprimere i risultati come concentrazione di glutine (invece che di gliadina). 40 è il fattore di diluizione applicato nella preparazione dei campioni (0.25 g in 10 ml di soluzione di estrazione). 1/1000: è il valore di conversione da ng/ml a ppm. Informazioni aggiuntive Per assicurarsi che i calcoli ottenuti siano corretti, i valori di assorbanza dei campioni devono essere compresi nell'intervallo dei valori OD della curva standard. Potrebbe essere necessario ripetere il test utilizzando diverse diluizioni dei campioni per ottenere questi risultati. E importante applicare il corretto fattore di diluizione nel calcolo dei risultati per ottenere valori corretti. Solo nel caso in cui il valore di OD del campione sia significativamente superiore a quello del punto standard a 50 ng/ml (fino al 15%) il test può considerarsi valido. [6] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

7 Esempio 1) OD del controllo negativo = 0.13 2) OD degli standard ng/ml Abs450 50 2.768 25 1.660 12.5 1.039 6.25 0.717 3.12 0.361 3) La concentrazione di gliadina (C) nel campione può essere ottenuta estrapolando il valore OD del campione dalla interpolazione con la curva standard o utilizzando un software appropriato. Per esempio: Software: Excel (Microsoft). Una volta ottenuti i valori standard gliadina OD, clicca su "Inserisci Grafico". Selezionare il tipo di grafico: "XY (dispersione) ". Fare clic sulla finestra "Grafico" e quindi selezionare "Aggiungi linea tendenza". Nel scheda "Tipo", fare clic su "Polinomiale". Nella scheda "Opzioni", cliccare su "Visualizza la formula nella tabella". In questa equazione, sostituire l'incognita "x" con il valore OD del campione. Campione Diluizione (D) Valori Densità Ottica (OD) ng/ml C* Ppm glutine 1 12.5 0.21 < 3.12 < 3 2 12.5 0.500 4 4 3 25 0.893 10 20 4 50 2.817 51.5 103 5 50 2.532 44 176 * Ottenuto mediante sostituzione di X nella linea di tendenza dei valori OD. [7] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016

8 Guida rapida 1. I reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (22-25 C) prima di iniziare il test. 2. Aggiungere 100 μl dei campioni (preparati e diluiti come descritto nelle istruzioni) nei pozzetti in duplicato. 3. Aggiungere 100 μl di standard e di controllo negativo. Sigillare la piastra con pellicola adesiva. 4. Incubare a temperatura ambiente (22-25 C) per 20 minuti. 5. Lavare i pozzetti 6 volte con la soluzione di lavaggio diluita per rimuovere i reagenti non legati. 6. Aggiungere 100 μl di Mab coniugato con perossidasi in ogni pozzetto. Sigillare con pellicola adesiva. 7. Incubare a temperatura ambiente (22-25 C) per 20 minuti. 8. Lavare i pozzetti 6 volte con la soluzione di lavaggio diluita per rimuovere il coniugato non reattivo. 9. Aggiungere 100 μl di substrato (TMB) a ciascun pozzetto. 10. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. 11. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto in ogni pozzetto. 12. Effettuare la lettura dell'assorbanza a 450 nm. 9 Esclusione di responsabilità Generon non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali, o spese che derivano direttamente o indirettamente dall`uso di questo prodotto. L'acquirente ha la piena responsabilità per il corretto uso del prodotto. Questo documento contiene informazioni che sono di proprietà di Ingenasa. L acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a condizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit. [8] User Manual ALLwell Ingezim Gluten Quick Kit Rev. 1 04/01/2016