Chi siamo Grazie alle proprie conoscenze interdisciplinari di elevata qualità, Cyanagen è la maggior azienda italiana per quanto riguarda lo sviluppo di marcatori fluorescenti e di substrati chemiluminescenti. Con un catalogo con più di 100 diversi marcatori fluorescenti pronti all uso e la possibilità di combinarli con più di 60 tra crosslinker e reagenti per la biotinilazione, Cyanagen può espandere drasticamente le vostre possibilità di sviluppo di saggi. Cyanagen è certificata in accordo al sistema di gestione della qualità. ISO 9001.
Manuale del prodotto WESTAR EtaC Substrati chemiluminescenti per Western Blot www.cyanagen.com
Sommario 1. Introduzione 5 Stoccaggio/scadenza Guida alla scelta del substrato WESTAR 2. Componenti ed altri materiali richiesti 6 Componenti del kit Altre soluzioni necessarie Dispositivi di acquisizione di immagine compatibili 3. Elettroforesi.....7 4. Preparazione della membrana di trasferimento 7 5. Trasferimento alla membrana 8 Voltaggio o corrente costante durante il trasferimento? 6. Colorazione della membrana (opzionale) 7. Bloccaggio della membrana 9 8. Incubazione dell anticorpo 10 Diluizioni dell anticorpo suggerite 9. Rivelazione chemiluminescente 11 Film per autoradiografia o dispositivi di acquisizione di immagini? 10. Risoluzione dei problemi 12 Elevato rumore di fondo della membrana Macchie nere irregolari Assenza di bande o bande deboli Bande non specifiche Bande bianche o bande fantasma Bande irregolari o frastagliate 11. Informazioni per l ordine 15
1. Introduzione L'ossidazione del luminolo catalizzata da perossidasi produce un debole lampo di luce a 425 nm. L'incorporazione di un mediatore di trasferimento di elettroni nel tampone forza il segnale di flash in un bagliore prolungato e migliora notevolmente le caratteristiche analitiche della reazione in termini di maggiore intensità del segnale e durata. 1,2 Studi recenti 3-6 hanno dimostrato che, aggiungendo un appropriato catalizzatore di acilazione, si osserva un ulteriore forte aumento dell intensità della luce emessa. I reagenti di rivelazione WESTAR sono un substrato non isotopico, basato sulla chemiluminescenza del luminolo, progettati per la rilevazione chemiluminescente di proteine ed acidi nucleici immobilizzati, coniugati con perossidasi di rafano (HRP). WESTAR è destinato esclusivamente a scopo di ricerca, e non deve essere usato nelle procedure cliniche, o per scopi diagnostici. Riferimenti: 1. Kricka, L.J. (2000) Methods Enzymol. 305, 370-390. 2. Heindl, D. and Josel, H.P. (1997) Non-radioactive Analysis of Biomolecules, 258-261. Springer, Berlin. 3. Marzocchi, E., Grilli. S., Della Ciana, L., Prodi, L., Roda, A. and Mirasoli, M., (2008) Anal. Biochem., 377, 189-194. 4. Vdovenko, M. M., Della Ciana, L., Sakharov, I. Yu., (2009) Anal. Biochemistry, 392, 54-58. 5. Vdovenko, M. M., Della Ciana, L., Sakharov, I. Yu., (2010) Biotechnology Journal, 5(8),886-90. 6. Vdovenko, M.M., Zubkov, A.V., Kuznetsova, G.I., Della Ciana, L., Kuzmina, N.S., Sakharov, I. Yu., (2010) J Immunol Methods, 362 (1-2), 127-130. Stoccaggio/scadenza Al ricevimento conservare a 4 C. Guida alla scelta del substrato WESTAR WESTAR Supernova EtaC Ultra EtaC Nova 2011 ECL-SUN Intensità del segnale Durata del segnale Estrema Molto Alta Alta Media Standard Breve Moderata Buona Lunga Molto Lunga Quantità di proteina Abbondanza molto bassa Bassa abbondanza Media abbondanza Alta abbondanza Alta Abbondanza
2. Componenti ed altri materiali richiesti Componenti del Kit Solution A: Soluzione Luminolo/Intensificatore (bottiglia ambrata) Solution B: Soluzione di perossido (bottiglia bianca) Altre soluzioni richieste Soluzione Tampone di Corsa Tampone di Trasferimento Tampone TBS-T Tampone di Bloccaggio Soluzione di macchiatura Ponceau Preparazione Per 1L di Tampone di Corsa 10x Per 1L di Tampone di Corsa: (stock): 100mL di Tampone di Corsa 10x 30,3 g TRIS (250mM) Diluire ad 1L con acqua distillata 144,0 g Glicina (1.9M) 10,0 g SDS (1% w/v) Diluire ad 1L con acqua distillata Per 1L di Tampone di Trasferimento Per 1L di Transfer Buffer: 10x (stock): 100mL di Tampone di 30,3 g TRIS (250mM) Trasferimento 10x 144,0 g Glicina (1,9M) 200mL di metanolo Diluire ad 1L con acqua distillata Diluire ad 1L con acqua distillata Per 1L of Tampone TBS-T 10x (stock): Per 1L of Tampone TBS-T: 24,23 g TRIS-HCl (20mM) 100 ml of 10 TBS Buffer 80,06 g NaCl (136mM) Aggiungere 1 ml di Tween-20 sotto Diluire a 800mL con acqua distillata agitazione. Aggiungere NaOH 1M fino a ph Diluire ad 1L con acqua distillata circa 7,6. Diluire ad 1L con acqua distillata Con il 5% di latte in polvere senza Con il 5% di BSA: grassi: 5 g BSA (Cohn frazione V) 5 g di latte in polvere senza grassi Sciogliere in 100 ml di Tampone Sciogliere in 100 ml di Tampone TBS-T 1 TBS-T 1 Per 100mL di soluzione di Per 1L di soluzione di macchiatura macchiatura Ponceau 10x (stock): Ponceau: Sciogliere 0,5 g Ponceau S in 1,0 ml 100 ml of soluzione di 10x Ponceau di acido acetico glaciale S staining solution Diluire a 100 ml con acqua distillata Diluire a 1L con acqua distillata Avvolgere la bottiglia in foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce Dispositivi di acquisizione di immagini compatibili ImageQuant LAS-4000/Mini (GE Healthcare) DIAS-II (SERVA) ChemiDocXRS e VersaDoc (BIO-RAD) ChemiImager (Alpha Innotech) Image Station 2000/40000MM (Kodak) FOTO/Analyst Luminary/FX Systems (Fotodyne) LAS-3000 (Fujifilm) UVIchemi e UVIprochemi (UVItec Ltd.) G:BOX/GeneGnome (Syngene) Odyssey FC (LI-COR)
3. Elettroforesi i. Preparare una soluzione fresca di Tampone di Corsa. ii. Caricare i gel facendo attenzione a mantenere una tenuta ottimale tra il gel-cast e la guarnizione. iii. Versare il Tampone di Corsa nel mezzo dei gel e controllare per eventuali perdite. iv. Versare il resto del Tampone di Corsa nel fondo del serbatoio. v. Rimuovere i pettini e usare una pipetta per pulire tracce di acrilamide non polimerizzata. vi. Caricare uno Standard di Peso Molecolare in un pozzetto. vii. Caricare i campioni nel resto dei pozzetti e riempire eventuali pozzetti vuoti con lo stesso tampone dei campioni. viii. Effettuare la corsa a 90 130 V a voltaggio costante fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. Se la corrente è troppo alta si notano effetti quali la formazione di una banda arcuata e/o sbavata (banda diffusa). 4. Preparazione della membrana di trasferimento Se si usa una membrana di nitrocellulosa deve essere immersa lentamente in acqua distillata, con un estremità a 45. Se è inserita in acqua troppo rapidamente, l aria rimane intrappolata e le proteine non si trasferiranno in quest area. Quando la membrana è umida, equilibrare in Tampone di Trasferimento per 15 min. Se si utilizza membrana di PVDF, attivarla con metanolo per 30 secondi. Sciacquare con acqua distillata ed equilibrare in Tampone di Trasferimento per 15 min. Per proteine >15 kda utilizzate una membrana con porosità 0,45 µ Per proteine <15 kda utilizzate una membrana con porosità 0,45 µ NOTA: Proteine a basso peso molecolare (<15kDa) sono a volte trasferite attraverso le membrane di nitrocellulosa, quindi possono non essere visibili sul blot. La membrana di PVDF ha una capacità di legame per le proteine superiore alla membrana di nitrocellulosa ed è consigliato per la migliore sensibilità di rivelazione.
5. Trasferimento sulla membrana i. Bagnare quattro fogli di carta da filtro in Tampone di Traferimento. ii. Assemblare il sandwich di trasferimento in un vassoio abbastanza grande da contenere la cassetta di plastica per il trasferimento. Riempire con il Tampone di Trasferimento. iii. Collocare il primo foglio di spugna sul lato nero della cassetta di trasferimento e poi due fogli di carta da filtro bagnati al di sopra. iv. Sistemare il gel e inumidirne la superficie con il Tampone di Trasferimento. v. Collocare la membrana bagnata sul lato superiore del gel, poi eliminare delicatamente tutte le bolle di aria. Le proteine inizieranno a trasferire appena il gel è collocato sulla membrana, pertanto il suo riposizionamento può generare un immagine sbavata. vi. Collocate altri due fogli di carta da filtro bagnati sopra la membrana e rimuovere tutte le bolle di aria. vii. Completare l assemblaggio collocando l ultimo foglio di spugna bloccando la parte superiore della cassetta di trasferimento. viii. Riempite il serbatoio di trasferimento con Tampone di Trasferimento e inserite la cassetta di trasferimento. ix. Mettere un panetto di raffreddamento nel serbatoio di trasferimento e circondarla con ghiaccio in una scatola di polistirolo. x. Attuare il trasferimento con le seguenti impostazioni: Trasferimento umido: 80 100 V per 30 60 min. Trasferimento semi-secco: 15 25 V per 20 30 min. xi. Quando il trasferimento è completo, rimuovere la membrana e indicare il suo orientamento tagliandone un angolo. xii. Lavare la membrana due volte con acqua distillata. Voltaggio o corrente costante durante il trasferimento? La composizione del buffer cambia in seguito all eluizione dei sali dal gel, provocando un aumento della corrente e un calo della resistenza. Un trasferimento effettuato a corrente costante comporta una diminuzione della tensione nonché della resistenza (I = V/R). Pertanto, l'uso di tensione costante fornisce la migliore forza motrice durante il trasferimento. Tuttavia, quando la corrente supera i 500mA a voltaggio costante impostato, il raffreddamento del gel è fondamentale per evitare il riscaldamento di Joule nel serbatoio. Page 8 WESTAR EtaC
6. Colorazione della membrana (opzionale) i. Colorare la membrana utilizzando Rosso Ponceau per cinque minuti a temperature ambiente al fine di determinare l efficienza del trasferimento. ii. Sciacquare la membrana in acqua distillata finché le bande delle proteine sono distinte. iii. Scansionare la membrana se lo si desidera. iv. Decolorare completamente la membrana immergendola per 10 min in un grande volume di acqua distillata. v. Riattivare la membrana di PVDF con metanolo, poi lavarla con Tampone TBS-T. NOTA: Riattivare la membrana dopo la macchiatura. Il limite di rivelabilità per la soluzione Ponceau è di 250 ng di proteina. 7. Bloccaggio della membrana i. Collocare la membrana con la proteina sul lato superiore in un nuovo vassoio con il Tampone di Bloccaggio di vostra scelta. Incubare la membrana in Tampone di Bloccaggio per 30 60 min agitando dolcemente con uno scuotitore/agitatore. ii. Non si dovrebbe superare un tempo massimo di bloccaggio di 2 ore a temperatura ambiente. Un bloccaggio troppo lungo può risultare nella mascheratura di antigeni e perdita di proteina. iii. Sciacquare la membrana due volte con Tampone TBS-T NOTE: Aggiungere il 3% di latte in polvere senza grassi al Tampone TBS-T quando si diluiscono gli anticorpi per ridurre i legami non specifici. Il latte contiene molte proteine che legano la membrana. Pertanto, dopo il trasferimento, le proteine contenute nel latte legano la membrana e riempiono parecchi siti non specifici. Dopo di ciò, quando si incuba con l anticorpo, esso lega l antigene ed ha meno possibilità di formare legami non specifici. Se lavorate con anticorpi anti-fosfoproteine o biotinilati, l aggiunta di latte non è opportuna. Al suo posto utilizzate albumina di siero bovina (BSA) al 5%. WESTAR EtaC Page 9
8. Incubazione con gli anticorpi i. Diluire l anticorpo primario in Tampone TBS fresco alla diluizione suggerita per l anticorpo primario (vedi tabella seguente). ii. Incubare la membrana con la proteina sul lato superiore con la soluzione di anticorpo primario da 1 a 2 ore a temperatura ambiente. Per aumentare la sensibilità, provate un incubazione per una notte at 4 C agitando con uno scuotitore. Assicurarsi che la membrana sia ricoperta completamente con Tampone TBS contenente l anticorpo primario. iii. Lavare la membrana con la proteina sul lato superiore 4 volte per 3-5 minuti ogni volta con Tampone TBS-T sotto agitazione delicata con un agitatore. Dopo ciascun lavaggio collocate la membrana su di un nuovo vassoio contenente Tampone TBS-T fresco. iv. Diluire l anticorpo secondario con Tampone TBS fresco alla diluizione suggerita per l anticorpo secondario (vedi tabella seguente). v. Incubare la membrana con la proteina sul lato superiore con la soluzione di anticorpo secondario da 30 min ad 1 ora a temperatura ambiente. Un aumento del tempo di incubazione dell anticorpo produce solitamente un fondo più alto. vi. Lavare la membrana con la proteina sul lato superiore 4 volte per 3-5 minuti ogni volta con Tampone TBS-T sotto agitazione delicata con un agitatore. Dopo ciascun lavaggio collocate la membrana su di un nuovo vassoio pulito contenente tampone TBS-T fresco. IMPORTANTE: Diluizioni ottimali di anticorpo possono variare a seconda delle applicazioni e dipendono dalla qualità e dall affinità della proteina. E fondamentale ottimizzare le diluzioni sia dell anticorpo primario che di quello secondario per ottenere i migliori risultati con segnale elevato e fondo basso. Le diluizioni ottimali di anticorpo possono essere determinate con una saggio Dot-Blot. Diluizioni di anticorpo suggerite per WESTAR EtaC Anticorpo Primario da 1:1000 a 1:15000 Anticorpo Secondario da 1:25000 a 1:150000 Page 10 WESTAR EtaC
9. Rivelazione chemiluminescente i. Per risultati riproducibili lasciare equilibrare le soluzioni di rivelazione a temperatura ambiente prima dell uso. ii. Preparare la soluzione di lavoro mescolando ciascun reagente nel rapporto 1:1. Per risultati ottimali, preparare la soluzione di lavoro immediatamente prima dell uso. Non contaminare le soluzioni usandogli stessi puntali. iii. Rimuovere la membrana dal suo vassoio con Tampone TBS-T e lasciate scolare l eccesso di tampone da un angolo. Non lasciate seccare la membrana. iv. Usare 0,1 ml di soluzione di lavoro per cm 2 di membrana. v. Pipettare il volume necessario direttamente sulla membrana con la proteina sul lato superiore e incubare per 1 min assicurandosi che tutta la superficie sia ricoperta. vi. Acquisire il segnale con film per audioradiografia o un dispositivo per l acquisizione di immagini. Se l intensità del segnale è sconosciuta, provare inizialmente un esposizione di 15 s, 30 s, 1 min and 5 min. Film per autoradiografia o dispositivi per l acquisizione di immagine? Attualmente, il Western Blot è utilizzato per la quantificazione assoluta (in combinazione con una curva di calibrazione della proteina ricombinante di concentrazione nota), oppure per la quantificazione di campioni rispetto ad un campione di riferimento. Grazie allo sviluppo di nuove tecnologie, la maggior parte dei dispositivi per l acquisizione di immagini offrono un ampio intervallo dinamico (3 5 ordini di grandezza) e generano immagini di alta qualità. In contrasto, il film copre un intervallo lineare dinamico limitato (1,5 ordini di grandezza). Ciò significa che è possibile quantificare sia i segnali intensi che quelli deboli sullo stesso blot con risultati affidabili. Al contrario, con il film i segnali intensi vanno in saturazione, risultando in quantificazioni erronee. WESTAR EtaC Page 11
10. Risoluzione dei problemi Membrana con fondo elevato Concentrazioni troppo elevate di anticorpo. Diluite ulteriormente gli anticorpi primari e secondari. Seguite le diluizioni suggerite. Bloccaggio inefficiente. Aumentate la concentrazione di Tween-20 nel Tampone TBS-T (0,1% 0,5% v/v). Usate se possibile latte in polvere senza grassi al 5% come bloccante. Lavaggio Insufficiente. Aumentate il volume, la durata, ed il numero di lavaggi. Utilizzate sempre volumi sufficienti a mantenere la membrana immersa. L anticorpo primario non è specifico per la proteina di interesse. Utilizzate anticorpi monospecifici oppure anticorpi purificati per cromatografia di affinità con l antigene. Incubate sempre l anticorpo primario a 4 C per una notte e non a temperatura ambiente. Riducete il NaCl nel Tampone TBS-T (100mM 350mM). Anticorpo secondario con legame non specifico. Confermate che l anticorpo secondario sia specifico omettendo il primario e facendo correre un blot solamente con il secondario. Se si sviluppano delle bande, scegliete un anticorpo secondario alternativo. Agente bloccante incompatibile. Il latte in polvere senza grassi contiene biotina endogena ed è incompatibile con i sistemi avidina/streptavidina. Sostituite con albumina di siero bovino (BSA) al 5%. Anticorpi di scarsa qualità. La qualità e l età degli anticorpi primari e secondari può provocare problemi di fondo elevato. Trattamento inadeguato di membrana. Assicuratevi di maneggiare la membrana solo con pinzette di plastica pulite e guanti senza polvere. Soluzioni tampone contaminate. Controllate i tamponi per la presenza di particolato o contaminanti batterici. Sostituite i vecchi tamponi. Macchie nere irregolari Bolle d aria intrappolate nella membrana. Rimuovete le bolle d aria facendo rotolare delicatamente sulla membrana una pipetta od una provetta durante l assemblaggio del sandwich. Membrana idratata in modo non uniforme. Assicuratevi che la membrana sia completamente immersa durante i lavaggi e le incubazioni con gli anticorpi. Attrezzature contaminate. Proteine o pezzi di gel rimanenti sull unità possono attaccarsi alla membrana. Gli anticorpi possono essere intrappolati nel gel, e poi lavati male, con conseguente produzione di segnale intenso localizzato. Aggregazione dell agente bloccante. Se l agente bloccante è in polvere agitate per una notte a 4 C per assicurarsi una soluzione completa. Interazione della membrana con il vassoio portacampione. Utilizzate sempre vassoi di plastica puliti per evitare qualsiasi tipo di reazione incrociata. Formazione di aggregati nel coniugato con HRP. Filtrate la soluzione di anticorpo secondario attraverso un filtro da 0.2 μm Utilizzate anticorpo fresco. Page 12 WESTAR EtaC
Nessuna banda o bande deboli Segnale eccessivo. L enzima nel sistema ha esaurito il substrato e provocato la rapida scomparsa del segnale. Diluite ulteriormente l anticorpo secondario. Trasferimento inefficiente. Assicurarsi che ci sia un buon contatto tra la membrana e il gel durante l assemblaggio del sandwich. Proteine di elevato peso molecolare possono richiedere più tempo per il trasferimento. Ridurre il voltaggio o il tempo di trasferimento per proteine con basso peso molecolare (< 10 kda). Gli anticorpi possono aver perso attività. Eseguite un Dot Blot. Seguite le modalità di stoccaggio raccomandate dal produttore ed evitate cicli di congelamento/scongelamento. Anticorpi secondari erroneamente utilizzati. Confermare il tipo di ospite/ig dell anticorpo primario. Bassa affinità proteina-anticorpo. Ridurre il numero dei lavaggi al minimo. Ridurre il NaCl in Tampone TBS-T (100mM 350mM). Il latte in polvere senza grassi può mascherare alcuni antigeni. Diminuite il tempo di bloccaggio. Diminuite la percentuale del latte nel tampone di bloccaggio o sostituite con Tampone di Bloccaggio al 5% di BSA. Contaminazione da sodio azide. Assicuratevi che i tamponi non contengano sodio azide, dato che essa spegne il segnale dell HRP. Soluzioni stock contaminate. Non contaminate le soluzione stock di substrato utilizzando lo stesso puntale. Utilizzate reagenti freschi. Bande non specifiche Aggregazione dell analita. Aumentate la quantità di agente riducente per assicurare la riduzione completa dei legami disolfuro. Interferenza dell SDS. La presenza di SDS può risultare nello sviluppo di bande non specifiche causate da anticorpi che si legano alle molecole cariche di SDS associate alle proteine. Lavate a fondo con acqua la membrana dopo il trasferimento. Concentrazione elevata di proteina. Un effetto osservato comunemente è la diffusione delle bande di proteina. Riducete la quantità di proteina caricata inizialmente. L anticorpo primario non è specifico per la proteina di interesse. Utilizzate anticorpi monospecifici o purificati per cromatografia di affinità con l antigene. Incubate sempre il vostro anticorpo primario a 4 C per una notte e non a temperatura ambiente. Riducete il NaCl nel Tampone TBS-T (100mM 350mM). Legame nonspecifico dell anticorpo secondario. Confermate che l anticorpo secondario sia specifico omettendo l anticorpo primario e facendo correre un blot solo con il secondario, Se si sviluppa una banda, scegliete un anticorpo secondario alternativo. WESTAR EtaC Page 13
Bande Bianche o bande fantasma Segnale eccessivo. Una quantità eccessiva di anticorpi o di proteine caricate possono provocare livelli elevate di segnale localizzato. Ciò risulta nel rapido consumo del substrato in questa zona. Siccome non c è produzione di luce dopo il termine di questa reazione, ciò determina la formazione di bande bianche. Prima di tutto, provate a diluire ulteriormente l anticorpo secondario. Bande irregolari o frastagliate Corsa non uniforme del gel. Caricate tutti i pozzetti disponibili. I pozzetti vuoti possono essere caricati con lo stesso tampone del campione. Il voltaggio o la corrente erano troppo elevate durante l elettroforesi. Riducete il voltaggio o la corrente durante l elettroforesi. Salinità eccessiva. Riducete la concentrazione di NaCl nel Tampone TBS-T (100mM 350mM). Page 14 WESTAR EtaC
11. Informazioni per l ordine Descrizione prodotto Quantità Sufficiente per Ordine-No WESTAR ECL-SUN WESTAR Nova 2011 WESTAR EtaC WESTAR EtaC Ultra WESTAR Supernova WESTAR Starter Kit 50mL kit 500 cm 2 di membrana XLS063,0050 250mL kit 2500 cm 2 di membrana XLS063,0250 500mL kit 5000 cm 2 di membrana XLS063,0500 50mL kit 500 cm 2 di membrana XLS10,0050 100mL kit 1000 cm 2 di membrana XLS10,0100 250mL kit 2500 cm 2 di membrana XLS10,0250 500mL kit 5000 cm 2 of membrana XLS10,0500 50mL kit 500 cm 2 di membrana XLS100,0050 100mL kit 1000 cm 2 di membrana XLS100,0250 500mL kit 5000 cm 2 di membrana XLS100,0500 20mL kit 200 cm 2 di membrana XLS4,0020 100mL kit 1000 cm 2 di membrana XLS4,0100 200mL kit 2000 cm 2 di membrana XLS4,0200 20mL kit 200 cm 2 di membrana XLS3,0020 100mL kit 1000 cm 2 di membrana XLS3,0100 200mL kit 2000 cm 2 di membrana XLS3,0200 WESTAR ECL-SUN - 50mL kit WESTAR Nova 2011-50mL kit WESTAR EtaC - 50mL kit WESTAR EtaC Ultra - 20mL kit WESTAR Supernova - 20mL kit XLS025,0000 Per ulteriori informazioni, MSDS o per scaricare istruzioni per l uso del prodotto, visitate il sito www.cyanagen.com Per ordinare, Tel.: +39 051.534063 e-mail sales@cyanagen.com WESTAR EtaC Page 15
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