REGIONE PIEMONTE Torino, 16 Settembre 2011 Innovazioni metodologiche e tecnologiche per accertare l esposizione cronica e acuta a farmaci, alcol e droghe Marco Vincenti Sostanze Stupefacenti Codice della strada: DL 285 del 30.04.92 Art. 187 DL 117 del 03.08.07 Art. 5 6 Abuso e trattamento: L 685 del 22.12.1975 L 162 del 26.06.1990 DPR 309 del 09.10.1990 Mondo del lavoro: S/R Parere del 13.11.2003 S/R Provv. del 30.10.2007 S/R Provv. del 18.09.2008 DL 81 del 09.04.2008 Abuso Alcolico Codice della strada: DL 285 del 30.04.92 Art. 186 L 125 del 30.03.2001 Art. 6 DL 117 del 03.08.07 Art. 5 6 Abuso e trattamento: L 125 del 30.03.2001 Art. 6 Mondo del lavoro: DPR 19.03.1956 L 125 del 30.03.2001 Art. 6 S/R Parere del 13.11.2003 S/R Provv. del 16.03.2006 DL 81 del 09.04.2008 1
Analisi chimica di campioni biologici Identificazione - Accertamento di positività Violazione di Legge Sanzione Accertamento Diagnostico vs. Test Tossicologico Analisi Chimico-Cliniche Test Tossicologico Matrice La matrice più adatta Urina - Sangue - Saliva - Capelli Finalità dell analisi Certificato/ Rapporto di analisi Casi dubbi Test diagnostici Identificazione e quantificazione di markers Profili multiparametrici di funzionalità Trattati come positivi - approfondimento Evidenza di prova Identificazione e quantificazione di specifiche sostanze Trattati come negativi fino a riscontro contrario: analisi di conferma? 2
Quali violazioni della libertà individuale? Principi inderogabili Principi derogabili solo in circostanze eccezionali (perquisizioni, intercettazioni, limitazioni) Principi derogabili per giusta causa (autisti, carrellisti: vantaggi superano svantaggi) efficienza come necessità limitazioni di libertà e privacy accettabili Principi derogabili su base routinaria (automobilisti: etilometro, campioni di saliva) ACCERTAMENTI SU STRADA Abuso alcolico: Etilometro Eventuale conferma: Alcolemia con GC-FID o GC-MS 3
ETANOLEMIA PER GC-MS SPAZIO DI TESTA Etanolo nel sangue 4
Che succede dopo? Le 3 S! - Sanzioni pecuniarie - Sequestro del veicolo - Sospensione della patente - Sospensione dalla mansione Come si ritorna in possesso della patente di guida o si ritorna idonei alla mansione? PANNELLO AST GOT (aspartate Generalmente aminotransferase) variano con ALT GPT (alanine transaminase) l abuso di alcol γ GT (γ-glutamyl transpeptidase) ALP (alkaline phosphatase) MA MCV (mean red-cell sono volume) influenzati Trigliceridi da molti fattori indipendenti dal Colesterolo consumo di alcol CDT (carbohydrate deficient transferrin) ETG (ethyl glucuronide in hair) ETG (ethyl glucuronide in hair) INADEGUATI RISPETTO A SENSIBILITÀ, SPECIFICITÀ, VALORE PREDITTIVO 5
I BIO-MARCATORI DI NUOVA GENERAZIONE Etil Glucuronato (ETG) Etil Solfato (ETS) PRODOTTI DEL METABOLISMO NON OSSIDATIVO DELL ETANOLO sono metaboliti diretti dell alcol elevata SENSIBILITÀ SPECIFICITÀ VALORE PREDITTIVO CARATTERISTICHE relativamente stabile non volatile solubile in acqua lunga emivita presente in tutti i fluidi e tessuti biologici ETG OTTIME QUALITÀ DIAGNOSTICHE sensibilità specificità FINESTRA DI RIVELABILITÀ sangue : 10 20 ore urina: fino ad 80 ore capello: alcuni mesi DETERMINAZIONE NELLE 3 MATRICI SANGUE, URINA, CAPELLO: valutazione della storia dell esposizione all etanolo chiusura del gap tra marcatori a breve e a lungo termine 6
SVILUPPO DEL METODO HPLC MS/MS (ETG ED ETS) CAPELLO: 1 decontaminazione 2 estrazione 3 incubazione 4 STANDARD INTERNO ETG-D5 500 ppb concentrazione Triplo quadrupolo SISTEMA HPLC MS/MS ESI Colonna C18 ANALISI DEL CAPELLO 7
EtG nel capello CAD + ASL TO4 + ASL TO2 Studio sperimentale su 175 soggetti 8
PCA 6 VARIABILI 175 PAZIENTI La concentrazione dell ETG nel capello può essere usata come marcatore di conferma per stabilire l assunzione cronica di alcol? E la CDT? 9
PCA 5 VARIABILI (Senza ETG) Che si osserva? SOSTANZE STUPEFACENTI sempre nuove sfide Nuove sostanze Molteplici analiti Eliminazione metabolica Contesti differenti 10
SOSTANZE STUPEFACENTI sempre nuove sfide Nuove sostanze Molteplici analiti Eliminazione metabolica Contesti differenti CANNABINOIDI SINTETICI THC JWH-018 O N JWH-122 CH 3 CBD JWH-073 O O N JWH-250 CH 3 CBN CP 47,497 CP 47,497 C8 HU-210 Quale sarà la prossima generazione? 11
analytical chemistry Quantitative Measurement of JWH-018 and JWH-073 Metabolites Excreted in Human Urine Cindy L. Moran, Vi-Huyen Le, Krishna C. Chimalakonda, Amy L. Smedley, Felisia D. Lackey, Suzanne N. Owen, Paul D. Kennedy, Gregory W. Endres, Fred L. Ciske, James B. Kramer, Andrei M. Kornilov, L. D. Bratton, Paul J. Dobrowolski, William D. Wessinger, W. E. Fantegrossi, Paul L. Prather, Laura P. James,,^ Anna Radominska-Pandya,X and Jeffery H. Moran*,, PRIMA OSSERVAZIONE: ALLE SFIDE NON CI SI PUO PRESENTARE DISARMATI 12
Le procedure di controllo negli anni 90 e 2000 Screening Metodi Immunoenzimatici Un metodo per ogni classe di sostanze VINCOLI Conferma Metodi cromatografici e spettrometrici di massa Identificazione e quantificazione di una specifica sostanza all interno della classe INFORMAZIONE APPROSSIMATIVA APPROCCIO TRADIZIONALE (due fasi) GC-MS HPLC-MS/MS (tradizionali) Screening Conferma Nuovi Metodi Multiresiduo LC-MS/MS 13
LIMITI dei metodi multiresiduo con strumenti non aggornati Elettronica di controllo degli MS lenta Tempi di analisi troppo lunghi Sensibilità e/o risoluzione MS insufficienti Separazione cromatografica inefficiente UPLC O UHPLC NUOVI TRIPLI QUADRUPOLI O NUOVI SPETTROMETRI PER ALTA RISOLUZIONE Diminuzione del diametro delle particelle della fase stazionaria HPLC minore volume morto maggiore attrito Minore tempo di transito Minore diffusione Minore resistenza al trasferimento di massa perdita di carico MAGGIORE RISOLUZIONE MAGGIORE SENSIBILITA 14
UPLC o UHPLC 15
BREVE TEMPO DI ANALISI - MAGGIORE SENSIBILITA AMPIEZZA DEI PICCHI: 3-5 SECONDI. PROBLEMI? SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA DI MISCELE COMPLESSE UPLC: ora disponibile da diversi produttori MS: fast-srm - strumenti QqQ & TOF CONSEGUENZE: Screening Multi-Residuo & Analisi di Conferma Alta produttività analitica Rapida validazione metodi Aumentato n di controlli A confirmatory method for the simultaneous extraction, separation, identification and quantification of Tetracycline, Sulphonamide, Trimethoprim and Dapsone residues in muscle by UPLC-MS/MS according to Commission Decision 2002/657/EC M. McDonald, C. Mannion, P. Rafter J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 8110-8116. 16
Full Scan MS in Comprehensive Qualitative and Quantitative Residue Analysis in Food and Feed Matrices: How Much Resolving Power is Required? M. Kellmann, H. Muenster, P. Zomer, H. Molb J. Am. Soc. Mass Spectrom., 20 (2009) 1464 Next figure: Extracted ion chromatograms of 151 compounds in animal feed matrix at a concentration of 50 ppb (resolving power: 100,000) CANNABINOIDI SINTETICI THC JWH-018 O N JWH-122 CH 3 CBD JWH-073 O O N JWH-250 CH 3 CBN CP 47,497 CP 47,497 C8 HU-210 LA NOSTRA PRIMA RISPOSTA 17
CANNABINOIDI SINTETICI LA NOSTRA PRIMA RISPOSTA La strategia: ANALISI MULTI-RESIDUALE Lo strumento: UHPLC-MS/MS La matrice: CAPELLO La coorte: POSITIVI ALLA CANNABIS L approccio: VALIDAZIONE DEL METODO RISULTATI: 15 POSITIVI SU 93 ACCERTAMENTI SU STRADA Sostanze Stupefacenti:??? Prelievo campioni biologici: Urina: dove? dimostra? Sangue: dove? consenso? 18
EFFICACIA: CONTROLLI PIU MIRATI PER ALCOL E DROGHE D ABUSO - Per periodo di latenza e persistenza dall assunzione minuti fino a poche ore (sangue, saliva) ore fino a pochi giorni (urina) molti giorni - mesi (capelli e peli) - Per luogo di campionamento in struttura sanitaria (sangue, urina) in strada (saliva, sudore) Il fluido orale L acqua è il componente principale È un ultra-filtrato del plasma Le sostanze psicoattive passano dal sangue alla saliva per diffusione passiva La finestra temporale si estende da pochi min a 24 ore dall assunzione 19
Vantaggi Svantaggi La positività dimostra un assunzione recente di sostanze psicoattive Correlazione con concentrazioni plasmatiche e con lo stato di alterazione psico-fisico Prelievo a vista non invasivo Prelievo effettuabile anche dagli agenti di Polizia stradale Raccolta di piccoli volumi di campione Bassi valori di cut-off Instabilità della matrice Inaccuratezza nella valutazione volumetrica Contaminazione del cavo orale (fumo passivo, ecc.) Procedura sperimentale Accertamento sanitario CAMPER (C.R.I.) anziché il Pronto Soccorso di A.O. 20
I fase effettuata dagli Agenti di Polizia Identificazione personale e controllo dei documenti di guida Effettuazione della prova con l etilometro Prelievo di fluido orale e analisi tossicologica di screening con test on-site In caso di positività il soggetto controllato si trasferisce nel camper. Consenso/rifiuto a procedere agli accertamenti II fase Valutazione anamnestico-clinica Raccolta dei campioni biologici da sottoporre alle analisi di conferma 21
Sigillatura dei contenitori che raccolgono i fluidi biologici I sigilli evidenziano qualunque tentativo di violazione Compilazione della catena di custodia 22
III fase: Analisi di conferma SALIVA_TMS_SIM SALIVA_AMPS_SIM Morfina Codeina Eroina 6-MAM 9 -THC Cocaina Amfetamina Metamfetamina MDA MDMA MDEA MBDB Ketamina Metadone Cromatogramma 23
Come si ritorna in possesso della patente di guida? DETERMINAZIONE DI ABUSO CRONICO DI SOSTANZE STUPEFACENTI TUTTE LE SOSTANZE STUPEFACENTI POSSONO ESSERE RICERCATE NEL CAPELLO ANALISI SEGMENTARIA Sostanze ricercate comunemente nei capelli PANNELLO BASE: cannabinoidi, oppiacei, cocaina, metadone, amfetamine NUOVE DETERMINAZIONI: cannabinoidi sintetici benzodiazepine, ketamina, buprenorfina, altri farmaci 24
Applicazioni più comuni Morti correlate all uso dei farmaci e/o sostanze d abuso (overdose, concausa di decesso) Valutazione di inidoneità alla guida Affidamento, custodia minori Esposizione prenatale a farmaci e sostanze d abuso CAMPIONE REALE XIC of +MRM (46 pairs): 286.300/165.200 amu MORFINA from Sample 50 0.92 5355 4000 0.70 200 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of +MRM (46 pairs): 300.300/165.000 amu CODEINA from Sample 50. 6671 5000 1.47 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of +MRM (46 pairs): 328.300/165.200 amu 6-MAM from Sample 50 4.8e4 4.0e4 2.0e4 1.69 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of +MRM (46 pairs): 290.200/168.100 amu BENZOILECGONINA from Sample 50. 2.06 2.8e5 2.0e5 1.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of +MRM (46 pairs): 304.200/182.300 amu COCAINA from Sample 50 1.9e6 2.53 1.5e6 1.0e6 5.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of +MRM (46 pairs): 310.300/265.300 amu METADONE from Sample 50 3.59 1.8e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min. 25
Reati di violenza sessuale Legislazione in Italia L articolo 609-bis punisce la violenza sessuale con la reclusione da 5 a 10 anni. Pene aggiuntive per: L utilizzo di armi, sostanze alcoliche, narcotiche o stupefacenti Violenza su persone con limitazione della libertà personale Da persona travisata o che simuli la qualità di pubblico ufficiale o incaricato di pubblico servizio Violenza su minori di 14 anni RAPE DRUGS Effetti delle droghe da stupro: Sonnolenza e diminuzione dell attenzione Sedazione Sottomissione e annullamento della volontà Amnesia anterograda Altre caratteristiche: Facilmente reperibili Facilmente somministrabili 26
Assunzione singola Droghe da stupro : benzodiazepine, ipnotici, sedativi, ketamina e GHB L importanza dell analisi segmentale Sono state prese in esame 22 differenti BENZODIAZEPINE ZOLPIDEM Struttura base delle benzodiazepine 27
Nitrazepam-D5 (STD interno) Totale campioni analizzati 26 Clonazepam (urina) Bromazepam (capelli) Delorazepam (capelli) Bromazepam (sangue) Positività 4 28
Case report Lunghezza: 16 cm 0-6 cm: 6 segmenti di 1 cm (A F) 6-16 cm: 5 segmenti di 2 cm (G M) Lunghezza: 27 cm 0-10 cm: 1 segmento di 10 cm (A) 10-20 cm: 11 segmenti di 1 cm (B M) 20-27 cm: 1 segmento di 7 cm (N) Lunghezza: 18 cm 0-18 cm: 9 segmenti di 2 cm (A I) Lunghezza: 5 cm 0-5 cm: 2 segmenti di 2.5 cm (A B) Risultati Segmento A B Finestra diagnostica (Crescita stimata dei capelli: 1 cm/mese) Ottobre 2009-Novembre 2009 Settembre 2009-Ottobre 2009 Lunghezza (cm) 1 1 Risultato (pg/mg) 9 -THC (24) 9 -THC (24) C Agosto 2009-Setttembre 2009 1 Zolpidem (2.8 ) 9 -THC (50) D Luglio 2009-Agosto 2009 1 9 -THC (56) E Giugno 2009-Luglio 2009 1 9 -THC (47) F Maggio 2009-Giugno 2009 1 Zolpidem (1.6) G H I Marzo 2009-Maggio 2009 Gennaio 2009-Marzo 2009 Novembre 2008-Gennaio 2009 2 2 2 Zolpidem (0.9) 9 -THC (166) L Seytembre 2008-Novembre 2008 2 M Luglio 2008-Settembre 2008 2 29
Analisi segmentale A B C D E F G H I L M cm 1 2 3 4 5 6 8 10 12 14 16 ZOLPIDEM 2.8 pg/mg ZOLPIDEM 1.6 pg/mg ZOLPIDEM 0.9 pg/mg Nov 2009 Oct 2009 Sep 2009 Aug 2009 Jul 2009 Jun 2009 May Mar 2009 THC 2009 24-166 pg/mg Jan 2009 Nov 2008 Sep 2008 Jul 2008 A Nov 2009 B C D E F G H I L M N O cm 10 20 27 Negative A B C D E F G H I cm 2 4 6 8 10 12 14 16 1 8 Nov 2009 ZOLPIDEM 250-511 pg/mg ZOLPIDEM ALPRAZOLAM ZOLPIDEM ALPRAZOLAM FLURAZEPAM ZOLPIDEM ALPRAZOLAM FLURAZEPAM BROMAZEPAM Aug 2007 May 2008 Uso terapeutico pg/mg May-08 Jul-08 Sep-08 Nov-08 Jan-09 Mar-09 May-09 Jul-09 Sep-09 Nov-09 *Extimated average hair growth: 1 cm/month A B C D E F G H I cm 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nov 200 9 ZOLPIDEM 250-511 pg/mg ZOLPIDEM ALPRAZOLA M ZOLPIDEM ALPRAZOLA M FLURAZEPA M ZOLPIDEM ALPRAZOLAM FLURAZEPAM BROMAZEPA M May 200 8 30
Uso occasionale A B C D E F G H I L cm 1 2 3 4 5 6 8 10 12 14 16 ZOLPIDE M 2.8 pg/mg ZOLPIDE M 1.6 pg/mg ZOLPIDE M 0.9 pg/mg M Nov 200 9 Oct 200 9 Sep 200 9 Aug 200 9 Jul 200 9 Jun 200 9 May 200 9 Mar 200 9 Jan 200 9 Nov 200 8 Sep 200 8 Jul 200 8 Singola esposizione a Zolpidem in almeno due occasioni: Mar-Giu 2009 e Ago-Set 2009 Questioni interpretative Concentrazioni delle sostanze trovate Ricerca di metaboliti per escludere interferenti o contaminazioni esterne Contaminazioni interne 31
Deterioramento del capello Deterioramento del capello 32
ANALISI TOSSICOLOGICHE POST-MORTEM Aloperidolo Amitriptilina Citalopram Clomipramina Clorpromazina Clotiapina Clozapina Flufenazina Fluoxetina Fluvoxamina Levomepromazina Mirtazapina Olanzapina Paroxetina Perfenazina Periciazina Pipamperone Promazina Prometazina Quetiapina Reboxetina Risperidone Sertralina Tiapride Tioridazina Tramadolo Trazodone Venlafaxina Neurolettico Neurolettico Antidepressivo Antidepressivo Neurolettico Antidepressivo Antidepressivo Range plasmatici terapeutici (ng/ml) Aloperidolo Clomipramina Flufenazina Mirtazapina Perfenazina Trazodone 1-33 175-400 0,5-2 20-200 0,6-25 650-1500 Approccio generico applicato a sangue cadaverico HPLC-MS/MS { Aloperidolo, Flufenazina, Fluoxetina, Fluvoxamina, Paroxetina, Perfenazina, Periciazina, Pipamperone, Quetiapina, Risperidone, Trazodone GC-MS { Amitriptilina, Citalopram, Clomipramina, Clorpromazina, Clotiapina, Clozapina, Levomepromazina, Mirtazapina, Olanzapina, Promazina, Prometazina, Reboxetina, Sertralina, Tiapride, Tioridazina, Tramadolo, Venlafaxina 33
Metodo HPLC-MS/MS ANALISI IN MODALITÀ SRM FLUVOXAMINA m/z 319,2 71,1 Tempo di ritenzione Ione precursore Ioni prodotto 12,82 min. m/z 319,2 m/z 71,1 87,0 200,2 m/z 319,2 87,0 m/z 319,2 200,2 Metodo HPLC-MS/MS Linearità risposta strumentale (1-100 ng/ml) Linearità matrice ematica (1-100 ng/ml) (no quetiapina e trazodone) R 2 > 0,98 - Deviazione standard e CV % - Accuratezza - LOD = 1 ng/ml - LOQ = 5 ng/ml } Rilevabilità a concentrazioni terapeutiche 34
CASO REALE Sesso femminile, situazione sociale disagiata Problemi psichiatrici Terapia con olanzapina (neurolettico), paroxetina (antidepressivo), alprazolam (benzodiazepina) e ramipril (antipertensivo) Rinvenuta cadavere nel bagno di casa Stato cadavere: avanzata putrefazione Esame autoptico: morte traumatica M-L: escludibili concausalità? Indagini generiche protocollari ematiche Olanzapina e metaboliti (metodo GC-MS) Paroxetina (metodo HPLC-MS/MS) m/z 242,4 m/z 331,2 193,3 m/z 331,2 70,0 Conferma: Olanzapina sangue: 96 ng/ml Metaboliti di olanzapina sangue: positivo Paroxetina sangue: 53 ng/ml VALORI EMATICI NELL INTERVALLO TERAPEUTICO 35
GRAZIE! 36